Kir等位基因及kir-配体的基于分子决定簇的分型的制作方法

专利名称：Kir等位基因及kir-配体的基于分子决定簇的分型的制作方法
技术领域：
本发明涉及进行基于分子决定簇的功能性杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)等位基因分型和配体分型的测定。具体地本发明提供了用于基于KIR2DL1的位置245、HLA-C的位置77以及HLA-B和HLA-A的位置83上的多态性对具有独特功能性质的KIR2DL1和KIR配体的不同等位基因组群进行分型的单核苷酸多态性(SNP)测定的方法、组合物和试剂盒。所述测定适合用于预测健康、疾病和移植中的NK细胞活性。
背景技术：
天然杀伤(NK)和T细胞在针对转化或病毒感染的细胞的免疫力中起着中心和补充作用(Vely等人2001)。NK细胞通过使用控制其激活、增殖和效应子功能的细胞表面受体的集库区分健康与异常细胞(Lanier等人2005)。人NK细胞的标志是I类HLA特异性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的表达(Uhrberg等人2005)。KIR不仅在单个NK细胞的水平上变化性地表达而且它们还是高度多态性和多基因性的，这样，KIR簇的基因含量在个体间是变化的(Uhrberg等人2005)。迄今为止已知存在15个KIR基因(+2个假基因)，11个编码具有两个免疫球蛋白结构域(KIR2D基因)的受体，4个编码具有3个结构域(KIR3D)的受体。KIR家族被进一步分成抑制性KIR和刺激性KIR。抑制性KIR基因的特征在于，特征性的基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序(ITIM)的长细胞质尾(在其名称中通过“L”来表示长)。相反地，刺激性KIR具有缺乏ITIM的短细胞质尾(在其名称中通 过“S”来表示短)，但在跨膜区中具有带电荷的氨基酸，所述氨基酸为激活分子提供了停泊位点(Uhrberg等人2005)。许多人类疾病据报道与KIR基因含量的差异相关，包括自身免疫性疾病、炎症性障碍、感染性疾病、免疫缺乏症、癌症和生殖系统障碍(Kulkarni等人2008)。由于缺乏用于KIR等位基因的不同功能组群的高通量分型的快速方法，此类疾病与KIR的等位基因间的功能异质性之间的关系仍不清楚。在下列参考文献中公开了除其它医学方法外，KIR基因型分型用于移植的用途:Lebedeva 等人，，，Comprehensive Approach to High-Resolution KIR Typing，，HumTmmun., 68 (9): 789-96 (2007) ；Gonzalez 等人，，，Killer Cell Immunoglobulin-LikeReceptor Allele Discrimination by High-Resolution Melting^ HumTmmun., 70 (10): 858-63 (2009) ；Yun 等人，，，A Novel Method for KIR-Ligand Typingby Pyrosequencing To Predict NK Cell Alloreactivity”Blood (ASH Annual MeetingAbstracts)106:Abstractl407(2005)(也参见 Yun 等人，”A Novel Method forKIR-Ligand Typing by Pyrosequencing To Predict NK Cell Alloreactivity，，ClinImmunol.123 (3): 272-280 (2007).) ；Leung 等人，，，Comparison of Killer Ig-LikeReceptor Genotyping and Phenotyping for Selection of Allogeneic Blood StemCell Donors，，J Immun.174:6540-6545 (2005) ；Dinauer 等人，，，Primers, Methods andKits For Detecting Killer-Cell Immunoglobulin-Like Receptor Alleles，， 美国专利申请公布号US2008/0280289 (也参见国际申请公布号W02005/046459选择的部分；和 KIR Genotyping Product Brochure2004.) ；Chen 等人，”Natural KillerImmunoglobul in-Like Receptor (KIR) Assay ”国际申请公布号 W02009/051672。也参见 PCT/US2008/011671 ;Trachtenberg 等人，”Methods and Compositions For KIR Genotyping^美国专利申请公布号US2008/0213787 (也参见国际申请公布号W02007/041067.)；Houtchens 等人，，，High-Throughput Killer Cell Immunoglobulin-Like ReceptorGenotyping By MALD1-TOF Mass Spectrometry With Discovery of Novel Alleles，，Immunogenetics.59 (7): 525-37 (2007).；Gomez-Lozano 等人，，，Genotyping of HumanKiller-Cell Immunoglobulin-Like Receptor Genes by Polymerase Chain Reactionwith Sequence-Specific Primers:An Update” Tissue Antigens 59 (3):184-193(2002)；和Shilling等人，，，Allelic Polymorphism Synergizes with Variable Gene Content toIndividualized Human KIR Genotype，，J Immunol.168:2307-2315 (2002)。将所述每一篇参考文献通过引用整体并入本文。此外，一些可获得的KIR基因分型试剂盒包括Inno-Train, ”KIR-Ready Gene”产品手册 9/2005 ；Miltenyi Biotec, ”KIR 分型试剂盒”产品手册 2009 ；Invitrogen, ”KIR 基因分型SSP试剂盒”产品手册11/2006 ;和Tepnel Lifecodes, ”KIR分型”6/2005。将所述每一个产品手册通过引用整体并入本文。因此，由于疾病易感性与各种KIR配体群(constellation)关联以及等位基因分型在移植的成功中起着重要作用，所以需要用于检测KIR及其配体的分子决定簇的新型方法、组合物和试剂盒。发明概述本发明涉及进行基于分子决定簇的功能性杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)等位基因分型和配体分型的测定。具体地，本发明`提供了用于基于KIR2DL1的位置245、HLA-C的位置77以及HLA-B和HLA-A的位置83上的多态性对具有独特功能性质的KIR2DL1和KIR配体的不同等位基因组群进行分型的单核苷酸多态性(SNP)测定的方法、组合物和试剂盒。所述测定适合用于预测健康、疾病和移植中的NK细胞活性。杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)调节NK细胞功能。KIR及其HLA配体在自然界中是高度多态的，具有大量等位基因多态性。目前，不存在利用相关功能信息进行KIR-和HLA-等位基因分型的方便方法。在一个实施方案中，本发明涉及基于位置245上的多态性对具有独特功能性质的KIR2DL1的不同等位基因组群进行分型的单核苷酸多态性(SNP)测定。在一个实施方案中，本发明涉及基于HLA-C的位置77以及HLA-B和-A的位置83上的多态性对不同KIR-配体进行分型的SNP测定。据信，用于KIR和KIR-配体分型的本SNP测定远较现有的高分辨率分型便宜和快速得多。重要地，本高通量法提供了在预测健康、疾病和移植中的NK细胞活性中的信息性结果。无意将本发明限定于KIR等位基因分型，在一个实施方案中，本发明涉及探针，所述探针包含选自SEQ.1D.NO:9的核酸序列、SEQ.1D.NO: 10的核酸序列、与SEQ.1D.NO:9具有大于98%的同源性的核酸序列、与SEQ.1D.NO: 10具有大于98%的同源性的核酸序列、与SEQ.1D.N0:9具有大于95%的同源性的核酸序列、与SEQ.1D.NO: 10具有大于95%的同源性的核酸序列、与SEQ.1D.NO:9具有大于90%的同源性的核酸序列、与SEQ.1D.NO: 10具有大于90%的同源性的核酸序列的核酸序列，其中所述探针能够区分编码KIR2DL1的位置245上的精氨酸和半胱氨酸的核酸序列的存在与不存在。在另一个实施方案中，本发明提供了试剂盒，其包括:a)提供:1.来自上述的探针和i1.使用说明书。在另一个实施方案中，本发明提供了方法，其包括:a)提供:1.来自受试者的样品，其中所述样品包括编码KIR的核酸；i1.多个引物，其中所述引物能扩增KIR2DL1的所有等位基因；ii1.多个探针，其中所述探针能识别编码位置245上的精氨酸和半胱氨酸的核酸序列的存在；和幻将所述样品与所述引物接触足以扩增KIR2DL1的所有等位基因的足量时间；和c)利用所述多个探针测定编码精氨酸和半胱氨酸的核酸序列的存在和不存在。在一些实施方案中，所述方法还包括:取决于精氨酸的编码序列的存在，利用第一疗法治疗受试者。在其它实施方案中，所述方法还包括:取决于半胱氨酸的编码序列的存在，利用第二疗法治疗受试者。在另一个实施方案中，本发明提 供了试剂盒，其包括:a)提供:1.用于KIR分型的多个引物和多个探针，其中所述分型包括区分编码KIR2DL1的位置245上的精氨酸和半胱氨酸的核酸序列的存在和不存在；和i1.使用说明书。在另一个实施方案中，本发明提供了探针，所述探针包含选自SEQ.1D.N0:7的核酸序列、SEQ.1D.N0:8的核酸序列、与SEQ.1D.N0:7具有大于98%的同源性的核酸序列、与SEQ.1D.NO:8具有大于98%的同源性的核酸序列、与SEQ.1D.N0:7具有大于95%的同源性的核酸序列、与SEQ.1D.NO:8具有大于95%的同源性的核酸序列、与SEQ.1D.NO: 7具有大于90%的同源性的核酸序列、与SEQ.1D.N0:8具有大于90%的同源性的核酸序列列的核酸序列，其中所述探针能够区分编码HLA-C1/C2的位置77上的丝氨酸和天冬酰胺的核酸序列的存在和不存在。在一些实施方案中，本发明提供了试剂盒，其包括:a)提供:1.上述探针；和
i1.使用说明书。在另一个实施方案中，本发明提供了方法，其包括:a)提供:1.来自受试者的样品，其中所述样品包括编码KIR配体的核酸；i1.多个引物，其中所述引物能扩增HLA-C1/C2的所有等位基因多个探针，其中所述探针能识别编码HLA-C1/C2的位置77上的丝氨酸和天冬酰胺的核酸的存在；和《将所述样品与所述引物接触足以扩增HLA-C1/C2的所有等位基因的足量时间；和c)利用所述多个探针测定编码丝氨酸和天冬酰胺的核酸序列的存在和不存在。在一些实施方案中，所述方法还包括:取决于丝氨酸的编码序列的存在，利用第一疗法治疗受试者。在一些实施方案中，所述方法还包括:取决于天冬酰胺的编码序列的存在，利用第二疗法治疗受试者。在另一个实施方案中，本发明提供了试剂盒，包括:a)提供:1.用于KIR配体分型的多个引物和多个探针，其中所述分型包括区分编码HLA-C1/C2的位置77上的丝氨酸和天冬酰胺的核酸序列的存在和不存在；和i1.使用说明书。在另一个实施方案中，本发明涉及探针，所述探针包含选自SEQ.1D.NO:3的核酸序列、SEQ.1D.N0:4的核酸序列、与SEQ.1D.N0:3具有大于98%的同源性的核酸序列、与SEQ.1D.N0:4具有大于98%的同源性的核酸序列、与SEQ.1D.N0:3具有大于95%的同源性的核酸序列、与SEQ.1D.NO:4具有大于95%的同源性的核酸序列、与SEQ.1D.NO: 3具有大于90%的同源性的核酸序列、与SEQ.1D.N0:4具有大于90%的同源性的核酸序列列的核酸序列，其中所述探针能够区分编码HLA-Bw4和HLA-A中的精氨酸以及HLA_Bw6的位置83上的甘氨酸的核酸序列的存在和不存在。在另一个实施方案中，本发明提供了试剂盒，其包括:a)提供:1.来自上面的探针:和i1.使用说明书。在另一个实施方案中，本发明涉及方法，其包括:a)提供:1.来自受试者的样品，其中所述样品包含编码KIR配体HLA-B和-A的核酸；i1.多个引物，其中所述引物能扩增HLA-B/A的所有等位基因；ii1.多个探针，其中所述探针能识别编码HLA-Bw4和HLA-A中的精氨酸以及HLA-Bw6的位置83上的甘氨酸的核酸的存在；和b)将所述样品与所述引物接触足以扩增HLA-B/A的所有等位基因的足量时间；和(3)使用所述多个探针测定编码精氨酸和甘氨酸的核酸序列的存在和不存在。在一些实施方案中，所述方法还包括:取决于精氨酸的编码序列的存在，利用第一疗法治疗受试者。在一些实施方案中，所述方法还包括:取决于甘氨酸的编码序列的存在，利用第二疗法治疗受试者。在其它实施方 案中，本发明提供了试剂盒，包括:a)提供:1.用于KIR配体分型的多个引物和多个探针，其中所述分型包括区分编码HLA-Bw4和HLA-A中的精氨酸以及HLA-Bw6的位置83上的甘氨酸的核酸序列的存在与不存在；和i1.使用说明书。虽然提供了特定的正向和反向引物以及探针，但所述特定的序列并不意味着是限定性的，并且包括本领域技术人员已知的互补和反向互补(有义和反义串，相当的身份(具有约70-100%，优选约80-100%，更优选约85-100%，更优选约90_100%，最优选约95-100%的相似性和同一性)、同源物、模拟物、其部分/片段，5’ -3’或3’ -5’的顺序)序列。此外，所显示的实施方案的描述无意是限定性的，并且包括本领域技术人员已知的所有等同物、相当的技术、试剂、来源、稀释剂、用途等。此外，KIR等位基因分型和配体分型预期与哺乳动物的基因组内的其它多态性基因座的应用一起，被广泛地用于疾病检测/诊断、管理以及治疗性/非治疗性处理。例如，仅举例说明但无意是限定性的，更具体地人，而且还包括狗、猫、马、大鼠、小鼠、仓鼠、牛、绵羊、山羊、猪等等其它非人动物。附图概述

图1显示基于分子决定簇的KIR分型预测NK细胞活性。使用Automacs (MiltenyiBiotech)从供体PBMC分离⑶56+细胞。将分离的⑶56+细胞与靶721.221_Cw7或721.221-Cw6混合。在进行⑶107标记程序后，利用不同的KIR mAb对细胞进行染色。对KIR2DL1+NK细胞亚组进行门控，使用流式细胞术检测⑶107的表面表达。(A).在无任何靶细胞的情况下，NK细胞上的CD107的表面表达；(B).KIR2DL1R245/R245阳性NK细胞亚组针对表达KIR2DL1非配体HLA-Cw7的721.221细胞的脱粒；(C).KIR2DL1R245/R245阳性NK细胞亚组针对表达KIR2DL1配体HLA_Cw6的721.221细胞的脱粒；(D).KIR2DL1C245/C245阳性NK细胞亚组针对表达KIR2DL1非配体HLA_Cw7的721.221细胞的脱粒；(E).KIR2DL1C245/C245阳性NK细胞亚组针对表达KIR2DL1配体HLA_Cw6的721.221细胞的脱粒。图2显示KIR-配体组群分型预测NK细胞活性。利用⑶45预标记供体PBMC并且与K562混合。使用抗KIR mAb门控单个KIR+NK细胞亚组。图框的顺序显示单个KIR+(前两个图框)的门控策略和KIR2DLI + (最下方的图框)NK细胞亚组的脱粒。图3显示利用⑶45预标记的并且与K562混合的供体PBMC。如图2中所述对单个KIR+NK细胞亚组进行门控。(A).KIR2DL2/2DL3+亚组的脱粒；(B).KIR3DL1+亚组的脱粒；和(C).5个供体KIR2DL1+和KIR2DL2/2DL3+NK细胞亚组对K562细胞的反应性。图4显示NK细胞亚组的反应性可基于KIR配体组群分型来预测。使用SNP测定进行供体细胞的KIR-配体分型，随后预测NK细胞许可(licensing)。使用抗KIR mAb对单个KIR+NK细胞亚组进行门控，使用⑶107标志测量NK细胞脱粒。测定NK细胞亚组对异位表达它们的配体的靶细胞的反应性。显示了(A).驯化(左图框，P值〈0.05)和未驯化(右图框)的KIR2DL1+NK细胞亚组对表达其配体Cw6或非配体Cw7的721.221细胞的反应性；和(B)驯化(左图框，P值〈0.05)和未驯化(右图框)的KIR2DL2/2DL3+NK细胞亚组对表达其非配体Cw6或配体Cw7的721.221的反应性。图5显示了 KIR2DL1的功能组群分型。从供体PBMC提取DNA。基于单核苷酸多态性设计用于KIR2DL1等位基因的不同功能组群的探针。设计可特异性扩增KIR2DL1的所有等位基因的引物。使用来自Applied Biosystems的HT7900进行KIR2DL1等位基因分型。KIR2DL1C245/C245 以蓝点显示；KIR2DL1R245/C245 以绿点显示;KIR2DL1R245/R245 以红点显示;阴性对照显示为黑框；未确定的显示为黑色X。图6显示KIR配体的功能组群分型。从供体PBMC提取DNA。基于单核苷酸多态性设计用于对KIR-配体分型的探针。A)KIR2DL1和KIR2DL2/2DL3配体HLA-C的分型，(HLA-C2/HLA-C2以蓝点 显示；HLA-C1/HLA-C2以绿点显示；HLA-CI/HLA-CI以红点显示；阴性对照显示为黑框；B)KIR3DL1配体HLA-Bw4的分型(HLA-Bw4/HLA_Bw4以蓝点显示；HLA_Bw4/HLA-Bw6以绿点显示；HLA-Bw6/HLA-Bw6以红点显示；阴性对照显示为黑框)。定义为了有利于理解本发明，下面定义了许多术语(在本定义部分中在引号中显示的)。本文中定义的术语(除非另有所指)具有与与本发明相关的领域内的技术人员通常理解的含义相同的含义。除非另外指出，否则说明书和权利要求中使用的表达成分、性质例如分子量、反应条件等等的量的所有数字将被理解为在所有情况下由术语“约”修饰。因此，除非相反地指出，否则说明书和权利要求中的数字参数是取决于试图通过本发明获得的期望性质可变化的近似值。最起码，并且未将等同原则的应用限制到权利要求的范围，每一个数值参数应当至少根据报告的有效数字的数目并应用常用舍入技术来解释。尽管描述本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但在具体的实施例中尽可能精确地报告数值。然而，任何数值固有地包含必定由在数值的测试测量中发现的误差引起的标准差。如本文中所用，术语”试剂盒〃是指用于递送材料的任何递送系统。在反应测定的上下文中，此类递送系统包括允许贮存反应试剂(例如，适当的容器中的寡核苷酸、酶等)和/或支持材料(例如，缓冲液、用于进行测定的书面说明书等)、将所述反应试剂和/或支持材料从一个位置运输或递送至另一个位置的系统。例如，试剂盒包括一个或多个包含相关反应试剂和/或支持材料的外壳(例如，盒子)。如本文中所用，术语”分散试剂盒(fragmented kit) 〃是指包括两个或更多个单独容器的递送系统,每一个容器包含总试剂盒组分的子部分。可将容器一起或单独地递送至期望的受者。例如，第一容器可包含用于测定的酶，而第二容器包含寡核苷酸。术语”分散试剂盒〃意欲包括包含联邦食品、药品和化妆品法(Federal Food, Drug, and Cosmetic Act)的第520(e)节下规定的分析物特异性试剂(ASR)(但不限于其)的试剂盒。事实上，包含两个或更多个单独的容器(各自包含总试剂盒组分的子部分)的任何递送系统包括在术语”分散试剂盒"内。相反地，"组合试剂盒(combined kit) 〃是指在单个容器中(例如,在装有每一种期望的组分的单个盒子中)包含反应测定的所有组分的递送系统。术语”试剂盒"包括分散和组合试剂盒。如本文中所用，术语”受试者〃或〃患者〃是指可对其施用根据本发明的组合物(例如，为了实验、诊断、预防和/或治疗目的)的任何生物。典型受试者包括动物(例如，哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和人；昆虫；蠕虫等)。如本文中所用，术语”单核苷酸多态性〃或"SNP"，是指沿着核苷酸序列具有一个或多个变体核苷酸的任何位置。单核苷酸多态性(SNP)是在人基因组中发现的DNA序列变异的最常见形式，通常定义为与作为人基因组计划的一部分产生的基线参照DNA序列的差异，或定义为在从一般群体抽取的个体的亚组之间发现的差异。当比较两个随机选择的人染色体时，SNP以约1SNP/1000个碱基对的平均比率发生。可鉴定极罕见的SNP (其可被限制于特定的个体或家族)，或相反地，可发现极罕见的SNP在一般人群中是极普通的(存在于许多不相关的个体中)。SNP可因DNA复制中的错误(S卩，自发地)或因诱变剂(即，来自特定的DNA损伤物质)而增加，并且可在生物的繁殖过程中传递给个体的后代。如本文中所用，术语”基因〃是指包含产生多肽、前体或RNA(例如，rRNA、tRNA)所必需的编码序列的核酸(例如，DNA)序列。多肽可由全长编码序列或由编码序列的任何部分编码，只要全长或片段的期望的活性或功能性质(例如，酶促活性、配体结合、信号转导、免疫原性等)得到保留即可。该术语还包括结构基因的编码区以及与编码区的5’和3’末端相邻的序列(所述相邻的序列在任一末端延续约IKB或更长的距离，以便基因相应于全长mRNA的长度)。位于编码区的5’并且存在于mRNA上的序列称为5’非翻译序列。位于编码区的3’或下游并且存在于mRNA上的序列称为3’非翻译序列。术语”基因〃包括基因的cDNA和基因组形式。 基因的基因组形式或克隆包含被称为“内含子”或“间插区(intervening region) ”或“间插序列”的非编码序列打断的编码区。内含子是基因的被转录为核RNA(hnRNA)的区段；内含子可包含调控元件例如增强子。可从细胞核或初级转录物除去或“剪接掉”内含子；内含子因而不存在于信使RNA (mRNA)转录物中。mRNA在翻译过程中用于指定新生多肽的氨基酸的序列或顺序。如本文中所用，术语”异源基因"是指不在其天然环境中的基因。例如，异源基因包括被引入另一物种的来自一个物种的基因。异源基因还包括已以一定的方式(例如，突变、多个拷贝的添加、连接至非天然调控序列等)改变的对于生物而言为天然的基因。异源基因与内源基因的区别在于:异源基因序列通常被连接至那些发现在染色体中与所述基因序列非天然联接的DNA序列或与非在自然界中发现的染色体的部分联接(例如，在基因通常不在其中表达的基因座中表达的基因)。如本文中所用，术语”转基因〃是指被整合进入生物(例如，非人动物)的基因组并且在有性生殖过程中被传递给生物的后代的异源基因。如本文中所用，术语〃互补的〃或〃互补性〃用于指通过碱基配对法则发生关系的多核苷酸(即，核苷酸的序列)。例如，对于序列” 5’ -A-G-T-3’ 〃，其与序列〃3’ -T-C-A-5’ 〃互补。互补性可以是“部分的”，其中核酸的碱基中仅有一些按照碱基配对法则进行匹配。或者，核酸之间存在“完全”或“总的”互补性。核酸链之间的互补性程度对核酸链间的杂交效率和强度具有重大影响。这在扩增反应以及依赖于核酸之间结合的检测方法中是特别重要的。如本文中所用，术语”同源性〃是指互补性的程度。存在部分同源性或完全同源性(即，同一性)。部分互补序列是至少部分地抑制完全互补核酸分子与靶核酸杂交的核酸分子，其是“大体上同源的”。完全互补的序列对靶序列的杂交的抑制可在低严格度条件下使用杂交测定(Southern或Northern印迹、溶液杂交等)来检查。大体上同源的序列或探针将在低严格度条件下竞争和抑制完全同源的核酸分子对靶的结合(即杂交)。这并非说低严格度条件是允许非特异性结合的条件；低严格度条件要求两个序列彼此的结合是特异性(即，选择性)相互作用。非特异性结合的不存在可通过使用大体上非互补的(例如，低于约30%的同一性)的第二靶来测试；在非特异性结合不存在的情况下，探针将不与第二非互补革El杂交。如本文中所用，术语”聚合酶链式反应〃 ("PCR")是指描述用于在DNA混合物中增加靶序列的区段的浓度而无需克隆或纯化的方法的K.B.Mullis美国专利N0.4，683，195、4，683，202和4，965，188 (通过引用并入本文)的方法。因为靶序列的期望的扩增区段在混合物中成为占优势的序列(就浓度而言)，因此它们被称作是“PCR扩增的”。类似地，如本文中所用，术语”改良PCR"是 指其中在RNA聚合酶存在的情况下从DNA模板扩增RNA序列或在逆转录酶存在的情况下从RNA模板扩增DNA序列的扩增方法。如本文中所用，术语”严格度〃用于指温度、离子强度以及存在其它化合物例如有机溶剂的条件，在该条件下进行核酸杂交。“严格度”通常在约Tm至低于Tm约20° C至25。C的范围内发生。“严格杂交”可用于鉴定或检测相同的多核苷酸序列或鉴定或检测相似或相关的多核苷酸序列。例如，当在严格条件下将片段用于杂交反应时，有利于包含独特序列(即，为非同源的或包含低于约50%的同源性或互补性的区域)的片段的杂交。或者，当使用“弱的”或“低”严格度的条件时，对于来源于通常在遗传上是多样的生物的核酸(即，例如，互补序列的频率在此类生物之间通常较低)，杂交可发生。“低严格度条件”包括这样的条件，所述条件等同于在42 ° C下于由5x SSPE (43.8g/l NaCl, 6.9g/l NaH2PO4.H2O 和 1.85g/l EDTA,利用 NaOH 调整至
7.4 的 pH)、0.l%SDS、5x Denhardt's 试剂{每 500ml 的 50x Denhardt's 包含:5gFicoll (Type400, Pharmacia), 5g BSA (Fraction V ；Sigma)}和 100 μ g/ml 变性鲑精 DNA 组成的溶液中结合或杂交，随后在42° C下于包含5x SSPE、0.1%SDS的溶液中洗涤(当使用长度约500个核苷酸的探针时)。许多等同条件还可用于包括低严格度条件；因素例如探针的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)和靶的性质(存在于溶液中的或固定的DNA、RNA、碱基组成等)和盐及其它组分的浓度(例如，甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在或不存在)以及杂交溶液的组分可以变化，以产生与上文所列的条件不同但与其等同的低严格度杂交的条件。此外，还可使用在高严格度条件下促进杂交的条件(例如，增加杂交和/或洗涤步骤的温度，在杂交溶液中使用甲酰胺等)。〃中等严格度条件"，当用于指核酸杂交时，包括这样的条件，所述条件等同于在42°C下于由 5X SSPE (43.8g/l NaCl, 6.9g/l NaH2PO4H2O 和 1.85g/l EDTA,利用 NaOH 调整至7.4的pH)、0.5%SDS、5XDenhardt’ s试剂和100 μ g/ml变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，随后在42°C下于包含1.0X SSPEU.0%SDS的溶液中洗涤(当使用长度为约500个核苷酸的探针时)。〃高严格度条件"，当用于指核酸杂交时，包括这样的条件，所述条件等同于在42°C下于由 5X SSPE (43.8g/l NaCl, 6.9g/l NaH2PO4H2O 和 1.85g/l EDTA,利用 NaOH 调整至7.4的pH)、0.5%SDS、5X Denhardt's试剂和100 μ g/ml变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，随后在42°C下于包含0.1X SSPEU.0%SDS的溶液中洗涤(当使用长度为约500个核苷酸的探针时)。如本文中所用，术语”杂交〃用于指通过使用任何方法(通过所述方法，核酸的链通过碱基配对与互补链结合形成杂交复合物)进行的互补核酸的配对。杂交和杂交的强度(即，核酸之间缔合的强度)受这样的因素如核酸之间的互补性程度、使用的条件的严格度、形成的杂交体的Tni以及核酸内的g:c比率影响。 如本文中所用，术语“杂交复合物”是指通过互补的G与C碱基之间以及互补的A与T碱基之间的氢键的形成在两个核酸序列之间形成的复合物；这类氢键可通过碱基堆积相互作用被进一步稳定。两个互补的核酸序列的氢键以反向平等构型存在。杂交复合物可在溶液(例如，Cd或RJ分析)中或在存在于溶液中的一个核酸序列与固定至固体载体(例如，用于Southern和Northern印迹、斑点印迹中的尼龙膜或硝酸纤维素滤膜或原位杂交包括FISH(荧光原位杂交)中使用的载玻片)的另一个核酸序列之间形成。如本文中所用，术语”Tm"用于指“解链温度”。解链温度是一群双链核酸分子一半分离成单链时的温度。如通过标准参照预测的，当核酸存在于IM NaCl的水溶液中时，Tm值的简单估计可利用公式:Tm=81.5+0.41 (%G+C)来计算。Anderson等人，”QuantitativeFilter Hybridization”In:Nucleic Acid Hybridization(1985)。更复杂的计算要考虑结构以及序列特征来计算Tm。如本文中所用，术语”可扩增的核酸"用于指可通过任何扩增方法扩增的核酸。“可扩增的核酸”通常包括“样品模板”。如本文中所用，术语”样品模板”是指针对目标靶序列的存在对其进行分析的源自样品的核酸。相反地，“本底模板”用于指除样品模板外的核酸，其可以存在于或可以不存在于样品中。本底模板最常见地是不经意的。其可以是遗留物(carryover)的结果，或其可由于试图从样品纯化掉的核酸污染物的存在而引起。例如，来自除待检测的生物外的生物的核酸可作为本底存在于测试样品中。如本文中所用，术语”引物"是指寡核苷酸(无论是天然存在的(如在纯化的限制酶切消化物中)还是合成产生的)，当置于其中诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下(即，在核苷酸和诱导剂例如DNA聚合酶存在的情况下以及在适当的温度和pH下)时，其能够用作合成起始的点。为了扩增的最大效率，引物优选是单链的，但可选择地是双链的。如果是双链的，则首先处理引物以在用于制备延伸产物之前将其链分开。优选地，弓丨物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够地长以在诱导剂存在的情况下引发延伸产物的合成。引物的确切长度可取决于许多因 素，包括温度、引物的来源和方法的使用。如本文中所用，术语”探针"是指寡核苷酸(S卩，核苷酸的序列)(无论是天然存在的(如在纯化的限制酶切消化物中)还是合成地、重组地或通过PCR扩增产生的)，其能够与另一个目的寡核苷酸杂交。探针可以是单链或双链的。控制用于检测、鉴定和分离特定基因序列。考虑到本发明的中使用的任何探针将用任何“报告分子”标记，以便其在任何检测系统中可被检测到，包括但不限于酶(例如，ELISA，以及基于酶的组织化学测定)、荧光、放射性和发光系统。本发明无意被限定于任何特定的检测系统或标记物。如本文中所用，术语"限制性核酸内切酶"和"限制性内切酶"是指细菌的酶，其每一种在特定的核苷酸序列上或附近切割双链DNA。DNA分子被称作具有"5’末端〃和"3’末端"，因为单核苷酸以这样的方式反应来产生寡核苷酸，所述方式使得一个单核苷酸的戊糖环的5’磷酸通过磷酸二酯键以一个方向连接至其相邻戊糖环的3’氧。因此，如果寡核苷酸的5’磷酸未连接至单核苷酸的戊糖环的3’氧，则该末端称为〃5’末端"。如果寡核苷酸的3’氧未连接至另一个单核苷酸的戊糖环的5’磷酸，则该末端称为"3’末端"。如本文中所用，核酸序列，即使在更大寡核苷酸的内部，也可被称作具有5’和3’末端。在线性或环状DNA分子中，分散元件(discreteelement)被称为在“下游”或3’元件的“上游”或5’。该术语反映下列事实:转录以5’至3’的方式沿着DNA链进行。指导连接的基因的转录的启动子和增强子元件通常位于编码区的5’或上游。然而，增强子元件，当位于启动子元件和编码区的3’时，可发挥其作用。转录终止和多腺苷酸化信号位于编码区的3’或下游。如本文中所用，术语”核酸序列"是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸以及其片段或部分，并且反之亦然，以及指基因组或合成来源的DNA或RNA，其可以是单链或双链的，并且代表有义或反义链。类似地，如本文中所用，“氨基酸序列”是指肽或蛋白质序列。

如本文中所用，术语”反义〃，当用于指DNA时，是指与DNA双链的有义链互补的序列。DNA双链体的〃有义链〃是指DNA双链体中被细胞以其天然的状态转录成“有义mRNA”的链。因此，"反义"序列是与DNA双链体中的非编码链具有相同序列的序列。如本文中所用，术语”扩增试剂"是指除引物、核酸模板以及扩增酶外进行扩增所需要的那些试剂(脱氧核糖核苷三磷酸、缓冲液等)。通常，将扩增试剂与其它反应组分一起置于和装于反应容器(试管、微孔等)中。如本文中所用，术语”寡核苷酸"是指短的长度的单链多核苷酸链。寡核苷酸的长度通常少于200个核苷酸(例如，15至100个)，然而，如本文中所用，该术语还意欲包括更长的多核苷酸链。寡核苷酸通常根据其长度来称呼。例如，24个残基的寡核苷酸被称为“24聚体”。寡核苷酸可通过自身杂交(self-hybridizing)或通过与其它多核苷酸杂交来形成二级和三级结构。此类结构可包括但不限于双链体、发夹、十字形结构(cruciform)、弯曲(bend)和三链体。如本文中所用，术语”载体"是指用于将核酸序列从一个细胞转移至另一个细胞或从一个生物转移至另一个生物的系统，包括但不限于将包含核酸序列的组合物递送至细胞或组织的任何方法。例如，载体包括但不限于质粒(例如，pcDNA3.1)、人工染色体、细菌、真菌和病毒(例如，逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒以及其它基于核酸的递送系统等)。如本文中所用，术语〃表达载体〃、〃表达构建体〃、〃表达盒〃和〃质粒〃是指这样的重组核酸分子，所述核酸分子包含期望的编码序列和在特定宿主生物中表达有效连接的编码序列所必需的适当的核酸序列。序列可以是双链的或单链的。在原核生物中表达所必需的核酸序列通常包括通常与其它序列一起的启动子、操纵子(任选的)和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、增强子以及终止和多腺苷酸化信号。如本文中所用，术语〃以有效的组合"、〃以有效的顺序〃和〃有效连接的〃是指以这样的方式连接核酸序列以便产生能够指导给定的基因转录和/或期望的蛋白质分子合成的核酸分子。该术语还指以这样的方式连接氨基酸序列以便产生功能性蛋白质。如本文中所用，术语”转染〃是指外源核酸(例如，DNA)至细胞内的引入。转染可通过本领域已知的多种方法(包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂转染、原生质体融合、逆转录病毒感染、基因枪法(biolistics)(即,微粒轰击)等)来实现。

如本文中所用，术语”抗体"是指由免疫原(抗原)在动物中引发的免疫球蛋白。期望抗体显示针对免疫原中包含的表位的特异性。术语”多克隆抗体〃是指从超过一个浆细胞克隆产生的免疫球蛋白；相反地“单克隆抗体”是指从单个浆细胞克隆产生的免疫球蛋白。抗体包括但不限于重组地制备的和修饰的抗体及其抗原结合片段，例如嵌合抗体、人源化抗体、多功能抗体、双特异性或寡特异性抗体、单链抗体以及(Fab)或F(ab)2片段。如本文中所用，术语"特异结合"和“特异性结合"，当用于指抗体与蛋白质或肽的相互作用时，意指该相互作用依赖于蛋白质上的特定结构(即，例如，抗原决定簇或表位)的存在；换句话说，抗体识别和结合特定的蛋白质结构而非结合整个蛋白质。例如，如果抗体是特异于表位“A”的，那么包含表位A(或游离的未标记的A)的蛋白质在包含标记的“A”和抗体的反应中的存在将减少结合至抗体的标记的A的量。如本文中所用，术语“FACS”、“流式细胞术”和“荧光激活细胞分选仪”可互换使用，并且广义地指用于测量和分析当颗粒在液流中流过光束时由它们产生的信号的系统。例如，仅举例说明而无意是限定性的，人外周血单核细胞(PBMC)具有可直接荧光染色或使用利用荧光染料标记的抗体间接荧光染色的表面标志。当染色的细胞通过光束时，它们产生被捕获并且展现在屏幕上的信号。信号包括前向散射(基于尺寸折射的光)、侧向散射(基于粒度而偏离的光)以及从染料产生的突光(参见，Givan, A.L.，’Tlow Cytometry FirstPrinciples,第2版，2001,通过引用并入本文)。如本文中所用，术语”检测测定"是指用于检测变体核酸序列(例如，亚型、多态性或突变)在给定的等位基因或核酸中存在或不存在的测定(例如，KIR等位基因分型)。如本文中所用，术语“功能性许可”、“许可”和“驯化”可互换使用并且是指NK细胞能够区分或识别自我与非我的过程。更具体地，例如仅举例说明而无意是限定的，NK细胞根据表面HLA分子的存在或不存在识别自我与非自我之间的差异。具有针对自我HLA配体的受体的NK细胞是“许可的”并且作好了杀死具有丢失的HLA配体的靶细胞的准备。如本文中所用，术语〃细胞培养物〃是指细胞的任何体外培养物。包括在该术语中的是连续细胞系(例如，具有永生化表型)、原代细胞培养物、转化的细胞系、有限细胞系(finite cell line)(例如,非转化细胞)以及体外维持的任何其它细胞群体。如本文中所用，术语”样品〃在其最广义上使用，包括环境和生物样品。环境样品包括来自环境例如土壤和水的材料。生物样品可以是动物，包括人、液体(例如，血液、血浆和血清)、固体(例如，粪便)、组织、液体食物(例如，奶)以及固体食物(例如，蔬菜)。例如，肺样品可通过支气管肺泡灌洗(BAL)来收集，其包括来源于肺组织的液体和细胞。生物样品可包括细胞、组织提取物、体液、从细胞分离的染色体或染色体外元件、基因组DNA(溶液中的或结合至固体载体的，例如用于Southern印迹分析)、RNA(溶液中的或结合至固体载体的，例如用于Northern印迹分析)、cDNA(溶液中的或结合至固体载体的)等。如本文中所用，术语”疗法"以其最广义使用，包括对自身免疫疾病、移植相关障碍、炎症性障碍、感染性疾病、免疫缺乏症、癌症和生殖系统障碍的治疗。具体的治疗将取决于待治疗的病况和受试者的医学需要。本发明无意仅限定于其中疾病被治愈的疗法或治疗。在一些实施方案中，通过这样的治疗减轻疾病的一个或多个症状就足够了，例如，减轻炎症，缓解发热，减少感染，抑制癌症生长等。在其它实施方案中，患者的一个或多个病况通过治疗得到改善就足够了，例如改善免疫功能。发明详述天然杀伤(NK)细胞是先天性免疫系统的成员，它们对于感染控制(Lodoen等人2006 ；Cerwenka 等人 2001)、癌症监测(Caligiuri, MA2008 ；ffaldhauer 等人 2008 ；Kim 等人2007)和成功怀孕(Santoni等人2008 ;Moffett-King, A.2002)是非常重要的。NK细胞功能受存在于细胞表面上的各种激活和抑制性受体调节(Lanier，LL2008)。抑制性受体的主要种类是杀伤免疫球蛋白样受体(KIR) (Long等人1996 ;Parham，P.2008)，其在自然界中是高度多态的(Robinson等人2007)。等位基因多态性在相同KIR基因的等位基因间产生功能异质性。例如，先前已显示在氨基酸位置245上具有精氨酸的KIR2DL1等位基因，当与在相同位置上具有半胱氨酸的等位基因相比较时，具有更高的抑制性活性以及在相同的配体衔接(engagement)后更持久的表面表达(Bari等人2009)。还已报道KIR3DL1的不同等位基因具有不同的对稳态细胞表面表达的抑制性能力和水平(Yawata等人2006)。一些其它的KIR也在其等位基因间显示可区别的功能差异(Steiner等人2008 ；Goodridge等人2007 ；Carr等人2005)，尽管确切的分子决定簇还未被阐明。许多人类疾病据报道与KIR基因含量的差异相关，包括自身免疫疾病、炎症性障碍、感染性疾病、免疫缺乏症、癌症和生殖系统障碍(Kulkarni等人20 08)。由于缺乏用于KIR等位基因的不同功能组群的高通量分型的方便方法，此类疾病与KIR的等位基因间的功能异质性之间的关系还不清楚。KIR以独特的特异性识别高度多态的人白细胞抗原(HLA)I类蛋白(Long等人1996 ；Parham, P.2006)。当抑制性KIR识别它们在靶细胞上的特异性配体时，NK细胞功能被抑制。例如，KIR2DL1和KIR2DL2/2DL3识别同种异型的HLA-C，而KIR3DL1识别同种异型的HLA-B和-A。基于成熟蛋白质的氨基酸位置80上的天冬酰胺或赖氨酸的存在，HLA-C配体被分成两大组群(分别是HLA-Cl和HLA-C2) (Mandelboim等人1996)。此外，HLA-Cl在氨基酸位置77上包含保守的丝氨酸残基，而在HLA-C2中，相同位置上存在天冬酰胺。KIR2DL1识别 HLA-C2，KIR2DL2/2DL3 识别 HLA-Cl (Colonna 等人 1993)。基于在氨基酸位置 77-83中的差异，HLA-B也被分成两个组群HLA-Bw4和HLA_Bw6。具有HLA_Bw4表位的HLA-B和HLA-A (A*23, A*24, A*32)等位基因被 KIR3DL1 识别(Gumperz 等人 1995)。HLA_Bw6 不是 KIR的配体。疾病易感性与各种KIR配体群关联。在生物学上，NK细胞针对靶细胞的反应性部分基于KIR及其同源配体的存在。因为某些抑制性KIR的所有等位基因并非以相同的程度与相同配体组群的不同HLA等位基因相互作用(De Santis等人2010)，所以，等位基因多态性使得难以预测最终的NK细胞的反应性。NK活性的精确预测需要了解KIR及其配体的分子决定簇。因此，在一些实施方案中，本发明涉及关于如何基于我们关于独特分子决定簇的知识，开发基于实时PCR的方法来评估KIR2DL1的不同功能组群的新型方法。此外，在其它实施方案中，本发明还涉及用于功能性KIR-配体分型的平行方法。此类方法提供了具有生物学和临床重要意义的快速经济的信息。1.讨论虽然许多研究已确定了 KIR及其HLA配体在健康、疾病和移植结果中的重要性，但这两个组群最具多态性的基因家族间的等位基因多态性的重要性仍未得到阐明。障碍是双重的:第一，虽然毫无疑问在不同等位基因之间存在功能异质性，但分子决定簇远未弄清；第二，即使已知分子决定簇，但仍然没有用于大容量测试的方便的实验室方法。因此，在一些实施方案中，本发明涉及用于在分子决定簇被鉴定后对KIR等位基因和KIR配体进行快速经济的分型的新型方法。重要地，结果提供了生物学信息性数据，其对于临床诊断是有用的。在过去，可部分基于KIR及其配体的存在来预测NK细胞反应性。然而，等位基因多态性产生了另一层功能异质性。为了精确地预测NK细胞反应性(例如在选择用于NK细胞移植的供体时)，KIR及其配体的特定功能等位基因组群的存在的知识是非常重要的。例如，仅举例说明而无意是限定性的，通过使用基于分子决定簇的知识的功能性KIR等位基因组群分型，正确地预测了当与KIR2DL1C245/C245细胞相比较，KIR2DL1R245/R245NK细胞对失去自我更具反应性。因此，临床假说可能是:对于缺乏HLA-C2配体的患者，具有KIR2DL1R245/R245的骨髓移植供体比具有KIR2DL1C245/C245的供体更好。另一个实例(无意是限定性的)是怀孕。当缺乏大部分或全部激活性KIR的怀孕母亲怀有具有KIR2DL1配体HLA-C2组群的胎儿时，她们处于增加的先兆子痫的风险中(Hiby等人2004)。即使母亲自己也具有HLA-C2，情况亦如此。由于KIR2DL1R245/R245比KIR2DL1C245/C245抑制性更强，因此可预测母亲是否具有KIR2DL1R245/R245，当怀有HLA-C2阳性婴儿时，她可能处于更高的发生先兆子痫的风险中。因此在怀孕过程中应当更密切地监测这些母亲。类似的预测对于KIR2DL1相关疾病也是可能的。例如，据信，具有KIR2DL1R245/R245等位基因的个体当与具有抑制性较弱的KIR2DL1C245/C245等位基因的个体相比较时，可具有减小的发生自身免疫疾病的机会。相反地，具有KIR2DL1C245/C245等位基因的个体可处于更低的发生癌症或慢性感染的风险中。借助于本文中描述的高通量KIR2DL1功能组群分型，我们现在应当能够快速地研究这些假说。与KIR等位基因类似，现有的HLA-配体分型需要高分辨率的等位基因分型，这是非常昂贵和耗时的。本文中提供的SNP测定可在4小时内对94个个体进行KIR-配体分型，成本为每样品约4美元。相反地，高分辨率HLA分型花费数周，并且每一个样品耗费约200美元(Yun等人2007)。
总而言之，本发明的一些实施方案涉及可在临床诊断实验室中被容易地采用的用于KIR等位基因和KIR-配体分型的新型方法。重要地，相信，在NK细胞活性的预测中结果是生物学信息性的。该信息对于NK细胞在健康和疾病中的未来生物学研究以及对于预测的临床医学和移植供体选择是非常有价值的。这种基于功能分子决定簇的方法对于整个人类基因组中许多其它高度多态性基因座的快速SNP测定的开发也是有用的。
I1.材料和方法A.细胞、培养和转导用于KIR2DL1等位基因和KIR-配体分型的DNA样品获自St.JudeChildren’sResearch Hospital的健康供体的PBMC。B-淋巴母细胞细胞系721.221购自国际组织相容性工作组(International Histocompatibility Working Group)并且培养在补充有20%FBS和ImM青霉素/链霉素的RPMI1640中。利用含有HLA_Cw6和HLA_Cw7的逆转录病毒载体MMP-1C-GFP-W转导721.221细胞。使用GFP表达，通过流式细胞分选术分选高表达细胞。K562细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并且培养在补充有10%FBS和ImM青霉素/链霉素的RPMI1640中。B.效应NK细胞对靶细胞的反应性的检测为了将效应细胞与靶细胞分离，利用全白细胞标志CD45预标记效应细胞。充分洗涤预标记的效应细胞，随后将其与靶细胞混合。如由Bari等人所描述的，进行CD107细胞毒性测定。简而言之，将预标记的效应PBMC与靶K562或721.221细胞混合，随后在抗-⑶107amAb抗体,克隆H4A3 (BD Pharmingen)存在的情况下于37° C温育。在I小时的温育后,添加Golgi stop (BD Biosciences)至终浓度5mM，随后在细胞培养箱中温育3小时。随后洗涤细胞，用包含适当的抗体(抗KIR2DL1、KIR2DL2/2DL3、KIR3DL1和NKG2a的单克隆抗体)的抗体混合物标记细胞。从CD45+细胞群门控单个KIR+NK细胞群，利用流式细胞术(LSR II细胞仪)基于⑶107的表面表达测量细胞毒性。使用下式来计算单个KIR+NK细胞亚组中的⑶107+细胞的绝对数目:
权利要求
1.一种探针，包含选自下列的核酸序列:SEQ.1D.NO:9的核酸序列、SEQ.1D.NO: 10的核酸序列、与SEQ.1D.NO: 9具有大于98%的同源性的核酸序列、与SEQ.1D.NO: 10具有大于98%的同源性的核酸序列、与SEQ.1D.NO:9具有大于95%的同源性的核酸序列、与SEQ.1D.NO: 10具有大于95%的同源性的核酸序列、与SEQ.1D.NO:9具有大于90%的同源性的核酸序列、与SEQ.1D.NO: 10具有大于90%的同源性的核酸序列，其中所述探针能够区分编码KIR2DL1的位置245上的精氨酸和半胱氨酸的核酸序列的存在与不存在。
2.一种试剂盒，其包括: a)提供: 1.来自权利要求1的探针；和 .使用说明书。
3.一种方法，其包括: a)提供: 1.来自受试者的样品，其中所述样品包括编码KIR的核酸； .多个引物，其中所述引物能扩增KIR2DL1的所有等位基因；ii1.多个探针，其中所述探针能识别编码位置245上的精氨酸和半胱氨酸的核酸序列的存在；和 b)将所述样品与所述引物接触足以扩增KIR2DL1的所有等位基因的足量时间；和 c)利用所述多个探针测定编码精氨酸和半胱氨酸的核酸序列的存在和不存在。
4.权利要求2的方法，其还包括:取决于精氨酸的编码序列的存在，利用第一疗法治疗受试者。
5.权利要求2的方法，其还包括:取决于半胱氨酸的编码序列的存在，利用第二疗法治疗受试者。
6.—种试剂盒,其包括: a)提供: 1.用于KIR分型的多个引物和多个探针，其中所述分型包括区分编码KIR2DL1的位置245上的精氨酸和半胱氨酸的核酸序列的存在和不存在；和 .使用说明书。
7.一种探针，包含选自下列的核酸序列:SEQ.1D.NO:7的核酸序列、SEQ.1D.NO:8的核酸序列、与SEQ.1D.NO:7具有大于98%的同源性的核酸序列、与SEQ.1D.NO:8具有大于98%的同源性的核酸序列、与SEQ.1D.NO:7具有大于95%的同源性的核酸序列、与SEQ.1D.NO:8具有大于95%的同源性的核酸序列、与SEQ.1D.NO: 7具有大于90%的同源性的核酸序列、与SEQ.1D.NO:8具有大于90%的同源性的核酸序列，其中所述探针能够区分编码HLA-C1/C2的位置77上的丝氨酸和天冬酰胺的核酸序列的存在和不存在。
8.一种试剂盒，其包括: a)提供: 1.来自权利要求7的探针；和 .使用说明书。
9.一种方法，其包括: a)提供:i.来自受试者的样品，其中所述样品包括编码KIR配体的核酸； .多个引物，其中所述引物能扩增HLA-C1/C2的所有等位基因；ii1.多个探针，其中所述探针能识别编码HLA-C1/C2的位置77上的丝氨酸和天冬酰胺的核酸序列的存在；和 b)将所述样品与所述引物接触足以扩增HLA-C1/C2的所有等位基音的足量时间；和 c)利用所述多个探针测定编码丝氨酸和天冬酰胺的核酸序列的存在和不存在。
10.权利要求9的方法，其还包括:取决于丝氨酸的编码序列的存在，利用第一疗法治疗受试者。
11.权利要求9的方法，其还包括:取决于天冬酰胺的编码序列的存在，利用第二疗法治疗受试者。
12.—种试剂盒，其包括: a)提供: 1.用于KIR配体分型的多个引物和多个探针，其中所述分型包括区分编码HLA-C1/C2的位置77上的丝氨酸和天冬酰胺的核酸序列的存在和不存在；和 .使用说明书。
13.一种探针，包含选自下列的核酸序列:SEQ.1D.NO:3的核酸序列3、SEQ.1D.NO:4的核酸序列、与SEQ.1D.NO:3具有大于98%的同源性的核酸序列、与SEQ.1D.N0:4具有大于98%的同源性的核酸序列、与SEQ.1D.NO:3具有大于95%的同源性的核酸序列、与SEQ.1D.N0:4具有大于95%的同源性的核酸序列、与SEQ.1D.NO:3具有大于90%的同源性的核酸序列、与SEQ.1D.N0:4具有大于90%的同源性的核酸序列，其中所述探针能够区分编码HLA-Bw4和HLA-A中的精氨酸以及HLA_Bw6的位置83上的甘氨酸的核酸序列的存在和不存在。
14.一种试剂盒，其包括: a)提供: 1.来自权利要求13的探针；和 .使用说明书。
15.一种方法，其包括: a)提供: 1.来自受试者的样品，其中所述样品包含编码KIR配体HLA-B和HLA-A的核酸； .多个引物，其中所述引物能扩增HLA-B/A的所有等位基因；ii1.多个探针，其中所述探针能识别编码HLA-Bw4和HLA-A中的精氨酸以及HLA_Bw6的位置83上的甘氨酸的核酸的存在；和 b)将所述样品与所述引物接触足以扩增HLA-B/A的所有等位基因的足量时间；和 c)使用所述多个探针测定编码精氨酸和甘氨酸的核酸序列的存在和不存在。
16.权利要求15的方法，其还包括:取决于精氨酸的编码序列的存在，利用第一疗法治疗受试者。
17.权利要求15的方法，其还包括:取决于甘氨酸的编码序列的存在，利用第二疗法治疗受试者。
18.—种试剂盒，其包括:a)提供:i.用于KIR配体分型的多个引物和多个探针，其中所述分型包括区分编码HLA-Bw4和HLA-A中的精氨酸以及HLA-Bw6的位置83上的甘氨酸的核酸序列的存在与不存在；和ii.使用说明书。
全文摘要
本发明涉及进行基于分子决定簇的功能性杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)等位基因分型和配体分型的测定。具体地本发明提供了用于基于KIR2DL1的位置245、HLA-C的位置77以及HLA-B和HLA-A的位置83上的多态性对具有独特功能性质的KIR2DL1和KIR配体的不同等位基因组群进行分型的单核苷酸多态性(SNP)测定的方法、组合物和试剂盒。所述测定适合用于预测健康、疾病和移植中的NK细胞活性。
文档编号C07H21/00GK103209988SQ201180055075
公开日2013年7月17日 申请日期2011年10月5日 优先权日2010年10月6日
发明者W·梁, R·巴里 申请人:圣朱德儿童研究医院