改良型聚乙二醇化重组人干扰素α2b的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药领域，涉及新型改良型长效干扰素的获得。包括非天然氨基 酸介导的不同单PEG修饰产物，特定位点不同分子量的PEG修饰，以及多位点定点PEG的修 饰产物。
【背景技术】
[0002] (1)干扰素
[0003] 干扰素是细胞在诱生剂作用的条件下产生的一种蛋白质，具有抑制病毒复制，抑 制细胞分裂，及免疫调节等功能。人干扰素a 2b分子量约为19kD，由165个氨基酸组成， 其序列如SEQ ID N0:1所示：
[0004] CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIP VLHEMIQQIFNLFS TKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKE DSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVR AEIMRSFSLSTNLQESLRSKE (SEQ ID N0:1)
[0005] 根据文献报道，对个别密码子进行优化，以提高其在大肠杆菌中的表达量，所用编 码人干扰素a 2b的编码序列如SEQ ID N0 :2所示：
[0006] TGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCCGCCGCACCTTGATGCTCCTG GCACAGATGCGCCG CATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACCGCCATGACTTTGGATT TCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAA AAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATG AGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTG CTGCTTGGGAT GAGACCCTCCTAGACAAATTCTACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGC CTGTG TGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTC TGGCTGTGAGGAAATACTTCCA AAGAATCACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGC CCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGA TCTTTTTCTTTGTCAACAAA CTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAA (SEQ ID NO ：2)
[0007] 干扰素是商品化较早的生物制品，自从1986年美国FDA批准Roch公司的干扰素 a 2a及Schering公司的干扰素a 2b上市，目前干扰素已经成为世界上基因工程药物的重 要成员。干扰素在我国也是第一个投放市场的基因药物，已经获得了广泛的使用。其在我 国慢性乙型肝炎等治疗方面取得的重要效益和经济利益，将使干扰素成为未来抗病毒，抗 癌症最广泛应用的药物之一。
[0008] 作为基因药物，干扰素半衰期短而治疗周期长，需要患者频繁的注射给药，大大降 低了患者的依从性以及干扰素的应用价值。因此，改善干扰素药代动力学的研究正在世界 范围内广泛进行。
[0009] (2)聚乙二醇修饰
[0010] 共价交联聚乙二醇是增加生物分子水溶性，调节免疫原性，延长其半衰期的常用 方法。利用聚乙二醇修饰干扰素，延长其半衰期，改善其生物学特性，已经是得到应用的成 功技术。此前已经有美国先灵葆雅公司生产的佩乐能，及罗氏公司生产的派罗欣作为PEG 化干扰素通过FDA认证进入了医药市场。
[0011] 上市的PEG化干扰素虽然一定程度上解决了半衰期短的问题，但是非定点修饰的 方法也带来了保留活性低和质量控制困难的新问题。简单来说，非定点修饰的方法可以和 干扰素上多个位点发生反应，产生多聚体和同分异构体。而多PEG化及单PEG同分异构体 的产生，又对工业生产的后期处理带来高成本的影响，其结果是不仅严重降低了干扰素的 保留活性，也不利于大规模生产制备，质量控制困难。市场上需要有高保留活性的、长效的， 容易对其质量进行控制的PEG化干扰素产品。
[0012] (3)遗传密码扩展技术
[0013] 近年来遗传密码扩展技术发展迅速，利用琥珀终止密码子（TAG)为有义编码子，通 过引入相应的正交tRNA及氨酰tRNA合成酶，最终可以将设计好的非天然氨基酸引入蛋白 质中。到目前为止，这一技术已经将几十种非天然氨基酸成功地定点表达在活细胞的蛋白 质当中，涉及的非天然氨基酸含有炔基，叠氮等，利用这些生物体中本来不存在的特殊基 团，就可以特异性的对蛋白质进行定点修饰。
【发明内容】
[0014] 发明人经过对现有技术的思考，将非天然氨基酸技术应用到干扰素药物的修饰 上，通过在不同位点引入含有叠氮基团修饰把手的非天然氨基酸，进而对干扰素实现了任 意位点的定点修饰。通过活性筛选及性质测定，得到了若干性质优良的PEG化干扰素产品。 随后发明人进一步应用非天然氨基酸的修饰方法，对干扰素进行了多点的定点修饰，得到 了不错性质的双点修饰PEG的干扰素产品。
[0015] 相比于上市的PEG化干扰素产品，本发明得到的改良型PEG化干扰素产品的主要 优势体现在以下几点：
[0016] 1.修饰均匀，质量均一化，质量容易控制的PEG化干扰素
[0017] 2.保留活性更高，药代动力学性质优良的干扰素产品
[0018] 具体的，在本发明的一个具体的实施方案中，提供了不同位点引入含有叠氮 基团非天然氨基酸的人干扰素，主要通过三个步骤：（1)选择可能合适的干扰素突 变位点，（2)构建含有在选定的具有TAG突变的编码人干扰素基因的载体，（3)获得
【主权项】
1. 特定位点定点突变的人干扰素，其至少1个位点上的氨基酸被突变为非天然氨基 酸，所述非天然氨基酸为：
〒不的Lys-azido。
2. 如权利要求1所述的定点突变人干扰素，其与突变前的干扰素的氨基酸序列的区别 在于：氨基酸序列的第N位的氨基酸被突变为Lys-azido,突变氨基酸在干扰素中的连接方 式，如下式所示：
其中，由R1到R2的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，R1为干扰素的第1至 第N-1位氨基酸残基； R2为干扰素的N+ 1位至C末端的氨基酸残基； R4 ^
3. 如权利要求1或2所述的特定位点突变的人干扰素，其中未经突变的人干扰素序列 如SEQIDNO:1 所示。
4. 如权利要求3所述的特定位点突变的人干扰素，突变位点可为SEQIDNO: 1中任意 位点上一个或多个的氨基酸。
5. 如权利要求3所述的特定位点突变的人干扰素，所述突变位点选自：示于SEQ ID NO :1的序列的第P4位，H7位，S8位，K31位，R33位，H34位，E41位，E51位，A74位，E78 位，G102 位，T106 位，E107 位，L110 位，Mill 位，E113 位，L128 位，K133 位，P137 位，E159 位H34和E107位，或其他对活性影响较小的位点，以及多位点的组合。
6. 如权利要求5所述的特定位点突变的人干扰素，所述突变位点选自：示于SEQID NO:1的序列的A74,H34,E107或其组合。
7. 如权利要求5所述的特定位点突变的人干扰素，序列如SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、 SEQIDN0:5 或SEQIDN0:6 所示。
8. 编码权利要求1-7中任一项的突变的干扰素的核酸分子。
9. 如权利要求8所述的核酸分子，其中突变位点的氨基酸密码子被取代为琥珀密码子 TAG。
10. 核酸载体，其可操作地连接有权利要求8或9的核酸分子。
11. 宿主细胞，其中含有权利要求10的核酸载体。
12. 根据权利要求11的宿主细胞，其中还含有能够表达tRNAPyl/PylRS的质粒。
13. 经PEG修饰的如权利要求1-7中任一项所述的特定位点突变的人干扰素，
其中，R1为突变前的干扰素的第1至第N-1位氨基酸残基， R2为突变的干扰素的第N+ 1位至C末端的氨基酸残基， R3为偶联的PEG分子。
14. 如权利要求13所述的经PEG修饰的人干扰素，其特征在于当取代的氨基酸位点多 于一个时，不同的取代位点偶联的PEG分子量可以是相同的，也可以是不同的。
15. 如权利要求14所述的经PEG修饰的人干扰素，其中不同的取代位点偶联的PEG分 子量是相同的。
16. 经PEG修饰的如权利要求1-7中任一项所述的特定位点突变的人干扰素，其在非天 然氨基酸位置定点引入PEG修饰，PEG的分子量范围为2kD-100kD。
17. 如权利要求16所述的经PEG修饰的特定位点突变的人干扰素，所述PEG的分子量 是 5kD、10kD、20kD或者 40kD。
18. 如权利要求17所述的经PEG修饰的特定位点突变的人干扰素，具体是 H34-5K-IFN、H34-10K-IFN、H34-20K-IFN、H34-40K-IFN、H34&E107-5K或H34&E107-20K、 A74-10K-IFN、E41-10K-IFN、E51-10K-IFN、E107-5K-IFN、E107-10K-IFN、E107-20K-IFN。
19. 如权利要求17或18所述的经PEG修饰的人干扰素，其特征在于当取代的氨基酸位 点多于一个时，不同的取代位点偶联的PEG分子量可以是相同的，也可以是不同的。
20. 如权利要求19所述的经PEG修饰的人干扰素，其中不同的取代位点偶联的PEG分 子量是相同的。
21. 药物组合物，其中含有有效量的权利要求1-7中任一项的干扰素或者权利要求 13-20中任一项所述的经PEG修饰的干扰素，以及药学上可以接受的载体。
22. 权利要求1-7中任一项的干扰素或者权利要求13-20中任一项所述的经PEG修饰 的干扰素的制备方法，所述方法包括使用基因密码子扩展技术将非天然氨基酸定点引入干 扰素蛋白中，借助非天然氨基酸上的特定基团和任选的修饰剂如聚乙二醇与干扰素定点连 接；优选地，在干扰素中引入叠氮基团，再与含有环辛炔的PEG修饰剂进行无铜点击化学定 点偶联PEG，用以制备PEG化干扰素。
23. 权利要求1-7中任一项的干扰素或者权利要求13-20中任一项所述的经PEG修饰 的干扰素在制备用于抗病毒，治疗多种恶性肿瘤，免疫调节的药物中的用途。
【专利摘要】本发明涉及非天然氨基酸标记的目的蛋白或肽，例如，经过定点突变的人干扰素α2b，定点修饰的人干扰素α2b，干扰素可以是不同种属及不同类型的。本发明还涉及定点突变和定点修饰干扰素的制备方法，所述方法包括使用基因密码子扩展技术将非天然氨基酸定点引入干扰素基因中，借助非天然氨基酸和修饰剂如聚乙二醇与干扰素定点连接。本发明进一步涉及定点突变或修饰的干扰素的应用，如作为稳定、长效干扰素等的用途。CGMCC No：743220130408
【IPC分类】C12N15-63, A61P37-02, A61P31-12, A61P35-00, C12N15-20, C07K14-555, A61K38-21
【公开号】CN104693300
【申请号】CN201310654386
【发明人】周德敏, 吴凌, 张博, 陈景贤, 俞飞, 张传领, 司龙龙
【申请人】北京大学
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2013年12月5日
【公告号】WO2015081858A1