专利名称：采用模拟移动床色谱纯化抗体的制作方法
采用模拟移动床色谱纯化抗体
本申请要求2011年9月20日提交的美国专利申请第61/384，620号的申请日的权益，其内容在此整体引入作为参考。
1.简介 本发明涉及用于抗体(例如单克隆抗体(“mAbs”))的色谱纯化的组合物和方法，其采用改进的模拟移动床(“SMB”)分离策略以及在某些实施方案中采用拉曼光谱。_3] 2.发明背景 蛋白质纯化策略通常采用一个或多个色谱分离步骤以将宿主细胞蛋白(“HCPs”)从最终纯化的蛋白制剂中排除。此色谱分离步骤通常以“批处理方式”来进行，其中将填充有特定的色谱固定相的单柱连续进行平衡、装载、洗涤、洗脱，并随后再生。由于批处理方式色谱法只依赖于装载的柱的动态容量，而不是装载的柱的饱和容量，因此装载和分离的每个循环仅使用该柱实际结合容量的30%至50%。因此，批处理方式分离需要使用具有当这些柱子在其饱和容量下运行时所需要的两至三倍以上体积的柱子。仅利用了 30%-50%的柱的实际结合容量，批处理方式色谱法因此涉及使用明显更高的色谱分离固定相的量，且延长完成装载和分离的每个循环所需要的时间，其大幅度地增加了蛋白质纯化相关的成本。此夕卜，如果在饱和时进行分离，使用具有两到三倍体积的柱子将是必要的，这导致单个分离循环中所使用的平衡、洗涤和洗脱缓冲液的量显著增加，造成额外的成本和时间的低效。
鉴于上述情况，本领域中需要改进的方法以更有效地纯化蛋白质，包括治疗性抗体。本发明通过将改进的模拟移动床分离策略纳入蛋白质的纯化中解决了这一需求。
3.发明概沭 在某些实施方案中，本发明涉及从含靶蛋白和至少一种HCP的样品混合物制备宿主细胞蛋白(HCP)降低的靶蛋白制剂的方法。在某些实施方案中，本发明的方法包括使含靶蛋白的样品混合物接触色谱树脂，使得树脂被装载至其饱和结合容量的约50%-100%，包括大于约50%、大于约60%、大于约70%、大于约80%和大于约90%，并收集色谱样品，其中所述色谱样品包括所述HCP降低的靶蛋白制剂。在某些这样的实施方案中，采用拉曼光谱以便监测和/或确定涉及此HCP降低的靶蛋白制剂的制备的一种或多种多组分混合物的组成。
本发明的某些实施方案涉及HCP降低的靶蛋白制剂的制备，其包括使含靶蛋白的样品混合物接触色谱树脂，使得树脂被装载至其饱和结合容量的约50%-100%，包括大于约50%、大于约60%、大于约70%、大于约80%和大于约90%，并收集色谱样品，其中所述色谱样品包括所述HCP降低的靶蛋白制剂和选自亲和色谱树脂、离子交换色谱树脂和疏水相互作用色谱树脂的色谱树脂。在某些这样的实施方案中，采用拉曼光谱以便监测和/或确定涉及此HCP降低的靶蛋白制剂的制备的一种或多种多组分混合物的组成。
本发明的某些实施方案涉及HCP降低的靶蛋白制剂的制备，其包括使含靶蛋白的样品混合物接触色谱树脂，使得树脂被装载至其饱和结合容量的约50%-100%，包括大于约50%、大于约60%、大于约70%、大于约80%和大于约90%，并收集色谱样品，其中所述色谱样品包括所述HCP降低的靶蛋白制剂并且所述靶蛋白选自:酶；肽类激素；多克隆抗体；人单克隆抗体；人源化单克隆抗体；嵌合单克隆抗体；单链抗体；Fab抗体片段；F(ab’ )2抗体片段；Fd抗体片段；Fv抗体片段；分离的CDRs ;双抗体；DVDs和免疫粘附素。在某些这样的实施方案中，采用拉曼光谱以便监测和/或确定涉及此HCP降低的靶蛋白制剂的制备的一种或多种多组分混合物的组成。
本发明的某些实施方案涉及HCP降低的靶蛋白制剂的制备，其包括使含靶蛋白的样品混合物接触色谱树脂，使得树脂被装载至其饱和结合容量的约50%-100%，包括大于约50%、大于约60%、大于约70%、大于约80%和大于约90%，并收集色谱样品，其中所述色谱样品包括所述HCP降低的靶蛋白制剂，并且将色谱树脂充填入一系列被流体导管分隔的流体连接柱，其中流体连接柱的数量选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12个单柱。在某些这样的实施方案中，采用拉曼光谱以便监测和/或确定涉及此HCP降低的靶蛋白制剂的制备的一种或多种多组分混合物的组成。
本发明的某些实施方案涉及HCP降低的靶蛋白制剂的制备，其包括使含靶蛋白的样品混合物接触色谱树脂，使得树脂被装载至其饱和结合容量的约50%-100%，包括大于约50%、大于约60%、大于约70%、大于约80%和大于约90%，并收集色谱样品，其中所述色谱样品包括所述HCP降低的靶蛋白制剂，并且将色谱树脂充填入一系列被流体导管分隔的至少2个流体连接柱，其中所述柱子被流体导管分隔以允许引入缓冲液，如平衡、洗涤和洗脱缓冲液，以及洗脱液的移出。在某些这样的实施方案中，采用拉曼光谱以便监测和/或确定涉及此HCP降低的靶蛋白制剂的制备的一种或多种多组分混合物的组成。
本发明的某些实施方案涉及HCP降低的靶蛋白制剂的制备，其包括使含靶蛋白的样品混合物接触色谱树脂，使得树脂被装载至其饱和结合容量的约50%-100%，包括大于约50%、大于约60%、大于约70%、大于约80%和大于约90%，并收集色谱样品，其中所述色谱样品包括所述HCP降低的靶蛋白制剂，并且样品混合物与色谱树脂接触以获得选自约0.5至约12分钟范围的保留时间，在一个实施方案中，其可以选自高达约0.5分钟、高达约I分钟、高达约2分钟、高达约3分钟、高达约4分钟、高达约5分钟、高达约6分钟、高达约7分钟、高达约8分钟、高达约9分钟、高达约10分钟、高达约11分钟和高达约12分钟。在某些这样的实施方案中，采用拉曼光谱以便监测和/或确定涉及此HCP降低的靶蛋白制剂的制备的一种或多种多组分混合物的组成。
本发明的某些实施方案涉及HCP降低的靶蛋白制剂的制备，其包括使含靶蛋白的样品混合物接触色谱树脂，使得树脂被装载至其饱和结合容量的约50%-100%，包括大于约50%、大于约60%、大于约70%、大于约80%和大于约90%，并收集色谱样品，其中所述色谱样品包括所述HCP降低的靶蛋白制剂，并且所述方法进一步包括在接触样品混合物前平衡色谱树脂和接触样品混合物后洗涤色谱树脂的步骤，其中平衡和洗涤缓冲液为相同缓冲液。在某些这样的实施方案中，采用拉曼光谱以便监测和/或确定涉及此HCP降低的靶蛋白制剂的制备的一种或多种多组分混合物的组成。
本发明的某些实施方案涉及HCP降低的靶蛋白制剂的制备，其包括使含靶蛋白的样品混合物接触色谱树脂，使得树脂被装载至其饱和结合容量的约50%-100%，包括大于约50%、大于约60%、大于约70%、大于约80%和大于约90%，并收集色谱样品，其中所述色谱样品包括所述HCP降低的靶蛋白制剂，并且所述方法进一步包括色谱树脂的洗涤和再生步骤，其中此步骤可被计算和编排，以维持样品接触色谱树脂的步骤为该过程的时间的约20%至约80%，在一个特定的实施方案中，其为约50%。在某些这样的实施方案中，采用拉曼光谱以便监测和/或确定涉及此HCP降低的靶蛋白制剂的制备的一种或多种多组分混合物的组成。
4.附图简沭
图1描述了常规的色谱流程图与模拟移动床色谱流程图。
图2描述了常规的色谱流程图。
图3描述了模拟移动床色谱流程图。
图4描述了反映mAb X模拟移动床色谱个案研究结果的色谱图。
图5描述了 mAb X模拟移动床色谱个案研究的产品回收和产品质量分析。
图6描述了反映mAb Y模拟移动床色谱个案研究结果的色谱图。
图7描述了 mAb Y模拟移动床色谱个案研究的产品回收和产品质量分析。
图8描述了与mAb X模拟移动床色谱个案研究有关的mAb X %漏出分析。
图9描述了与mAb Y模拟移动床色谱个案研究有关的mAb Y %漏出分析。
图10描述了中试规模的模拟移动床色谱流程图。
图11描述了包括氨基酸、pH缓冲物质和糖的3组分(精氨酸/柠檬酸/海藻糖)缓冲系统的拉曼光谱。该图表采用Umetrics SIMCA P+ V 12.0.1.0生成。X轴为数据点的数目。每个数据点为拉曼位移波数。其可以用X轴上的拉曼位移波数(cm—1)重新绘制。数据从波数1800 (=Num O)开始至800 (=Num 1000)。拉曼光谱的原始数据以强度(与散射光子的数目有关)为单位。该图显示了三个单独的组分(在水中)的平均的中心光谱数据。光谱的平均值为O。其他值与其相对应，可能在与平均值的标准差处。
图12描述了采用随机值比较3组分缓冲系统(精氨酸/柠檬酸/海藻糖)的实际与预测浓度。该图通过使用现有的模型预测新溶液的浓度来创建。X和y轴为浓度(HiM)。
图13描述了通过单一组分比较3组分缓冲系统(精氨酸/柠檬酸/海藻糖)的实际与预测浓度。
图14描述了 4组分缓冲系统(甘露醇/蛋氨酸/组氨酸/吐温 )的纯组分的原始光谱。I轴为光谱强度，X轴为波数cm-1。
图15描述了 4组分缓冲系统(甘露醇/蛋氨酸/组氨酸/吐温 )的纯组分的原始光谱。y轴为光谱强度，X轴为波数cm- 。图5是图4中所示光谱的更详细的视图，其中“指纹”区已被扩大。
图16描述了 4组 分缓冲系统(甘露醇/蛋氨酸/组氨酸/吐温 )的纯组分的SNV/DYDX/均值中心光谱。图6中所示的数据是基于所有预处理:用于强度标准化的标准正态变量(SNV)、用于基线标准化的I阶导数和用于缩放的均值中心化(mean centering)之后，图4-5中所示的相同的数据。
图17描述了采用随机值比较4组分缓冲系统(甘露醇/蛋氨酸/组氨酸/吐温 )的实际与预测浓度。这通过使用现有的模型产生以预测新溶液的浓度。
图18描述了通过单一组分比较3组分缓冲系统(甘露醇/蛋氨酸/组氨酸/吐温 )的实际与预测浓度。
图19描述了含蛋白质的3组分缓冲系统(甘露醇/蛋氨酸/组氨酸/阿达木单抗)的纯组分的原始光谱，原始光谱显示拉曼强度。
图20描述了含蛋白质的3组分缓冲系统(甘露醇/蛋氨酸/组氨酸/阿达木单抗)的纯组分的原始光谱，并详细示出了指纹区(800-1700 cm-1)。
图21描述了纯组分SNV/DYDX/均值中心-含蛋白质的3组分缓冲系统。图11中所示的数据是基于所有预处理:用于强度标准化的标准正态变量(SNV)、用于基线标准化的I阶导数和用于缩放的均值中心化之后，图9-10所示的相同的数据。
图22描述了通过单一组分比较含蛋白质的3组分缓冲系统的实际与预测浓度。
图23描述了利用拉曼光谱作为处理和/或质量控制的一部分的阿达木单抗的纯化过程。
图24描述了涉及缓冲液、糖和氨基酸(蛋氨酸/甘露醇/组氨酸)的三组分混合物的渗滤过程的在线拉曼浓度预测。
图25描述了涉及缓冲液、糖和氨基酸(蛋氨酸/甘露醇/组氨酸)的三组分混合物的重复渗滤过程。为增加分辨率并入额外的数据点。
图26描述了糖(甘露醇)/蛋白质(阿达木单抗)溶液的拉曼校准。
图27描述了渗滤缓冲液交换过程的在线拉曼浓度预测，其中抗体水溶液被甘露醇溶液替换以提供糖/蛋白(甘露醇/阿达木单抗)溶液。缓冲液交换后为蛋白质浓度。
图28描述了图27中所示实验的重复，其中蛋白质浓度相扩展至180 g/L。
图29描述了组氨酸和阿达木单抗溶液的拉曼校准。
图30描述了渗滤缓冲液交换过程的在线拉曼浓度预测，其中蛋白质水溶液被组氨酸溶液替换。组氨酸交换后为阿达木单抗浓度。
图31A-C描述了通过单一组分比较含蛋白质的2组分缓冲系统的实际与预测浓度:A.Tris浓度；B.醋酸盐浓度；和C.阿达木单抗浓度。
图32A-B描述了通过单一组分比较含蛋白质的I组分缓冲系统的实际与预测浓度:A.吐温 浓度；和B.阿达木单抗浓度。
图33描述了当两种抗体(D2E7和ABT-874)采用未修饰蛋白质的光催化交联法(PICUP)分别进行聚集时所使用的条件。该抗体从0-4小时暴露于聚集光源。
图34描述了图33中概述的交联的尺寸排阻色谱结果。
图35描述了拉曼光谱和采用D2E7样品的主成分分析模型化的光谱，表明聚集样品有明显的主成分得分，并且使用拉曼光谱可以将其从聚集体中区分出来。
图36描述了拉曼光谱和采用ABT-874样品的主成分分析模型化的光谱，表明聚集样品有明显的主成分得分，并且使用拉曼光谱可以将其从聚集体中区分出来。
图37A-B描述了拉曼光谱和采用(A) D2E7样品和(B) ABT-974样品的偏最小二乘分析模型化的光谱，表明拉曼光谱结果和SEC测量结果之间的一些相关性。
5.发明详沭 本发明涉及用于抗体(例如单克隆抗体)的色谱纯化的组合物和方法，其采用改进的模拟移动床分离策略。为了清楚起见且非限制性地，该详述分成下述亚部分: 5.1.定义； 5.2.抗体生成； 5.3.抗体制备； 5.4.抗体纯化； 5.5示例性纯化策略；和 5.6拉曼光谱。
5.1.定义 术语“抗体”包括免疫球蛋白分子，其由通过二硫键互连的4条多肽链一一 2条重(H)链和2条轻(L)链组成。每条重链由重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域一一 CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域一一 CL组成。VH和VL区可以进一步再分成称为互补性决定区(CDRs)的高变区，由称为构架区(FR)的更保守区域点缀。每个VH和VL由3个CDRs和4个FRs组成，从氨基末端到羧基末端以下述次序排列:FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
术语抗体的“抗原结合部分”(或“抗体部分”)包括抗体的片段，其保留与抗原特异性结合的能力。已显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段执行。在术语抗体的“抗原结合部分”内包含的结合片段实例包括(i)Fab片段，包括VL、VH、CL和CHl结构域的单价片段；(ii) F (ab’)2片段，包括在铰链区通过二硫键连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)包括VH和CHl结构域的Fd片段；(iv)包括抗体单臂的VL和VH结构域的Fv片段，(V)包括VH结构域的dAb片段(Ward等人，(1989) Nature 341:544-546，其完整教导引入本文作为参考)；和(vi)分离的互补性决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的2个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可以使用重组法通过合成接头进行连接，所述合成接头使得它们能够制备为单一蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird 等人(1988) Science 242:423-426 ;和 Huston 等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85:5879-5883，其完整教导引入本文作为参考)。此种单链抗体也意欲包含在术语抗体的“抗原结合部分”内。还包含其他形式的单链抗体，例如双抗体。双抗体是二价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但使用太短而不允许相同链上的2个结构域之间配对的接头，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，并且产生 2 个抗原结合位点(参见例如,Holliger, P.,等人(1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448 ；Poljak, R.J.，等人(1994) Structure 2:1121-1123，其完整教导引入本文作为参考)。再进一步地，抗体或其抗原结合部分可以是通过抗体或抗体部分与一种或多种其他蛋白质或肽的共价或非共价结合形成的较大免疫粘附素分子的一部分。此种免疫粘附素分子的实例包括使用链霉抗生物素蛋白核心区，以制备四聚scFv分子(Kipriyanov，S.Μ.,等人(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101,其完整教导引入本文作为参考)，以及使用半胱氨酸残基、标记肽和C末端多组氨酸标签，以制备二价和生物素化的 scFv 分子(Kipriyanov, S.Μ.,等人(1994)Mol.Tmmunol.31:1047-1058,其完整教导引入本文作为参考)。抗体部分例如Fab和F(ab’)2片段可以使用常规技术由完整抗体制备，例如完整抗体分别地木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。此外，抗体、抗体部分和免疫粘附素分子可以使用标准重组DNA技术获得，如本文描述的。在一个方面，抗原结合部分是完整结构域或完整结构域对。
术语“ Kabat编号”、“ Kabat定义”和“ Kabat标记”在本文中可互换使用。本领域公认的这些术语是指编号氨基酸残基的系统，所述氨基酸残基比抗体或其抗原结合部分的重和轻链可变区中的其他氨基酸残基更可变(即高变MKabat等人(1971)Ann.NY Acad, Sc1.190:382-391 和 Kabat, E.A.,等人(1991) Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第 5 版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公开号91-3242，其完整教导引入本文作为参考)。对于重链可变区，高变区范围为关于⑶Rl的氨基酸位置31-35、关于⑶R2的氨基酸位置50-65和关于⑶R3的氨基酸位置95-102。对于轻链可变区，高变区范围为关于⑶Rl的氨基酸位置24-34、关于⑶R2的氨基酸位置50-56和关于CDR3的氨基酸位置89-97。
术语“人抗体”包括具有与人种系免疫球蛋白序列对应的可变和恒定区的抗体，如由 Kabat 等人描述的(参见Kabat,等人(1991) Sequences of proteins of ImmunologicalInterest,第 5 版，U.S.Department of Health and Human Services, NIH
发明者S.K.刘, D.董, S.卢 申请人:Abbvie 公司