专利名称：一种高效快速纯化制备片段抗体的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域的蛋白质纯化技术，主要涉及抗体类包括单克隆抗体和小分子片段抗体，人源化或人-鼠嵌合抗体以及片段抗体的纯化制备工艺。特别涉及一种高效快速纯化制备片段抗体的方法，适用于治疗用抗体类药物的生产制备。
背景技术：
抗体治疗已成为当今生物治疗肿瘤、流行性和感染性疾病的重要手段。至2004年2月，美国FDA已批准16个抗体治疗药物上市，市场销售额已超过2×109美金。抗体类药物以其高度的特异性、有效性和安全性成为国际药品市场上一大类新型治疗剂。在16个抗体治疗药物中，12个均为人源化或人鼠嵌合抗体(美国FDA网页http//www.fda.gov)。
放射免疫治疗是(Radioimmuno-therapy，RIT)以抗体为载体，将携带的放射性核素借助于抗体的导向作用集中浓聚，从而提高对肿瘤细胞杀伤作用，减少正常组织损伤，在16个抗体治疗药物中有Y90和I131两种放射性核素标记的鼠原性抗体(90Y-IbritumomabIDEC 2002；Tositumomab and Iodine I131Tositumomab Corixa 2003)用于肿瘤导向治疗。F(ab’)2片段抗体和Fab小分子抗体，比较鼠源性全抗具有免疫原性低，肿瘤穿透能力较强，肿瘤部位滞留时间较长等特点。因此更适合作为肿瘤放射免疫治疗的靶向载体。
动物细胞大规模培养生产蛋白治疗药物已成为当今生物制药领域的主流。临床许多抗体指征性的治疗，抗体需用较高剂量或延缓性长期用药。因此，经济型的过程放大是工艺评价的重要指标。扩张柱床吸附技术可将大规模培养的回收液直接上柱，一步完成吸附、浓缩和纯化，减少工艺步骤、节省资金投入和增加产品收率，被生物制药工业领域广泛接受[6]。Protein A亲和色谱扩张柱床吸附在抗体制备工艺中是最常为采用操作方式[7]，因为Protein A亲和色谱可选择性地有效结合哺乳动物的IgG分子，一步高效回收并纯化细胞产物混合物中的抗体，回收率大于99.5％，同时亲和层析还可有效的清除病毒；由于亲和层析操作步骤简单快速，在复杂的制造工艺中容易做到质量控制和产品的一致性[8]。
Protein A亲和色谱的不利因素主要是工艺成本高和合成树脂的稳定性[9]。在抗体制备工艺中Protein A亲和色谱的总成本费用高于离子交换色谱的30％，加上色谱的再生和其它材料费用，成本上升到35％[10]。此外，色谱配合体在极度的处理条件下可变形，脱落的Protein A分子对人体具有免疫原性并可引起生理反应。Genentech公司最为常用的工艺包括三步色谱法，Protein A亲和色谱—阳离子色谱—阴离子色谱[13]。
有关F(ab’)2片段抗体的酶切和纯化近年来报道不多。早期的方法是采用硫酸铵沉淀和热处理两者结合，这种方法既费时，成本又高，无法作为生产；亲合色谱Protein A和Protein G由于它们结合IgG的Fc端，不能用于F(ab’)2的纯化[11]。Morimoto andInouye and Inouye and Morimoto用疏水色谱吸附纯化F(ab’)2片段抗体，在SDS-PAGE和胶过滤两种方法显示F(ab’)2在单色谱峰中有较高的均质性；Koichi Morimoto和Kuniyo Inouye用Tsk gel Phenyl-5PW疏水色谱吸附纯化IgGl型F(ab’)2片段抗体，其纯度达到98％，但其都在小规模实验阶段进行，尚未进入中试放大工艺生产[12]。
在治疗性抗体的纯化工艺中，除考虑到产品的纯度、回收率，还必需考虑的重要一点是工艺过程的质量控制，有效去除杂质包括来自宿主细胞的蛋白、DNA、抗体异构体、碎片，以及小分子和潜在的污染物如内毒素、滤过性病毒等。治疗性F(ab’)2片段抗体的纯化工艺比较全抗体，就其过程控制更为复杂，需考虑更多的过程衔接，产品得率，以及残留的酶量和小分子碎片的污染等[14]。
申请人在抗人肝癌F(ab’)2抗体制备工艺中，采用三步色谱纯化，第一步STREAMLINESP阳离子吸附层析获取杂交瘤细胞培养液中的IgG；第二步阴离子吸附浓缩，继而胃蛋白酶酶切IgG；第三步Phenyl-5PW疏水色谱纯化F(ab’)2片段抗体，同时去除细菌内毒素。整个工艺过程中，申请人就工艺过程的关键参数进行比较分析，如产品回收率与条件，工艺衔接与方法选择，终产品纯度与活性保持，以及工艺过程的放大，选择最佳参数标准，以获得高效、快速的F(ab’)2抗体纯化工艺。
目前有关F(ab’)2片段抗体纯化制备工艺的专利有以下几篇米力，陈志南等中国发明专利ZL 99115730.3[1]，名称为在单克隆抗体F(ab’)2和Fab片段的制备方法，其权利要求的描述为单克隆抗体腹水，用50％的饱和硫酸胺粗提二次，F(ab’)2制备用胃蛋白酶与IgG酶切比例为1∶100，37℃反应2-3h；Fab用木瓜蛋白酶，酶与IgG的比例1∶100，37℃反应1-2h；HPLC疏水液相色谱法纯化F(ab’)2、Fab片段抗体，用Phenyl Sepharose HighPerformance疏水填料(Pharmacia)分二次纯化一次纯化A液为1～1.4M硫酸胺0.05MpH5.0醋酸钠缓冲液，B液为0.05M pH5.0醋酸钠缓冲液；二次纯化A液用0.7～1.0M硫酸胺0.05M pH5.0醋酸钠缓冲液，B液为0.05M pH5.0醋酸钠缓冲液，线性梯度洗脱时间30-40分钟；纯化后立即冻干，加10％低分子右旋糖酣做复性剂。
米力、李玲等中国发明专利(ZL 01131736.1)[2]，名称为连续灌流式培养杂交瘤细胞制备抗体的方法，其权利要求中有关抗体回收纯化的描述产物回收纯化，采用Streamline SP介质，一步回收培养上清中的抗体，DEAE-Sepharose FF阴离子交换剂去除纯化后抗体产品中的热源质，抗体成品冻干保存。抗体产物培养上清调解pH值4-7，电导值2-5mS/cm；平衡液(A液)pH4-7；洗脱液(B液)A液+1M NaCl。用DEAE-Sepharose FF阴离子交换剂去除纯化后抗体产品中的热源质。在pH4～7的条件下，热源吸附于柱上，抗体在穿过峰中流出；再以1M NaCl和0.5M NaOH去除吸附于柱上的热源，柱子可重复使用。
Ngo；That T.有关抗体纯化工艺(United States Patent，No4,933,435)[3]，其权利要求主要描述用固定相proteinA、proteinG色谱结合吸附免疫球蛋白的纯化工艺，所用的缓冲系统的pH6-10，包含至少一种多羧基酸，浓度0.5-0.9M。
Sullivan；John B，Russell；Findlay E.有关抗体纯化工艺(United States Patent，No 4,849,352)专利中[4]，描述用多聚苯烯酰氨凝胶亲和色谱法分离木瓜蛋白酶切的Fab片段抗体和胃蛋白酶切的F(ab’)2抗体，对纯化工艺的条件和方法未作具体描述。
Ngo；That T.用固定Protein A亲合色谱纯化单克隆抗体工艺专利(United StatesPatent，No 4,801,687)[5]，工艺条件免疫球蛋白的吸附缓冲液pH7.5-10，缓冲液浓度0.6-1.75M，是单价的阳离子或多碱基的阴离子的缓冲系统。免疫球蛋白的解吸附缓冲液条件pH3-6。
根据申请人所进行的资料检索，检索到和本发明相关的有以下参考文献[1]米力，陈志南等。单克隆抗体F(ab’)2和Fab片段的制备方法，2004，中国发明专利ZL99115730.3。
米力，李玲等。连续灌流式培养杂交瘤细胞制备抗体的方法，2004，中国发明专利ZL01131736.1。
Ngo；That T.Antibody purification process，1990.United StatesPatent，No4,933,435。
Sullivan；John B.Russell；Findlay E.Antibody purification process，1989，United States Patent，No4,849,352。
Ngo；That T.Monoclonal antibody purification process using protein A，1989，United States Patent，No4,801,687。
J.Feuser a，M.Halfar a，D.Lutkemeyer b，etal.Interaction of mammalian cellculture broth with adsorbents in expanded bed adsorption of monoclonalantibodies.Process Biochemistry 34(1999)159-165。
Jorg Thommes*，Andrea Bader，Markus Halfar，etal.Isolation of monoclonalantibodies from cell containing hybridoma broth using a protein A coatedadsorbent in expanded beds.Journal of Chromatography A.752(1996)111-122。
R.L.Fahrner，D.H.Whitney，M.Vanderlaan，G.S.Blank，Performance comparisonof protein A affinity-chromatography sorbents for purifying recombinantmonoclonal antibodies.Biotechnol.Appl.Biochem.30(1999)121。
G.Hale，A.Drumm，P.Harrison，J.Phillips，Repeated cleaning of protein Aaffinity column with sodium hydroxide.J.Immunol.Methods.171(1994)15-21. Deborah K.Follman.，Robert L.Fahrner.Factorial screening of antibodypurification processes using three chromatography steps without proteinA.Journal of Chromatography A，1024(2004)79-85。
Peter Kumpalume，Nigel K.H.Slater.Comparative study of thiophilicfunctionalised matrices for polyclonal F(ab_)2purification.Journal ofChromatography A，1022(2004)41-50。
Koichi Morimoto，Kuniyo Inouye.Single-step purification of F(ab’)2fragments of mouse monoclonal antibodies(IgGl)by hydrophobic interaction highperformance liquid chromatography using TSKgel Phent-5PW.J.BiochemistryBiophysics Methods..1992，24107-117。
R.L.Fahrner，H.L.Knudsen，C.D.Basey，W.Galan，D.Feuerhelm，M.Vanderlaan，G.S.Blank.Industrial purification of pharmaceutical antibodiesdevelopment，operation.and validation of chromatograpgy processes.Biotechnol.Genet.Eng.Rev.18(2001)301。
R.L.Fahrner，D.H.Whitney，M.Vanderlaan，G.S.Blank，Performance comparisonof protein A affinity-chromatography sorbents for purifying recombinantmonoclonal antibodies.Biotechnol.Appl.Biochem.30(1999)121。
发明内容
针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本发明的目的是提供一种高效、快速纯化制备片段抗体的方法。
实现上述发明目的技术解决方案是，采用扩张柱床吸附——阴离子层析浓缩——疏水层析纯化三步纯化，从细胞规模培养物中分离纯化抗体IgG，酶切后纯化制备片段抗体，整个纯化工艺的衔接采用同一缓冲系统，通过改变pH值的方法进行洗脱，减少了工艺过程缓冲系统置换的步骤。
首先采用扩张床柱阳离子层析吸附大规模细胞培养物中的抗体IgG，通过改变缓冲系统pH值(pH7-9)进行洗脱，收集抗体IgG；再直接进行阴离子层析，同样通过改变缓冲系统pH值(pH3-6)进行洗脱，达到浓缩纯化抗体IgG的目的；此时收集的抗体IgG被胃蛋白酶酶切并得到F(ab’)2片段，酶切后的样品经疏水层析，获取到的F(ab’)2半成品纯度不小于98％，质量检定完全符合标准。
本发明的技术特点是(1)纯化工艺过程设计合理，结果显示经过阳离子吸附分离——阴离子浓缩纯化——酶切——硫水纯化几步达到了很好的分离效果；(2)纯化工艺的衔接采用同一缓冲系统，通过改变pH值的方法进行洗脱，省去了缓冲系统更换步骤，使前后纯化过程衔接紧密；(3)通过阳离子——阴离子色谱浓缩方法替代传统的硫酸氨沉淀浓缩方法。整个纯化工艺过程在12小时内完成，其片段抗体纯度不小于98％，达到高效、快速、成本低、纯度高、稳定、批次间结果差异小等特点，有效地保持片段抗体的活性，特别适宜于单克隆抗体、酶切后抗体和基因工程表达小分子抗体的纯化与制备。
本发明包括以下步骤1)在制备抗体IgG的新工艺中，采用两步法即先用Streamline SP阳离子层析收集大体积杂交瘤细胞培养物中的抗体IgG，再用阴离子层析纯化浓缩。阳离子层析采用改变缓冲液的pH条件来进行目标蛋白的洗脱(即采用缓冲系统B进行洗脱)，而此缓冲系统正好是阴离子层析吸附缓冲系统，因此收集的蛋白溶液即可进行阴离子层析。
2)采用阴离子层析的主要目的是浓缩阳离子层析的洗脱液，为下一步的酶切做准备。阴离子层析也采用改变缓冲液的pH条件来进行目标蛋白的洗脱(即采用缓冲系统A进行洗脱)，而此缓冲系统正好是酶切缓冲系统，因此收集的蛋白溶液即可进行酶切来制备F(ab’)2片段。
在此两步层析过程中均采用改变缓冲液的pH条件来进行目标蛋白的洗脱。目的为了省去了更换缓冲液的过程，节省时间，使得纯化过程衔接得更加紧密。
3)酶切后的样品无须沉淀、透析，只需加入0.8-1.5M固体硫酸铵，即可进行疏水层析(吸附缓冲系统为缓冲系统A加入硫酸铵)，同时解吸附缓冲系统为缓冲系统A。
4)每步纯化步骤样品均需处理，具体参数如下a.阳离子层析样品即回收的杂交瘤细胞培养物无须澄清和浓缩，用超纯水稀释至电导率为4-6ms/ml，然后调节pH至后上样。
b.阴离子层析样品即阳离子层析洗脱液pH为7-9。
c.酶切样品即阴离子层析洗脱液pH为3-6。
d.疏水层析样品即酶切终止后液体pH为3-6。
5)其它参数如下I阳离子层析流速100-200ml/min。
II阴离子层析流速5-15ml/min。
III酶切时间0.5-2.0h，温度37℃。
IV疏水层析流速3-10ml/min。
上述缓冲系统(A)为羧基酸缓冲系统，pH＝3-6，浓度0.01-0.1M；缓冲系统(B)为单价的阳离子或多碱基的阴离子缓冲系统，pH＝7-9，浓度0.01-0.05M。
本发明首次采用了参数控制，设定pH，电导，流速，温度指标，以此标准控制各步纯化，并首次结合AKTA层析系统配置的软件，设置了自动操作的纯化方案，大大节省了时间、人力。本发明特别适宜于动物细胞规模培养分泌表达的片段抗体、酶切后抗体和表达后稳定性不好蛋白质的快速纯化制备。具有高效、快速、纯度高、成本低、稳定可控性强、批次间结果差异小等特点。
图1是F(ab’)2片段抗体生产的工艺流程图；图2是阳离子层析色谱图；图3是阳离子层析SDS-PAGE电泳4是阴离子层析色谱图；图5是阴离子层析SDS-PAGE电泳图；图6是酶切电泳图；图7是疏水层析色谱图；图8是疏水层析SDS-PAGE电泳图；图9是F(ab’)2片段抗体SEC-HPLC图。
具体实施例方式
以下结合附图和发明人给出的具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
依照本发明的技术方案，申请人采用杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体进行F(ab’)2片段抗体的制备。该杂交瘤细胞稳定分泌表达抗人肝癌相关抗原的单克隆抗体(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心保藏，保藏号CGMCC No 0426)。
用机械搅拌式生物反应器，大规模高密度悬浮培养杂交瘤细胞；采用了扩张柱床阳离子层析吸附前期的大规模细胞培养液中的抗体IgG并用阴离子层析进行浓缩，两步层析均采用通过改变缓冲系统pH值的方法进行洗脱。抗体IgG被胃蛋白酶处理获取F(ab’)2片段，最后通过疏水层析，获取完全符合标准的F(ab’)2半成品，整个纯化过程只需12小时，即可冻干制成片段抗体半成品(制备F(ab’)2片段抗体工艺流程图参见图1)。
本发明的工艺用连续纯化过程获取F(ab’)2片段抗体，其工艺过程主要分以下几步1.阳离子层析回收纯化培养液中的单克隆抗体IgG。
2.阴离子层析浓缩阳离子层析收集液。
3.酶切获取F(ab’)2片段抗体。
4.疏水层析获取高纯度、无菌、无热源、高活性的符合《人用鼠源性单克隆抗体制备及质量控制要点》[卫药汉字(90)第37号]标准的F(ab’)2片段抗体。
5.产品鉴定包括无菌、无热源、纯度分析、活性检测、回收率计算等实验。
以下对上述步骤进行进一步详细说明。
一、阳离子层析(1)回收的杂交瘤细胞培养物无须澄清和浓缩，用超纯水稀释至电导率4-6ms/cm，调节pH至3-6。
(2)扩张床柱Streamline-50(Pharmacia Biotech瑞典)，吸附介质Streamline SP；BT00-300M，BT00-100M型蠕动泵各一台(河北保定兰格恒流泵有限公司)，HD-21-88型核酸蛋白检测仪(上海琪特分析仪器有限公司)和YOKOGAWA 3057便携式记录仪(四川仪表四厂)。
(3)吸附缓冲系统缓冲系统A(柠檬酸缓冲液pH3-6)；解吸附缓冲系统缓冲系统B(Tris-HCl pH7-9)。
(4)先以缓冲系统A充分平衡扩张柱床Streamline，上样，完毕后再以缓冲系统A冲洗去未结合蛋白；然后用缓冲系统B直接洗脱，收集洗脱峰。
二、阴离子层析(1)调节阳离子层析洗脱峰pH为7-9。
(2)纯化系统AKTA purifier-100；色谱柱XK16/20(Pharmacia Biotech瑞典)；层析介质DEAE SepharoseTM Fast Flow(Pharmacia Biotech瑞典)。
(3)缓冲系统B条件吸附上样，(pH7-9)；缓冲系统A解吸附(pH为3-6)。
(4)缓冲系统B充分平衡DEAE柱，上样，完毕后再以缓冲系统B冲洗去未结合蛋白，然后用缓冲系统A直接洗脱，收集洗脱峰。
三、酶切(1)胃蛋白酶(结晶品，Sigma公司)，终止液3mol/l Tris。
(2)酶切缓冲系统缓冲系统A(柠檬酸缓冲液pH3-6)。
(3)胃蛋白酶与抗体混合按比例1∶100(g/g)，37℃水浴反应，0.5-2h，加入3mol/lTris调整pH值至7.0左右，终止反应。
四、疏水层析(1)调节酶切终止液pH至3-6；加入0.8-1.5M硫酸铵。
(2)纯化系统AKTA purifier-100(Amersham Biosciences瑞典)；色谱柱XK16/20(Amersham Biotech瑞典)；层析介质Phenyl Sepharose High Performance(PharmaciaBiotech瑞典)。
(3)缓冲系统A加入0.8-1.5M硫酸铵吸附酶切后F(ab’)2(柠檬酸缓冲液pH3-6)；缓冲系统A梯度洗脱。
(4)以吸附缓冲系统充分平衡疏水柱，上样，完毕后再以吸附缓冲系统冲洗去未结合蛋白，然后以解吸附缓冲系统梯度洗脱，收集洗脱峰，即为F(ab’)2片段抗体。
五、产品鉴定a.无菌试验，按《生物制品制备及检定规程》中国药典1995版二部附录79页，细胞培养无菌试验结果应为阴性。
b.细菌内毒素检查，按2000版《中国生物制品规程》通则“生物制品细菌内毒素试验规程”进行；结果细菌内毒素应＜0.5(Eu)。
c.回收率测定，ELISA法测定层析前后目标蛋白浓度。依下式计算回收率 d.纯度测定，采用SDS-PAGE，在非还原条件下进行电泳，电泳结果经考马斯亮蓝R-250染色后，用上海复日图像分析系统扫描，并用软件分析产品的纯度。
结果1.制备抗体IgG的结果a.由图2、3知，通过阳离子层析大量杂蛋白在穿过峰中，且没有目标蛋白损失，目标蛋白(抗体IgG)均在洗脱峰中而且被明显纯化浓缩(可浓缩20倍)，其中图3中1、2、3分别表示原液、穿过液、洗脱液；b.由图4、5知，通过阴离子层析杂蛋白在穿过峰中，目标蛋白(抗体IgG)在洗脱峰中被明显浓缩，且被再次纯化(可浓缩10倍)。其中图5中的1′、2′、3′分别表示阴离子层析原液、阴离子层析穿过峰、阴离子层析洗脱峰；c.通过阳离子、阴离子层析两步抗体IgG回收率为89.31％。
2.酶切制备F(ab’)2结果由图6知，阴离子层析的洗脱峰调节后即可进行酶切，而且酶切效率达97％。其中的1″、2″、3″分别表示F(ab’)2标准品、酶切前样品、酶切后样品。
3.疏水层析纯化结果a.由图7、8知，经过疏水层析F(ab’)2片段被有效纯化。其中图8中的1*、2*、3*分别表示疏水层析原液、疏水层析穿过液、疏水层析洗脱液。
b.SDS-PAGE电泳结果经软件分析，疏水层析纯化后的F(ab’)2片段纯度为98.9％；c.由图9知，疏水层析纯化后F(ab’)2片段纯度为99.63％。
4.无菌试验结果无细菌生长。
5.细菌内毒素检查细菌内毒素＜0.5(Eu)。
权利要求
1.一种高效快速纯化制备片段抗体的方法，采用扩张柱床吸附——阴离子层析浓缩——疏水层析纯化三步纯化，从细胞规模培养物中分离纯化抗体IgG，酶切后纯化制备片段抗体，整个纯化工艺的衔接采用同一缓冲系统，通过改变pH值的方法进行洗脱，减少了工艺过程缓冲系统置换的步骤，其特征在于，包括以下步骤(1)动物细胞规模培养物中分离纯化抗体IgG，先用Streamline SP阳离子层析吸附动物细胞规模培养物中的抗体IgG，得到初步纯化的抗体IgG，其过程参数为a.Streamline SP阳离子层析，动物细胞培养物无须澄清和浓缩，用超纯水稀释至电导率为4ms/ml～6ms/ml，吸附条件用缓冲系统(A)，直接上样；b.解吸附条件用缓冲系统(B)，直接洗脱，收集洗脱峰；(2)阴离子层析，抗体IgG被充分浓缩纯化；胃蛋白酶酶切获取F(ab’)2片段；其过程参数为a.吸附条件用缓冲系统(B)，阳离子层析洗脱峰直接上样；解吸附条件用缓冲系统(A)，收集洗脱峰，进一步浓缩纯化抗体IgG；b.酶切用缓冲系统(A)，酶与抗体1∶100(g/g)混合，37℃水浴反应0.5h-2h，调整pH＝6-8终止反应；(3)疏水层析纯化片段抗体，其过程参数为a.吸附条件用缓冲系统(A)加入0.8-1.5M硫酸铵，酶切后的样品同样处理后上样，b.解吸附条件用缓冲系统(A)梯度洗脱，收集洗脱峰。
2.如权利要求1中所述的快速纯化制备片段抗体的方法，其特征在于，动物细胞规模培养物中的抗体IgG，包括杂交瘤细胞培养的单克隆抗体IgG，或CHO、SP2/0、NSO细胞培养分泌型人-鼠嵌合抗体IgG或人源化抗体IgG。
3.权利要求1中所述的快速纯化制备片段抗体的方法，其特征在于，缓冲系统(A)为羧基酸缓冲系统，pH＝3-6，浓度0.01-0.1M；缓冲系统(B)为单价的阳离子或多碱基的阴离子缓冲系统，pH＝7-9，浓度0.01-0.05M。
4.权利要求1中所述的快速纯化制备片段抗体的方法，其特征在于，所述三步纯化方法获取的片段抗体纯度不小于于97％，整个纯化过程在12小时内即可完成。
全文摘要
本发明公开了一种从动物细胞规模培养物中高效快速纯化制备片段抗体的方法，采用扩张柱床吸附、阴离子层析浓缩、疏水层析纯化方法，扩张柱床阳离子层析吸附大规模细胞培养物中的抗体IgG，通过改变缓冲系统pH值进行洗脱；收集的洗脱峰即可直接进行阴离子层析；被充分浓缩纯化的抗体IgG，直接被胃蛋白酶酶切获取片段抗体，进行疏水层析纯化，最终获取的片段抗体纯度不小于97％，整个纯化过程在12小时内即可完成。纯化工艺的衔接采用同一缓冲系统，通过改变pH值的方法进行洗脱，省去了缓冲系统更换步骤，使前后纯化过程衔接紧密；通过阳离子—阴离子色谱结合的浓缩方法替代传统的硫酸铵沉淀浓缩方法。具有高效、快速、成本低、纯度高、稳定、批次间结果差异小等特点。
文档编号C07K1/16GK1563090SQ20041002602
公开日2005年1月12日 申请日期2004年4月7日 优先权日2004年4月7日
发明者米力, 唐浩, 余晓玲, 谢丽 申请人:陈志南