专利名称：一种重组人干扰素α2b的发酵后处理工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组人干扰素α 2b的发酵后处理工艺。
背景技术：
干扰素(IFN)是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细 胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀 伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能 力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白)，是一种由单核细胞和淋 巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、 调节免疫功能等多种生物活性。干扰素按制作方法不同，可分为利用基因工程生产的重组 干扰素和人天然干扰素两大类。人天然干扰素分为三种多肽IFN-a、IFN-β及IFN-γ。 IFN-α和IFN-β分别由白细胞和成纤维细胞产生，在酸性环境中稳定，并且结合相同的受 体。而IFN-Y主要由T淋巴细胞分泌，对酸不稳定，结合的受体与前两者不同，IFN-Y的免 疫刺激活性在三者中最强。IFN-β和IFN-γ只由单个基因编码，而IFN-α由至少23个不 同基因，群聚在第9对染色体上，编码产生多于15种的功能蛋白。基因工程干扰素再按基 因表达分子结构和抗原性可分为α、β、Y型，同一型内按氨基酸组成差异再分20多个亚 型α 1、α 2、α 3……在同一亚型内又因氨基酸的差异而细分，如α 2 有三种α 2a、α 2b、 α 2c。人天然干扰素是通过分别刺激淋巴母细胞和人体白细胞，然后提纯制备而得。目前 市场供应的只有由类淋巴母细胞产生的干扰素(IFN)…α Ni，是天然的多亚型的混合物。临 床用的主要是重组制剂，有α 2a、α 2b和α 2c。人干扰素α作为21世纪抗病毒、抗癌症 最为广泛的药物之一，临床应用的需求量越来越高，如何使人干扰素α大规模产业化生产 成为了重要课题。早期人白细胞干扰素α是用生长在组织培养物种的人细胞系表达的或是通 过从血液供体中收集的人白细胞生产的，美国专利US4680261，US5503828, US5391713， US4732683,US4696899,US5789551和欧洲专利ΕΡ0945463详细地阐述了这些方法。这些方 法生产成本高，生产周期长，产量低，存在污染风险，不适合工业化放大生产。20世纪70年代后期，随着基因工程技术的出现及发展，人干扰素α可以通过基 因重组的方式生产，然而目前重组人干扰素α的生产纯化大多用到亲和抗体柱或液相反 相柱，纯化成本高，生产工艺难于工业化放大等缺点；如美国专利US5710027、US5661009U、 US4765903、US5196323、和中国专利 CN100390198C、CN1876811A 等。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种重组人干扰素α 2b的发酵后处理工艺。本发明采 用微滤和超滤替代硫酸铵沉淀和离心，无需大规模采用离心机，减少了设备成本，并降低了 能耗，同时也避免大量使用硫酸铵，降低生产成本，减少环境污染；本工艺采用常规的疏水 及体积排阻层析柱，无需采用反相层析柱和昂贵的单克隆亲和柱，避免有机溶剂的使用和亲和层析柱上脱落的单克隆抗体的污染，提高了产品的临床安全性；本生产工艺稳定简单， 适合大规模生产，生产过程安全可控，生产效率高，显著的降低能耗，无环境污染，有显著的 经济效益，生产产品质量标准符合2010版中国药典标准。为了达成上述目的，本发明的解决方案是一种重组人干扰素α 2b的发酵后处理工艺，从表达人干扰素α 2b的工程菌中提 取重组人干扰素α 2b，包括如下步骤1)重组人干扰素α 2b酵母发酵液中菌体的去除，2) 发酵上清中目的蛋白质的浓缩和缓冲液的替换，3)疏水层析初步纯化，4)体积排阻层析纯 化。所述的步骤1)中，采用微滤技术，选用中空纤维膜管，替换缓冲液为PH值 6. 3士0. 1的20mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)，并添加浓度为0. 5%的Vc，IOmM的EDTA，浓度 为 0. 03% 的 Tween80。所述的微滤采用0. 45um中空纤维膜管。所述的步骤2)中，采用超滤技术，选用中空纤维膜管，替换缓冲液为pH值 6. 5士0. 1的20mM磷酸缓冲液(PBNa)，并添加浓度为0. 5% Vc和0. 05% Tween80。所述的超滤采用5K中空纤维膜管。所述的步骤3)中疏水层析洗脱缓冲液采用缓冲液A和缓冲液B，利用疏水层析 柱进行纯化，疏水填料选用Octyl Sepharose 4FastFlow(GE公司)，缓冲液A为pH值 6. 5 士0. 05的20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，0. 8M(NH4) 2S04，浓度为0. 02%二甲基亚 砜(DMSO)，缓冲液B为pH值6.5士0. 05的20mM HEPES和浓度为0. 02%二甲基亚砜。所述的步骤4)中采用缓冲液C，利用体积排阻交换柱进行体积排阻层析，具体选 用 Superdex 75 (GE 公司)，缓冲液 C 为 pH 值 7. 0 士 0. 1 的 20mM PBNa。本发明的有益效果为(1)微滤和超滤中使用了行之有效的稳定保护剂，在微滤 和超滤过程中会伴随着剧烈的搅拌和剪切，重组人干扰素α 2b容易发生不同程度的氧化 和聚集，影响后续的处理，增加了纯化的难度，因此本发明通过一系列的实验研究发现，在 微滤替换缓冲液中添加0. 5%VcU0mM EDTA和0. 03% Tween 80，在超滤替换缓冲液中添加 0.5% Vc和0.05% Tween 80，可以有效的阻止目的蛋白质发生氧化和聚集，并且Tween 80 明显降低微滤和超滤膜的蛋白吸附量，显著提高回收率。(2)独特的疏水纯化步骤，通过对疏水纯化的摸索实验，意外的发现采用pH值 6. 5 士0. 05的20mM HEPES并添加0. 02%二甲基亚砜的缓冲液，可以显著提高疏水纯化的分 离效率，一步疏水纯化就可以达到捕获目的蛋白和去除大部分杂质的目的，疏水纯化后干 扰素α 2b的纯度大于95%以上，消除了发酵的波动，为后续的纯化奠定了良好的基础。(3)工艺简单可控，适合大规模生产，生产过程安全可控，生产效率高，纯化得率高 (最终纯化得率40% )，显著的降低能耗，无环境污染，有显著的经济效益。(4)通过本发明纯化方法得到的原液，质量标准达到2010版中国药典的标准， 反相色谱纯度达到95%以上，SDS-PAGE纯度法达到98%以上，残余工程菌蛋白含量低于 0. 005%，低于国家标准的10分之1，细菌内毒素每毫克低于0. 25EU，仅相当于国家标准的 120 分之 1 (标准为 10EU/300 μ g)。(5)高载量、高流速处理大体积样品，大大缩短工艺时间，可进行大规模生产工 艺单批规模可达到IOOg以上。
本发明的另一个明显优势是避免使用反相层析柱和单克隆层析柱。乙腈和甲醇 经常作为反相层析柱纯化洗脱试剂，以达到蛋白质精细纯化，获得高纯度的目的蛋白质。当 在规模化生产中使用进行蛋白的纯化时，乙腈和甲醇等有机溶剂的用量很大，它们都属于 有毒性的溶剂，大量使用有机溶剂带来一系列的问题不仅价格昂贵，生产成本过高；样品 中的残余溶剂可能带来安全性隐患；废水的处理会产生大量的环保处理费用；如排放到环 境中，将对环境带来污染。无需采用昂贵的单克隆亲和柱，显著地降低了生产成本，并避免 了亲和层析柱上脱落的单克隆抗体的污染，提高了产品的临床安全性；本工艺在不降低任 何收率和纯度指标的情况下，避免使用有机溶剂和单克隆层析柱，优点突出。
图1是本发明疏水层析纯化洗脱图谱；图2是本发明疏水层析纯化电泳图谱；图3是本发明疏水层析纯化HPLC-RPC检测图谱；图4是本发明体积排阻精纯洗脱图谱；图5是本发明重组人干扰素α 2b的SDS-PAGE电泳纯度检测结果图谱；图6是本发明重组人干扰素α 2b的HPLC-RPC纯度检测结果图谱；图7是本发明重组人干扰素α 2b表观分子量的SDS-PAGE检测结果图谱；图8是本发明重组人干扰素α 2b的MS分子量检测结果图谱。
具体实施例方式下面的实施例可以使本专业技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制 本发明。1)重组人干扰素α 2b酵母发酵液菌体的去除取重组人干扰素α 2b的发酵液，采用连续流加的方式，连续流加pH值6. 3的20mM Tris,0. 5% Vc, IOmM EDTA，0. 03% Tween80缓冲液，采用0. 45um中空纤维微滤膜管，微滤 替换20倍。料液流速为lm/s，操作压力为0. 4MPa，温度为10_20°C，微滤透过通量为2. 5L/ m2 · h02)目的蛋白质的浓缩和缓冲液的替换取微滤后的发酵上清液，采用对半稀释的方式添加PH值6. 5的20mM PBNa, 0. 5% Vc, 0. 05% TweenSO缓冲液，采用5K中空纤维超滤膜管，替换32倍。料液流速为lm/s，操作 压力为0. 6MPa，温度为10-20°C，微滤透过通量为1. 5L/m2 · h。3)疏水层析纯化超滤样品，添加3M (NH4) 2S04至终浓度为0. 8M，用5 %氨水调pH值6. 5。Octyl Sepharose 4 Fast Flow疏水凝胶层析柱(Φ 100mm) 0.5M NaOH在位清洗30min，超纯水洗 脱3柱床体积，使用缓冲液A :20mM HEPES，0. 8M硫酸铵，0. 02% DMSO(pH 6. 5，)平衡5柱床 体积。发酵上清(含0.8M(NH4)2S04)按10mg/ml上柱，使用缓冲液A再平衡3柱床体积，换 缓冲液B :20mM HEPES,0. 02% DMSO(pH 6. 5)，0%缓冲液B至100%缓冲液B、50柱床梯度 洗脱，分部收集样品。取样SDS-PAGE电泳，余样4°C放置备用。由洗脱图谱(图1)可见，有3个洗脱主峰，由电泳结果(图2)可见，第2个洗脱峰样为重组人干扰素α 2b(纯度大于98%)，其它样品含有较多杂质蛋白；反相纯度大于 95% (见图3)。图2是本实施例重组人干扰素α 2b SDS-PAGE(15%胶浓度，考马斯亮蓝染 色)电泳检测结果泳道2是3#样品，泳道3是2#样品，泳道4是1#样品；图3是2#的 反相检测图谱。结果表明2#为目的样，SDS-PAGE纯度大于98% (见图2)，反相纯度大于 95% (图 3)。4)体积排阻精度纯化疏水纯化样品，用5K超滤器超滤浓缩成50mg/ml的浓度。Superdex 75凝胶层析 柱(Φ50πιπι)0. 5Μ NaOH在位清洗30min，超纯水洗脱3柱床体积，20mM PBNa pH7. 0缓冲液C 平衡3柱床体积。疏水纯化后超滤样品按5%柱床体积上样，20mM PBNa pH7.0洗脱，分部 收集样品。取样SDS-PAGE电泳，余样4°C放置备用。由洗脱图谱(图4)可见，只有1个洗脱主峰。Superdex 75纯品用0. 2um过滤除 菌，4°C放置备用。本实施例还对重组人干扰素α 2b进行了性质分析1)采用SDS-PAGE电泳检测重组人干扰素α 2b的纯度按《中华人民共和国药典》2005年版三部附录IV C《SDS-聚丙烯酰胺凝胶电 泳法》测定样品表观分子量。积层胶浓度5%，分离胶浓度15% ；样品上样量20μ g，电 压100V-200V，银染显色。电泳结果见图5所示。图5是本实施例重组人干扰素α 2b SDS-PAGE(15%胶浓度，银染)电泳纯度检测结果；泳道1上样量30ug，泳道2上样15ug，泳 道3上样量5ug，泳道4上样量1. 5ug,泳道5上样量0. 25ug。结果表明纯度大于98%。2)采用HPLC-RPC检测重组人干扰素α 2b的纯度按《欧洲药典》5.0 版之 IFN-α 2 原液(Interferon Alfa-2Concentrated Solution)的HPLC-RPC C18纯度检测方法进行本样品的纯度检测。采用美国Waters公司 的HPLC系统，主机型号600，双波长检测器型号2487，数据处理软件为Empower 2。检测结 果见图6，图6是本实施例重组人干扰素α 2b HPLC-RPC检测结果。结果表明样品纯度大 于 95%。3)重组人干扰素α 2b表观分子量的检测按《中华人民共和国药典》2005年版三部附录IV C《SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 法》测定样品表观分子量。积层胶浓度5%，分离胶浓度15%。样品上样量1 μ g，电压 100V-200V，银染显色。电泳结果见图7。图7是本实施例重组人干扰素α 2b表观分子量 SDS-PAGE (15%胶浓度，银染)电泳图；泳道1上样量2ug，泳道2上样量lug。电泳结果与 理论值吻合。4)蛋白质MS分子量检测采用德国BRUKER公司Autoflex III T0F/T0F质谱仪，MALDI-T0FMS法测定重组人 干扰素α 2b的分子量。基质采用芥子酸(Sinapinicacid，SA, C11H12O5, MW 224. 22 ；)，蛋白 分子量标准品采用 BRUKER 公司之 Protein Calibration Standard II (Part No. 207234)， 分析软件为 flexAnalysis Ver. 3. 0. 54. 0.。检测结果重组人干扰素α 2b的MS分子量为19257. 469Dalt0n(见图8所示)， 图8是本实施例重组人干扰素α 2b质谱结果；结果表明与理论值吻合。5)内毒素含量和残余工程菌蛋白含量测定
残余工程菌蛋白含量低于0. 005%，低于国家标准的10分之1，细菌内毒素每毫克 低于0. 25EU，仅相当于国家标准的120分之1。
权利要求
一种重组人干扰素α2b的发酵后处理工艺，其特征在于从表达人干扰素α2b的工程菌中提取重组人干扰素α2b，包括如下步骤1)重组人干扰素α2b酵母发酵液中菌体的去除，2)发酵上清中目的蛋白质的浓缩和缓冲液的替换，3)疏水层析初步纯化，4)体积排阻层析纯化。
2.如权利要求1所述的一种重组人干扰素α2b的发酵后处理工艺，其特征在于所述 的步骤1)中，采用微滤技术，选用中空纤维膜管，替换缓冲液为PH值6.3士0. 1的20mM三羟 甲基氨基甲烷(Tris)，并添加浓度为0. 5%的Vc，IOmM的EDTA，浓度为0. 03%的Tween80。
3.如权利要求2所述的一种重组人干扰素α2b的发酵后处理工艺，其特征在于所述 的微滤采用0. 45um中空纤维膜管。
4.如权利要求1所述的一种重组人干扰素α2b的发酵后处理工艺，其特征在于所述 的步骤2)中，采用超滤技术，选用中空纤维膜管，替换缓冲液为pH值6. 5士0. 1的20mM磷 酸缓冲液，并添加浓度为0. 5% Vc和0. 05% Tween80o
5.如权利要求4所述的一种重组人干扰素α2b的发酵后处理工艺，其特征在于所述 的超滤采用5K中空纤维膜管。
6.如权利要求1所述的一种重组人干扰素α2b的发酵后处理工艺，其特征在于所述 的步骤3)中疏水层析洗脱缓冲液采用缓冲液A和缓冲液B，利用疏水层析柱进行纯化，缓冲 液 A 为 pH 值 6. 5 士0. 05 的 20mM HEPES，0. 8M (NH4)2SO4,浓度为 0. 02%二甲基亚砜，缓冲液 B 为PH值6. 5 士0. 05的20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸和浓度为0. 02%二甲基亚砜。
7.如权利要求1所述的一种重组人干扰素α2b的发酵后处理工艺，其特征在于所 述的步骤4)中采用缓冲液C，利用体积排阻交换柱进行体积排阻层析，缓冲液C为pH值 7. 0 士 0. 1 的 20mM PBNa。
全文摘要
本发明公开一种重组人干扰素α2b的发酵后处理工艺，从表达人干扰素α2b的工程菌中提取重组人干扰素α2b，包括如下步骤1)酵母发酵液中菌体的去除，2)发酵上清中目的蛋白质的浓缩和缓冲液的替换，3)疏水层析初步纯化，4)体积排阻层析纯化。本发明减少了设备成本、生产成本、降低了能耗、减少环境污染，提高了产品的临床安全性；同时本发明工艺稳定简单，适合大规模生产，生产过程安全可控，生产效率高，显著的降低能耗，无环境污染，有显著的经济效益，生产产品质量标准符合2010版中国药典标准。
文档编号C07K14/56GK101974084SQ201010294158
公开日2011年2月16日 申请日期2010年9月21日 优先权日2010年9月21日
发明者孙黎, 尹凤红, 张茜, 汪铁兵, 肖清江, 苏诗蟠 申请人:厦门特宝生物工程股份有限公司