专利名称：Limk－1、其类似物和配体在制备抗血栓形成或血液凝固疾病的药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及LIMK-1、LIMK-1类似物或LIMK-1配体用于结合GPIIb和/或激活或抑制GPIIb/IIIa下游信号传递(的用途)，用于制备预防或治疗血栓形成或血液凝固疾病的药物(的用途)，(涉及)筛选LIMK-1类似物或LIMK-1配体的方法以及制备治疗血栓形成或血液凝固疾病的药物的方法。
背景技术：
血小板是最小的血细胞，虽然仅仅是巨核细胞胞浆的一部分，然而它们在正常止血中具有关键作用，并且是促成血栓形成性紊乱的重要因素。血小板粘附、激活和聚集是引发止血的首要必备反应，并在广泛的各种心血管疾病、脑血管疾病和外周血管疾病的病理学中起作用(Bhatt等，2003；George 2000；Moroi等，1998；Rao等，2000；Ruggeri 2002)。
血小板膜含有高浓度的整联蛋白和其它糖蛋白，它们参与使血小板粘附至胞外基质成分(Lopez等，1988；Philips等，1988；Shattil 1999)。胶原纤维和冯·维勒布兰德因子(vWF)提供了重要的位点，使血小板粘附于暴露的内皮下，在血管损伤部位诱捕它们并使之形成单层细胞覆盖在损伤区域上(Ruggeri 2002；Watson 1999)。胶原纤维和vWF，和通过G-蛋白偶联受体(GPCRs)起作用的信号相呼应，也刺激血小板的激活，导致整联蛋白糖蛋白GPIIb/IIIa(也称之为□IIb□3)的“内-外”调节、从致密颗粒和α颗粒中的分泌、凝血噁烷的产生和促凝血活性的表达(Parise 1999；Ruggeri 2002；Shattil 1999)。同样，经激活血小板从正常的盘状变为带有长树枝状延伸的紧凑球形以便于粘附。所有这些事件支持了凝血过程。在结合了纤维蛋白原、冯·维勒布兰德因子(vWF)和纤连蛋白的血小板的表面，膜蛋白GPIIb(CD41)和GPIIIa(CD61)形成最丰富的异源二聚体复合物。GPIIb/IIIa以失活的构象表达在静息血小板的表面上，其对于可溶性纤维蛋白原具有低的亲和性。在血小板通过大量重要的激动剂如胶原、ADP或凝血酶激活之后，GPIIb/IIIa经历构象变化，提高了其结合可溶性纤维蛋白原的亲和性，导致血小板聚集(Parise 1999；Ruggeri 2002；Shattil 1999)。GPIIb/IIIa的信号传递涉及其胞浆尾部的数个区域。数种信号传递蛋白与GPIIb/GPIIIa整联蛋白的胞浆结构域结合，包括内联蛋白、钙和整联蛋白结合蛋白(CIB)、Shc和Grb2。此外，α亚基的胞浆尾部的序列KVGFFKR参与信号传递，且对应于该区域的脂质修饰的肽完全激活了血小板(Stephens等，1998)。然而，引导从血小板激活到纤维蛋白原受体暴露的一系列精确的信号传递事件是未知的。
由于证实了阿斯匹林对于血小板和在心肌梗塞的主要预防中是有效的，阿斯匹林对于血栓形成性紊乱的预防性使用已经迅速增加。因而，几十年来，抗血小板治疗集中在凝血噁烷路径以及阿斯匹林对它的抑制方面。
考虑到其相关性，预期粘附是开发抗血栓药物的一个吸引人的靶标。然而，设计用以防止血小板聚集的首个系列的化合物，即αIIbβ3拮抗剂，用于口服长期治疗并未成功。这被假定为是由于αIIbβ3拮抗剂(其中许多是基于纤维蛋白原中的受体识别序列)与天然的配体一样，实际上引起了‘外-内’信号传递的事实(Cox等，2000)。因而，直接干预配体和受体之间的相互作用而不激活血小板也许是不可能的。
在最近几年间，已经介绍了一些抗血小板疗法，且有文献记录了包括从阿斯匹林到噻氯匹啶(ticlopidine)和氯吡格雷(clopidrogel)等的抗血小板治疗在血栓栓塞性紊乱中的益处(Konstantopoulos等，2001；Mousa等，2002；Weksler 2000)。然而，虽然所有这些不同的治疗对于治疗血栓栓塞性紊乱增加了另外的益处，但是仍然存在许多病例，即使用不同药剂联合治疗的效果也不是足够的。而且，在许多病例中，这些抗血小板疗法的治疗伴随着不期望的副作用。因而，迫切需要用于治疗血栓栓塞性紊乱的新方法。
发明内容
因此，本发明的一个目标是提供用于增强预防和治疗血栓形成或血液凝固疾病的新方法和鉴定例如抗血栓性治疗的新靶标的方法。
令人惊讶的是，现在发现LIMK-1蛋白与GPIIb/IIIa结合。LIMK-1是72.6kDA的蛋白(人647个氨基酸)，并且是含LIM基序的蛋白激酶家族的成员。其基因图谱位于染色体7，即7q11.23上。该蛋白质包含两个N-末端富含半胱氨酸的LIM/双锌指基序、一个具有数个推断的酪蛋白激酶和MAP激酶识别位点的富含脯氨酸丝氨酸的区域、一个PDZ结构域(PSD95/disc large/ZO-1)和一个C末端丝氨酸/苏氨酸激酶结构域。据假定锌指样LIM-结构域介导蛋白质-蛋白质相互作用，且在核与细胞骨架蛋白中已有描述。已经显示，LIMK-1的C-末端激酶片断与LIM结构域结合，且LIM片断剂量依赖性地抑制LIMK-1的激酶核心片断的激酶催化活性。因而，N-末端LIM结构域通过直接与C-末端激酶结构域相互作用而负调节LIMK-1的激酶活性(Nagata等，1999)。LIM结构域激酶1(LIMK-1)经由切丝蛋白(cofilin)的磷酸化作用调节肌动蛋白细胞骨架的重建。活性切丝蛋白引起肌动蛋白的解聚。通过LIMK-1的切丝蛋白磷酸化作用结果导致切丝蛋白肌动蛋白解聚活性的失活(Bierne等，2001；Gohla等，2002；Yang等，1998)。然而，迄今为止还没有关于LIMK-1(或LIMK-2)在血小板中的潜在作用的报道。
由于LIMK-1与血小板整联蛋白GPIIb结合，LIMK-1触发了由血小板激活所诱发的并且是血小板激活所必要的血小板的形状变化。抑制LIMK-1从而导致经促血栓形成刺激的血小板激活的抑制。因此，LIMK-1抑制剂干扰血小板的激活和聚集从而干扰血栓形成。
因此，本发明的第一个方面涉及在体外和在体内LIMK-1或LIMK-1类似物结合GPIIb的用途，特别是为了调节(优选抑制)整联蛋白GPIIb/IIIa下游的信号转导。
根据本发明的LIMK-1是任何天然存在的LIMK-1蛋白。这包括不同物种的LIMK-1蛋白及其变体，优选脊椎动物，更优选哺乳动物，也可以是剪接变体。优选的LIMK-1蛋白是人LIMK-1蛋白。人LIMK-1蛋白的氨基酸序列公布在Mizuno等，《原癌基因》(Oncogene)91605-1612，1994中。
根据本发明的术语“LIMK-1类似物”是指结合GPIIb的衍生自LIMK-1但不是LIMK-1的蛋白质。更特别地，是指与天然存在的LIMK-1序列(即野生型多肽)有一个或多个氨基酸不同的氨基酸序列。这样的类似物以取代、插入或缺失一个或多个氨基酸而不同于野生型多肽。优选的是半保守的(氨基酸取代)，更优选的是保守氨基酸的取代，由此一个残基被具有相似特征的另一个残基所取代。典型的取代发生在脂肪族氨基酸之间，在具有脂肪族羟基侧链的氨基酸之间，在具有酸性残基的氨基酸之间，在酰胺衍生物之间，在具有碱性残基的氨基酸之间，或者在具有芳香族残基的氨基酸之间。典型的半保守和保守取代是
如果新的半胱氨酸保持为游离的硫醇，则从A、F、H、I、L、M、P、V、W或Y转变为C是半保守的。而且，本领域的技术人员将会意识到处于空间需要位置上的甘氨酸不应被取代，且不应将P导入蛋白质中具有α螺旋或β片层结构的部分。
变体多肽在一级结构(氨基酸序列)中不同，但可能在或可能不在二级或三级结构中或在功能上相对于野生型具有显著不同。在任何情况下，类似物都显示出相对于野生型LIMK-1的同一性(同源性)至少为75％，优选至少为80％，更优选至少为90％，甚至更优选至少为95％，且最优选至少为99％。
类似物也可以是足以与GPIIb结合的LIMK-1的一部分。该部分包含至少30个氨基酸，优选至少100个氨基酸，更优选至少300个氨基酸，甚至更优选至少450个氨基酸，且最优选至少600个氨基酸。类似物的这个部分可如上文详述的那样以取代、插入或缺失一个或多个氨基酸而不同于野生型多肽部分。在一个实施方案中，LIMK-1或LIMK-1类似物可被融合到其它分子如蛋白质和/或标记(例如像上面详述的)上。
术语“与GPIIb的结合”或“与GPIIb结合”是指主要化合物(LIMK-1或LIMK-1类似物)与GPIIb蛋白的特异性结合。根据本发明与GPIIb蛋白的特异性结合包括但不限于以不超过10-4mol/l的解离常数KD结合，优选不超过10-5mol/l，更优选不超过10-6mol/l。解离常数KD可以例如使用如实施例中(见例如
图1)所示的免疫沉淀反应来测定，通过使用变化浓度的测试化合物即LIMK-1或LIMK-1类似物和恒定浓度的GPIIb实现。通过使用例如抗LIMK-1或LIMK-1类似物的特异性抗体来测定与GPIIb结合的测试化合物的浓度。根据以下等式测定KDB[L]＝[L]/([L]+KD)，其中[L]代表该化合物的浓度。KD是测试化合物的解离常数，而B[L]是在测试化合物特定浓度下的结合(％)。
为了检测，抗体可被标记，这可以适当地为荧光团、发色团、放射性同位素标记、金属胶体、酶或者化学发光的或生物发光的分子。合适的荧光团和发色团在R.P.Haugland，Molecular Probes，Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals，第5版，Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oreg.，1992中公开。优选的荧光团的例子包括荧光素、罗丹明(rodamine)和硫代吲哚菁染料(sulfoindocyanine dye)Cy5(Mujumdar等，Bioconjuga Chem.4105，1992)。优选的放射性同位素标记包括3H、14C、32P、33P、35S、99mTc或125I。优选的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶和脲酶。
本发明的GPIIb是任何天然存在的GPIIb蛋白。这包括不同物种的GPIIb蛋白及其变体，优选脊椎动物，更优选哺乳动物，也可以是剪接变体。优选的GPIIb蛋白是人GPIIb蛋白，其氨基酸序列在Poncz等，《生物学化学杂志》(J.Biol.Chem.)2628476-8482，1987中公开。
在本发明优选的一个实施方案中，LIMK-1类似物是GPIIb/IIIa下游信号传递的激活剂或抑制剂，优选地是其抑制剂。
GPIIb/IIIa下游信号传递的激活剂激活相应的信号转导路径，导致可检测的信号。抑制剂至少部分地阻断GPIIb/IIIa下游信号传递。激活和失活如下文所定义。激活剂和灭活剂如下文所述鉴定。
在本发明另一个优选的实施方案中，LIMK-1或LIMK-1类似物用于GPIIb/IIIa下游信号传递的激活或抑制，更优选地用于其抑制。
如上文详述的那样，GPIIb/IIIa下游信号传递的激活导致血小板的激活，其中这是通过血小板的外观从正常的盘状到紧凑的具有长树枝状延伸的球形的构象变化进行协调配合的。当用LIMK-1或竞争性的LIMK-1类似物刺激时，本发明的GPIIb/IIIa下游信号传递的激活相应于至少10％、优选至少20％、更优选至少50％且最优选至少80％血小板的激活。GPIIb/IIIa下游信号传递的抑制从而导致血小板激活的抑制。当用或任选地在存有GPIIb/IIIa激活剂时用抑制性LIMK-1类似物抑制时，本发明的GPIIb/IIIa下游信号传递的抑制相应于至少10％、优选至少20％、更优选至少50％且最优选至少80％血小板的抑制。
本发明的另一个主题是LIMK-1配体用于激活或抑制GPIIb/IIIa下游信号传递的用途，优选地用于其抑制。
LIMK-1配体是任何特异性地与LIMK-1结合的化合物分子。本发明与LIMK-1特异性地结合包括不限于以不超过10-4mol/l的解离常数KD结合，优选不超过10-5mol/l。解离常数KD可如详述的GPIIb那样测定，或通过使用LIMK-1蛋白和合适标记的LIMK-1配体来测定。合适的标记在上文详述。此外，LIMK-1的竞争性或拮抗性LIMK-1配体的结合可通过分别激活或失活LIMK-1的激酶功能来检测。激酶功能可通过本领域技术人员已知的方法容易地检测。其中一些在下文详述。为检测拮抗性的LIMK-1配体，可能有必要用例如PAK(p21激活的激酶)或ROCK(Rho激酶)激活LIMK-1。可选择地，LIMK-1配体的结合可以通过测量在信号转导路径中更下游的信号来检测，例如血小板的激活或失活或者其构象变化的诱导。本发明LIMK-1的特异性结合包括不限于分别以分别不超过10-4mol/l的EC50值和IC50值与竞争性和拮抗性LIMK-1配体结合，优选不超过10-5mol/l。EC50值和IC50值的测定和计算对于本领域的技术人员来说是公知的。
LIMK-1可以是非聚合的有机化合物、脂质、碳水化合物、肽，优选为具有约10至约300个氨基酸的肽，特别是具有10至50个氨基酸的肽。特别优选的是化学小分子，特别是非聚合的有机化合物，无论是在实验室里合成的或者是天然发现的，优选具有约200g/mole至约1500g/mole，特别是400g/mole至1000g/mole的分子量。
可选择地，本发明的LIMK-1配体可以是天然产物提取物的形式，无论是未加工的或是纯化的形式。提取物可根据标准方法生产，如从动物、植物、真菌或微生物来源，像蛇毒、叶子或微生物发酵培养液中以水和/或醇和/或有机溶剂提取和/或柱层析和/或沉淀。
在一个优选的实施方案中，LIMK-1配体是LIMK-1激动剂或者LIMK-1拮抗剂，更优选的是LIMK-1拮抗剂。
激动剂与LIMK-1结合，诱导变化，例如LIMK-1构象的变化，激活相应的信号转导，例如激活LIMK-1的激酶功能，这导致可检测的信号。拮抗剂或阻断剂也与LIMK-1结合，但一般不诱导信号转导。在激动剂的存在下，拮抗剂剂量依赖性地抑制激动剂诱导的信号转导。
本发明的另一主题是本发明的LIMK-1、LIMK-1类似物或LIMK-1配体在制备预防或治疗血栓形成或血液凝固疾病的药物中的用途。血栓形成或血液凝固疾病是涉及改变的血栓形成或血液凝固的疾病。与健康的人类相比，血栓形成或血液凝固(的倾向)可能增加或减少。
为制备药物，LIMK-1、LIMK-1类似物或LIMK-1配体或其药学上可接受的盐必须是以一种药物剂型，其一般是由诸如药学上可接受的载体或辅助物质组合的成分的混合物组成，以提供所期望的特征。
制剂包含至少一种合适的药学上可接受的载体或辅助物质。这样的物质的例子是软化水，等渗盐，Ringer′s溶液，缓冲液，有机或无机酸和碱以及它们的盐，氯化钠，碳酸氢钠，柠檬酸钠或磷酸二钙，醇如丙二醇，酯如油酸乙酯和月桂酸乙酯，糖类如葡萄糖、蔗糖和乳糖，淀粉如玉米淀粉和马铃薯淀粉，增溶剂和乳化剂如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺，油类如花生油、棉籽油、玉米油、大豆油、蓖麻油，合成脂肪酸酯如油酸乙酯、豆蔻酸异丙酯，聚合的佐剂如明胶、葡聚糖、纤维素及其衍生物，白蛋白，有机溶剂，络合剂如柠檬酸盐和尿素，稳定剂如蛋白酶或核酸酶抑制剂，优选抑酶肽、∈-氨基己酸或抑胃酶肽A，防腐剂如苯甲醇，氧化抑制剂如亚硫酸钠、蜡或稳定剂如EDTA。组合物中也可以存在着色剂、释放剂、涂层剂、甜味、调味剂和香味剂、防腐剂和抗氧化剂。生理缓冲液优选pH约为6.0-8.0，特别地pH约为6.8-7.8，特别地pH约为7.4，和/或摩尔渗透压浓度约为200-400毫摩尔渗透/升(milliosmol/liter)，优选约为290-310milliosmol/liter。药物的pH一般用合适的有机或无机缓冲液调节，像例如优选使用磷酸缓冲液、tris缓冲液(三(羟甲基)氨基甲烷)、HEPES缓冲液([4-(2-羟乙基)哌嗪]乙磺酸)或MOPS缓冲液(3-吗啉代-1-丙磺酸)。相应缓冲液的选择一般取决于所需的缓冲液摩尔浓度。例如磷酸缓冲液适合用于注射液和输注液。配制药物和合适的药学上可接受的载体或辅助物质的方法对于本领域的技术人员来说是熟知的。药学上可接受的载体和辅助物质是根据主要剂型和所鉴定的化合物进行a.o.选择的。
药物组合物可以制备成经口、鼻、直肠、肠胃外、阴道、局部或阴道给药。肠胃外给药包括经皮下、皮内、肌肉内、静脉内或腹膜内给药。
药物可以被配制成各种剂型，包括经口服给药的固体剂型如胶囊、片剂、丸剂、散剂和颗粒，经口服给药的液体剂型如药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、混悬剂、糖浆剂和酏剂，可注射的制品例如无菌可注射水溶液或油质混悬剂，经直肠或阴道给药的组合物，优选为栓剂，以及用于局部或经皮给药的剂型如膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、散剂、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴片剂。
任何特定患者的具体治疗有效剂量水平将取决于各种因素，包括所鉴定的化合物的活性、剂型、患者的年龄、体重和性别、治疗持续时间等医学领域中众所周知的因素。
以单一或分开剂量给予人或其它哺乳动物的本发明的化合物的日总剂量，总计可以是例如约0.01至约50mg/kg体重或更优选地约为0.1至约25mg/kg体重的量。单一剂量组合物可以含有补足日剂量的数量或其约量。一般地，本发明的治疗方案包含每天以单一或多剂量地给予需要这样的治疗的患者约10mg至约1000mg的本发明化合物的化合物。
在优选的实施方案中，LIMK-1类似物是GPIIb/IIIa下游信号传递的抑制剂。在另一个优选的实施方案中，LIMK-1配体是LIMK-1拮抗剂。
大多数患有血栓形成或血液凝固疾病的患者遭受具有血栓形成或血液凝固(倾向)增加的疾病。因此，他们特别需要抑制血栓形成或血液凝固的药物。因此，抑制血栓形成或血液凝固的药物如抑制性LIMK-1类似物和拮抗性LIMK-1配体对于制药用途是优选的。
又在另一个优选的实施方案中，血栓形成或血液凝固疾病是伴有血栓形成或血液凝固增加的疾病。
伴有血栓形成或血液凝固增加的疾病对于本领域的技术人员来说是公知的，且包括例如动脉血栓形成性疾病。
在更优选的实施方案中，疾病是动脉血栓形成性疾病，甚至更优选的疾病选自心肌梗塞、不稳定型心绞痛、急性冠状动脉综合症、冠状动脉疾病、冠状动脉溶栓后再闭塞、血栓形成期间的闭塞和冠状动脉再狭窄、中风、短暂性脑缺血发作、肺栓塞、左心室功能障碍、患有心血管和脑血管疾病的患者的临床血管并发症的二级预防、动脉粥样硬化、血管介入性策略的结合药物治疗。
然而，本发明的另一个实施方案是筛选LIMK-1类似物的方法，其中该方法包括以下步骤(a)提供GPIIb蛋白和任选地至少一种其下游信号传递元件；(b)提供测试化合物；和(c)检测测试化合物与GPIIb蛋白的结合，其中该测试化合物衍生自LIMK-1。
一般地，GPIIb和任选地至少一种其下游信号传递元件在例如测定系统中被提供，且直接或间接与衍生自LIMK-1的测试化合物接触。表述“衍生自LIMK-1的测试化合物”是指如上文所定义的LIMK-1类似物。然后，检测测试化合物与LIMK-1蛋白的结合，其中所述结合可通过测量GPIIb与测试化合物之间的相互作用或者通过测量其对下游信号传递的效应来检测。
术语“GPIIb/GPIIIa或GPIIb的下游信号传递元件”是指作为GPIIb/GPIIIa或GPIIb下游信号转导的一部分的每一个分子或离子。其可以是信号传递级联中任何步骤的任何元件。优选地元件自身为可测量的信号或其产生可测量的信号。元件可以是例如第二信使或酶。信号可以是例如物质浓度的变化或者构象的变化。
结合可被直接检测，即通过检测建立的复合物，或者间接检测，即建立复合物的效应，其可以是例如信号转导路径中的下游信号。之后，可以分析和/或分离合适的配体。直接测量LIMK-1类似物与GPIIb的结合的方法在上文详述。
在本发明的另一个实施方案中，筛选本发明的LIMK-1类似物的方法包括以下步骤代替步骤(c)(c’)检测GPIIb/IIIa和/或其下游信号传递的激活或抑制。
用于检测LIMK-1的激活或抑制的合适的功能测定法可以例如包括GPIIb/GPIIIa的下游信号转导。例如，可如上面详述的那样通过分析下游信号例如血小板的激活或其构象的变化来检测激活或抑制。可能有必要在GPIIb和/或LIMK-1刺激物的存在下检测GPIIb/GPIIIa信号转导的抑制，其信号将受到抑制性LIMK-1类似物的抑制。
本发明的又一个实施方案是筛选LIMK-1配体的方法，其中该方法包括以下步骤(a)提供LIMK-1蛋白；(b)提供测试化合物；和(c)检测测试化合物对LIMK-1蛋白的结合。
一般地，LIMK-1在例如测定系统中被提供，且直接或间接地与测试化合物接触，特别是生化或化学测试化合物，例如以化学化合物文库的形式。然后，检测测试化合物与LIMK-1蛋白的结合。结合可被直接检测，即通过检测建立的复合物，或者间接检测，即建立复合物的效应，其可以是例如信号转导路径中的下游信号。直接测量LIMK-1配体与LIMK-1结合的方法在上文详述。其后，可分析和/或分离合适的配体。
在本发明的另一个实施方案中，筛选本发明的LIMK-1配体的方法包括以下步骤代替步骤(c)(c’)检测LIMK-1或GPII/IIIa下游信号传递的激活或抑制，优选检测其失活。
用于检测LIMK-1的激活或失活的合适的功能测定法可以例如包括LIMK-1的激酶功能。检测激酶活性的方法对于技术人员来说是公知的(见下文)。一般地，这些方法包括磷酸基团向受体的转移，例如标记的磷酸基团如32P或33P标记的磷酸基团。因此LIMK-1的激活伴随着增加的磷酸转移，而失活伴随着减少的磷酸转移。可能有必要在LIMK-1刺激物的存在下检测LIMK-1的失活，其信号将受到拮抗性LIMK-1配体的抑制。也可通过测量下游信号检测激活或失活，例如血小板的激活或其构象的变化。
本发明另一个主题是筛选与GPIIb/IIIa和/或其下游信号传递相互作用的测试化合物的方法，其中该方法包括以下步骤(a)提供LIMK-1蛋白；(b)提供GPIIb和/或至少一种其下游信号传递元件；(c)提供测试化合物；和(d)检测该化合物对于GPIIb/GPIIIa下游信号传递的效应。
一般地，LIMK-1和GPIIb和/或至少一种其下游信号转导元件在例如测定系统中被提供，且直接或间接地与测试化合物接触，特别是生化或化学测试化合物，例如以化学化合物文库的形式。然后，如上文所述检测测试化合物对于GPIIb/GPIIIa信号转导的效应。其后，可以分析和/或分离合适的配体。
在一个优选的实施方案中，整个细胞例如血小板用于本发明的筛选方法，由此提供GPIIb/GPIIIa和更多其下游信号传递的元件。在这种情况下，检测到的信号可以是血小板的形状变化。
若存在测试化合物时LIMK-1或其类似物对GPIIb的结合不同于在缺少测试化合物时的情况，则测试化合物与GPIIb和/或其下游信号传递相互作用。信号转导可以是增加或减少，优选减少。所检测到的下游信号传递量的差异总计最少10％，优选至少20％，更优选至少50％且最优选至少80％，且计算为存在和缺少测试化合物时的信号比。
在本发明筛选方法的另一个实施方案中，以化学化合物文库的形式提供测试化合物。化学化合物文库包括大量的化学化合物且是由任何多种来源组合的，包括化学合成的分子和天然产物，或由组合化学技术产生。它们特别适合高通量筛选。它们可由特定结构的化学化合物或由特定生物如植物的化合物组成。在本发明的上下文中，化学化合物文库优选是包括蛋白质和多肽或小分子的文库。
又在根据本发明用于筛选LIMK-1类似物或LIMK-1配体的筛选方法的另一个实施方案中，测试化合物与所述GPIIb蛋白或所述LIMK-1蛋白的结合或其对GPIIb和/或其下游信号传递的效应通异质或均质测定法检测。如本文所用，异质测定法是包括一个或多个洗涤步骤的测定法，然而在均质测定法中这样的洗涤步骤是不必要的。仅仅是混合试剂和化合物并进行测量。
在优选的实施方案中，均质测定法是ELISA(酶联免疫吸附试验)、DELFIA(解离增强镧系荧光免疫分析)、SPA(闪烁亲近测定法)或闪烁板(flashplate)测定法。
基于ELISA(酶联免疫吸附试验)的测定法由多种公司提供。该测定法使用可被激酶如LIMK-1磷酸化的随机肽。含有激酶的样品通常是被稀释到含有例如ATP和必需的阳离子的反应缓冲液中，然后再加入到板孔中。通过简单地除去混合物而停止反应。其后，洗涤板子。例如通过将生物素化的底物加入到激酶中开始反应。反应后，加入特异性的抗体。样品通常被转移至预先封闭的G蛋白板上，在洗涤后例如加入链霉抗生物素蛋白-HRP。其后，除去未结合的链霉抗生物素蛋白-HRP(辣根过氧化物酶)，通过加入过氧化物酶底物开始过氧化物酶显色反应，且用合适的光密度计测量光密度。
基于DELFIA(解离增强镧系荧光免疫分析)的测定法是固相测定法。抗体通常用铕或其它镧系元素标记，并在洗去未结合的铕标记的抗体之后检测铕荧光。
SPA(闪烁亲近测定法)及闪烁板测定法通常采用生物素/抗生物素蛋白相互作用以捕获放射性同位素标记的底物。一般地，反应混合物包括激酶、生物素化的肽底物和γ-[P33]ATP。反应后，生物素化的肽通过链霉抗生物素蛋白捕获。在SPA检测中，链霉抗生物素蛋白结合在含闪烁材料的珠上，然而在闪烁板检测中，链霉抗生物素蛋白结合至含闪烁材料的微板的孔的内部。一旦固定，放射性同位素标记的底物与闪烁材料足够接近以刺激光的发射。
在另一个优选的实施方案中，均质测定法是TR-FRET(时间分辨荧光共振能量转移)测定法、FP(荧光偏振)测定法、ALPHA(增强发光邻近均质分析)、EFC(酶片断互补)测定法或基因测定法。
基于TR-FRET(时间分辨荧光共振能量转移)的测定法是利用了铕和APC(修饰的别藻蓝蛋白)之间或其它具有重叠光谱的染料如Cy3/Cy5或Cy5/Cy7之间的荧光共振能量转移的测定法(Schobel，U.等(1999)Bioconjugate Chem.10，1107-1114)。在例如用337nm的光激发铕之后，该分子在620nm发荧光。但是如果该荧光团足够接近APC，则铕将转移其激发能至APC，后者在665nm发荧光。激酶底物通常为生物素标记的底物。在激酶反应后，铕标记(P)的特异性抗体随同链霉抗生物素蛋白-APC一起加入。磷酸化的肽使铕标记的抗体和链霉抗生物素蛋白-APC紧密接触。APC与铕荧光团的紧密接近将因为APC荧光的得益而引起铕荧光的淬灭(FRET)。
基于荧光偏振(FP)的测定法是使用偏振光激发溶液中的荧光底物肽的测定法。这些荧光肽在溶液中是游离且翻转的，致使发出的光变成去极化的。然而，当底物肽结合于更大的分子如(P)-Tyr时，其翻转速率极大地降低，且发出的光保持高度偏振。对于激酶测定法，一般有两种选择(a)荧光磷酸肽示踪剂被结合到(P)特异性抗体上。磷酸化产物将与抗体中荧光磷酸肽竞争，导致偏振由高至低变化。
(b)磷酸化底物肽结合于磷特异性抗体导致偏振由低至高变化。
基于ALPHA(增强发光邻近均质分析)的测定法是依赖于通过磷酸化肽使其接近的供体和受体珠之间的纯态氧转移的试验。在680nm激发时，供体珠内的光敏剂将周围的氧转变成纯态氧，其扩散至200nm的距离。受体珠内的化学发光基团将能量转移至珠内的荧光受体，从而在约600nm处发出光。
基于EFC(酶片断互补)的测定法或等同试测定法可特别地用于化合物的高通量筛选。EFC测定法是建立在工程化的β-半乳糖苷酶的基础上的，其由酶受体(EA)和酶供体(ED)两个片断组成。当两片断分开时，没有β-半乳糖苷酶活性，但当片断在一起时，它们就结合(互补)形成有活性的酶。EFC测定法利用了ED-被分析物缀合物，其中所述被分析物可被特异性结合蛋白如抗体或受体识别。在缺少特异性结合蛋白时，ED-被分析物缀合物能够互补EA以形成活性β-半乳糖苷酶，产生正的发光信号。如果ED-被分析物缀合物被特异性的结合蛋白结合，则与EA的互补将被阻止，因此没有信号。如果提供了游离的被分析物(在样品中)，它会与ED-被分析物缀合物竞争与特异性结合蛋白的结合。游离的被分析物将释放ED-被分析物缀合物以与EA互补，产生依赖于样品中存在着的游离被分析物的含量的信号。
还有，在另一个实施方案中，根据本发明的用于筛选LIMK-1类似物或LIMK-1配体的筛选方法是通过将GPIIb或LIMK-1结合在阵列上而在阵列上进行的。使用固相化学和光不稳定保护基团制备这样的阵列的方法公开在例如US 5,744,305中。也可以使这些阵列与测试化合物或化合物库接触，并测试相互作用例如结合或改变构像。
又在另一个实施方案中，根据本发明的用于筛选LIMK-1类似物或LIMK-1配体的筛选方法是使用整个细胞进行的。优选地，血小板用于这样的测试，因为它们可以容易地从血液供体中获得。可选择地，可以使用细胞系，任选地为转染的细胞系。这样的细胞系包括但不限于巨核细胞系(例如DAMI或MEG-1)、HEK 293细胞(初级人胚肾)、3T3细胞(鼠胚胎成纤维细胞)、CHO细胞(中华仓鼠卵巢)、COS-7细胞(非洲绿猴细胞系)、HeLa细胞(人上皮样宫颈癌)、JURKAT细胞(人T细胞白血病)、BHK 21细胞(仓鼠正常肾，成纤维细胞)和MCF-7细胞(人乳腺癌)。使用整个细胞相对于细胞膜是有利的，因为胞内基质、酶等不需要加入到测试系统中。而且，在多孔板中的整个细胞是特别适合于高通量输出筛选测试和自动测试系统。
在另一个实施方案中，根据本发明的用于筛选LIMK-1类似物或LIMK-1配体的筛选方法是在机器人系统中进行的。最好本发明的方法是在机器人系统(例如包括机器人涂板和机器人液体转移系统)中，例如使用微流体学，即有沟构造的系统进行的。
又在另一个实施方案中，根据本发明的用于筛选LIMK-1类似物或LIMK-1配体的筛选方法是以高通量输出筛选系统的形式进行的。在这样的系统中，最好筛选方法是自动化的且小型化的；特别是使用通过机器人控制的小型化孔和微流体学。
本发明的另一个主题是制备用于预防或治疗血栓形成或血液凝固疾病的药物的方法，其中该方法包括以下步骤(a)实施根据本发明的筛选方法，(b)提供适量所检测的测试化合物，和(c)将所检测的测试化合物与如上详述的一个或多种药学上可接受的载体或辅助物质一起配制。
血栓形成或血液凝固疾病是涉及血栓形成或血液凝固改变的疾病。与健康人类相比，血栓形成或血液凝固(倾向)可能增加或减少。伴有血栓形成或血液凝固增加的疾病对于本领域的技术人员来说是公知的，且包括例如动脉血栓形成性疾病。
在优选的实施方案中，所述疾病是动脉血栓形成性疾病。
又在本发明更优选的实施方案中，动脉血栓形成性疾病选自心肌梗塞、不稳定型心绞痛、急性冠状动脉综合症、冠状动脉疾病、冠状动脉溶栓后再闭塞、血栓形成期间的闭塞和冠状动脉再狭窄、中风、短暂性脑缺血发作、肺栓塞、左心室功能障碍、患有心血管和脑血管疾病的患者的临床血管并发症的二级预防、动脉粥样硬化、血管介入性策略的结合药物治疗。
以下附图和实施例将更详细地解释本发明，而非限制本发明的范围。
附1显示了用GPIIb免疫沉淀物的2D凝胶电泳对LIMK-1的检测。
人静息血小板提取物(3.9mg)与对照IgG(图1A)或抗GPIIb特异性抗体(图1B)的免疫沉淀物通过IEF(等电聚焦)在第一步中在pH 3-10梯度上分离。随后，在10％SDS-PAGE上进行第二维的蛋白质分离。凝胶经胶态考马斯染色并分析。只切下在具有特异性GPIIb抗体的凝胶上可见的蛋白质斑点，用胰蛋白酶消化(在胶内消化)，提取并通过MALDI-TOFMS分析。
图2显示了用抗LIMK-1抗体免疫沉淀后对整联蛋白GPIIb的检测。
人血小板提取物(2mg)以及人巨核细胞系DAMI和MEG-01与抗LIMK-1的特异性抗体的免疫沉淀物通过4-12％SDS-PAGE分离。通过电转移将蛋白质转移至硝酸纤维素膜。用特异性抗体检测整联蛋白GPIIb。
图3显示了用抗LIMK-1和GPIIb抗体免疫沉淀后对LIMK-1的检测。
人血小板提取物与抗LIMK-1和GPIIb的特异性抗体的免疫沉淀物通过10％SDS-PAGE分离。通过电转移将蛋白质转移至硝酸纤维素膜。用特异性抗体检测LIMK-1。
图4显示了血小板提取物以及DAMI和Meg-01细胞中LIMK-1的检测。
来自人血小板提取物的等量蛋白质(50μg)通过4-12％SDS-PAGE分离。通过电转移将蛋白质转移至硝酸纤维素膜。用特异性抗体检测LIMK-1。
图5显示了不同的人组织提取物中LIMK-1的检测。
来自人结肠、睾丸、肾、心脏、血小板、肝、肌肉、皮肤、胰、脑和胸腺组织的提取物的等量蛋白质通过4-12％SDS-PAGE分离。通过电转移将蛋白质转移至硝酸纤维素膜。用特异性抗体检测LIMK-1。
图6显示了在不同的人组织中通过定量Taqman分析对LIMK-1转录本的检测。
通过Taqman分析对人骨髓、结肠、睾丸、肾、心脏、血小板、肝、胎肝、肺、乳腺、胎盘、前列腺、唾液腺、肠、脊髓、脾、胃、气管、子宫、肌肉、胰、脑、胎脑和胸腺组织的mRNA进行了分析。
实施例1.材料&方法1.1血小板(凝血细胞)的制备从血库(4个供体的)凝血细胞浓缩物中制备凝血细胞。所有步骤在室温下进行。用Tyrode′s缓冲液(pH 7.4；137mmol/l NaCl，2.7mmol/l KCl，12mmol/l NaHCO3，0.36mmol/l NaH2PO4，1mmol/l MgCl2，10mmol/lHEPES，5.6mmol/l右旋糖)稀释凝血细胞浓缩物，并将所得的悬液在120×g下无制动减速地(without brake)离心15min。然后将前列腺素E1(PGE10.5μg/ml)加入到上清中，将混合物在室温下孵育5min并在650×g下无制动减速地离心15min。弃上清，将沉淀重悬于Tyrode′s缓冲液(具有0.1％BSA)中，并加入PGE1(0.5μg/ml)。将混合物在室温下孵育5min，随后在650×g下无制动减速地离心5min。弃上清，将沉淀重悬于Tyrode′s缓冲液(无BSA)中，加入PGE1(0.25μg/ml)，孵育混合物(室温下5min)并离心(650×g，15min，无制动减速)。再次弃上清，将沉淀重悬于Tyrode′s缓冲液(无BSA)中，将细胞在液氮中冷冻，然后贮存在-80℃备用。
1.2细胞培养将人DAMI和Meg-01巨核细胞系的培养物在含有10％胎牛血清(FCS)和青霉素/链霉素的Dulbecco′s改良的Eagles′s培养基(DMEM)中培养(37℃，5％CO2)。洗涤细胞、收获并将细胞沉淀贮存在-80℃，之后制备提取物。
1.3用于免疫沉淀的血小板的处理将冷冻的血小板沉淀在1-2ml裂解缓冲液(见下文)中解冻，然后通过移液管上下吸取进行重悬，接着进行超声(10次脉冲，30％)。通过离心血小板(5min，3.000×g)进行预分级以在上清液中富集可溶性蛋白质。
图1中所使用的裂解和洗涤缓冲液裂解缓冲液(pH 8)10mmol/l Tris，140mmol/l NaCl，1％Triton，0.05％SDS，1tab完全的200μmol/l pefabloc(4-(2-氨基乙基)-苯基磺酰氟氢氯化物)洗涤缓冲液(pH 8)10mmol/l Tris，140mmol/l NaCl，1％Triton图2中所使用的裂解和洗涤缓冲液裂解缓冲液(pH 7.5)50mmol/l Tris，50mmol/l NaCl，0.5％Triton，0.05％SDS，1mmol/l Na3VO4，1tab完全的1μg/ml抑胃酶肽，5mmol/lNaF洗涤缓冲液(pH 7.5)50mmol/l Tris，50mmol/l NaCl，0.1％Triton图3中所使用的裂解和洗涤缓冲液裂解缓冲液(pH 7.5)50mmol/l Tris，150mmol/l NaCl，1％Triton，1mmol/l Na3VO4，1tab完全的1μg/ml抑胃酶肽，50mmol/l NaF洗涤缓冲液(pH 7.5)50mmol/l Tris，150mmol/l NaCl，1％Triton1.4免疫沉淀依据抗体的类型，将A蛋白琼脂糖(Amersham Biosciences，乌普萨拉，瑞典)和G蛋白琼脂糖(Roche Diagnostics GmbH，曼海姆，德国)用于免疫沉淀。所有步骤在4℃进行。
在使用之前用洗涤缓冲液(见上文)将珠子洗涤3次。通过与珠子材料孵育1h(图1+2，3中不是)和随后离心(3min，500×g)预先除去血小板裂解物。将血小板溶解物与抗体孵育1h，然后加入珠子进行过夜免疫沉淀。在那之后，用洗涤缓冲液(见上文)洗涤珠子3次，然后通过与IEF再水合缓冲液(用于2D凝胶分析)或裂解缓冲液(用于1D凝胶分析)孵育进行洗脱。
1.5抗体说明GPIIb(Santa Cruz Biotechnology，Inc.in Santa Cruz，加利福尼亚，美国；Cat-No.sc-7310)用于免疫沉淀(A蛋白)GPIIb(Biotrend Chemikalien GmbH，科隆，德国；Cat-No.6065)用于Western印迹(1∶1000)LIMK(Santa Cruz Biotechnology，Inc.in Santa Cruz，加利福尼亚，美国；Cat-No.sc-5576)用于免疫沉淀(G蛋白)和Western印迹(1∶250)。
1.6 2D凝胶电泳第一维凝胶电泳使用Biorad Protean IEF细胞(IPG条带11cm，pH3-10)(Biorad Laboratories，Hercules，CA，美国)和如下的IEF再水合缓冲液(8mol/l尿素，0.5％CHAPS，10mmol/l DTT，0.2％Biolytes，0.001％溴酚蓝)进行。为进行活性再水合，将IPG条带于50V与185μl的样品体积静置过夜。用线性变速、8000V的终止电压和总计至少40000Vhrs进行IEF(等电聚焦)。在第二维之前在每一平衡缓冲液(pH 8.8；6mol/l尿素，2％SDS，0.375mol/l Tris，20％甘油，130mmol/l DTT或135mmol/l碘乙酰胺)中进行还原/烷基化10min。
使用Criterion 4-20％凝胶在150V和25mmol/l Tris、192mmol/l甘氨酸、0.1％SDS作为跑胶缓冲液中进行第二维凝胶电泳。
1.7 1D凝胶电泳使用X-细胞安全锁定系统(Novex系统；Invitrogen GmbH，卡尔斯鲁厄，德国)以及MOPS-SDS作为跑胶缓冲液且在150V电压下进行1D凝胶电泳。
1.8电转移/Western印迹(半干)对于电转移，使用Multiphor II系统(非连续的缓冲液系统)(Amersham，Biosciencies，乌普萨拉，瑞典)。阳极缓冲液1是0.3mol/l Tris、20％甲醇，阳极缓冲液2是25mmol/l Tris、20％甲醇，而阴极缓冲液是40mmol/l氨基己酸、0.01％SDS、20％甲醇。
使用0.8mA/cm2将蛋白质印迹到硝酸纤维素片(Schleicher & SchuellBioScience GmbH，Dassel/Relliehausen，德国；Protran BA85 0.45um)上。
1.9染色技术用胶态考马斯(Neuhoff等，1988)或银(自Blum等，1987改良的)对凝胶染色。对于改良的银染，将凝胶在40％乙醇/10％醋酸中固定1h，用30％乙醇洗涤两次，用水洗涤一次，每次20min，在0.02％Na2S2O3中敏化1min，用水洗涤(3×20sec)，用冷的0.1％AgNO3在4℃孵育20min，用水洗涤(3×20sec，然后1×1min)，用3％NaCO3/0.05％福尔马林显色，并在水中再一次洗涤20sec。最后用5％醋酸终止染色。
1.10成像在暴露于Hyperfilm ECL(Amersham Biosciences，乌普萨拉，瑞典；Cat-No.RPN2132)5min之后通过化学发光(ECL plus，AmershamBiosciences，乌普萨拉，瑞典；Cat-No.RPN2132)检测抗体，并通过Adefo-Developer(00009)和Adefo-Fixator(00062)(ADEFO-CHEMIEGmbH，Nürnberg，德国)显色。
1.11凝胶内消化根据Pandey等，2000进行凝胶内消化。简言之，人工切下凝胶斑点，且使用胰蛋白酶(猪的；Promega GmbH，曼海姆，德国；Cat-No.V511A)进行切割。
1.12 MALDI-TOF质谱使用Voyager DE-STR MALDI-TOF工作站(Applied Biosystems，Foster City，CA，美国)进行MALDI-TOF质谱。通过小液滴干燥法制备样品，并将其在2×96孔涂有聚四氟乙烯的样品板上点样，使用□-氰基-羟基-肉桂酸(3mg/ml，溶于乙腈/三氟乙酸中)作为基质。检测范围为700-4000Da。
1.13蛋白质测定使用BCA试剂盒(Pierce Chemical Company，罗克福德，伊利诺斯州，美国)根据制造商的说明(在562nm检测)测定样品的蛋白质含量。
1.14组织分布模式在凝胶上每个泳道施加50μg蛋白质。从BioCat GmbH(海德尔堡，德国)购买不同的人组织。血小板和巨核细胞中LIMK的检测通过事先在上清液中富集(图4和图5分别是离心15000×g 15min或3000×g 5min)而增强。
1.15 Taqman分析对于扩增，使用以下的PCR方案。以下所有的用于扩增的试剂都来自Applied Biosystems(Foster City，美国)20ng基因组DNA；1单位TaqGold聚合酶；1×Taq聚合酶缓冲液；500μM dNTP；2.5mmol/l MgCl2；200nmol/l每一个扩增引物对；H2O ad 5μl。
PCR扩增过程95℃×10min×1循环95℃×30sec70℃×30sec×2循环95℃×30sec65℃×30sec×2循环95℃×30sec60℃×30sec×2循环95℃×30sec56℃×30sec72℃×30sec×40循环72℃×10min4℃×30sec ×1循环1.16设备使用装备有CM5芯片和Ni-NTA芯片的Biacore 3000最高性能研究系统(Biacore International SA，79111Freiburg，德国)进行实验。
结果2.1 LIMK-1与整联蛋白GPIIb相互作用通过与商业上可获得的GPIIb的特异性抗体进行免疫共沉淀，我们富集了具有GPIIb的蛋白质复合物。这些复合物通过2维凝胶电泳分离(图1)。在该实验中获得的结果清楚地证明了LIMK-1与人血小板提取物中的整联蛋白GPIIb免疫共沉淀。
为了验证这些结果，我们利用血小板提取物以及人巨核细胞系DAMI和MEG-01提取物与商业上可获得的LIMK-1的特异性抗体进行免疫沉淀，随后通过Western分析检测GPIIb(图2)。这些结果证实了人血小板中整联蛋白GPIIb与LIMK-1相结合的发现。在人巨核细胞系DAMI和MEG-01中没能显示GPIIb与LIMK-1之间的相互作用。这些巨核细胞系是前体细胞系，经分化后能产生血小板(Fugman等，1990；George 2000；Greenberg等，1988；Ogura等，1988；Schick等，1998；Takeuchi等，1998；Vittet等，1992)。然而，对于我们的实验，我们使用了这些非分化形式的细胞系。当在这些非分化的巨核细胞系中分析GPIIb整联蛋白的表达水平时，我们发现GPIIb在这些细胞系中的表达相对于在血小板中的表达要低得多。这解释了为什么我们在这些细胞系中检测不到整联蛋白与LIMK-1之间的相互作用。
为进一步验证我们的结果，我们利用血小板提取物与商业上可获得的LIMK-1和GPIIb的特异性抗体进行免疫沉淀，随后通过Western分析检测LIMK-1(图3)。这些结果再次证实了我们先前的发现，即在人血小板中整联蛋白GPIIb与LIMK-1相结合。
2.2 LIMK-1的组织分布使用LIMK-1的特异性抗体，我们分析了LIMK-1在血小板以及巨核细胞系DAMI和MEG-01中的表达(图4)。这样，使用LIMK-1的特异性抗体，我们证实了LIMK-1在血小板中和在巨核细胞系DAMI和MEG-01中的表达。
此外，为了分析LIMK-1在不同人组织中的表达，我们通过凝胶电泳分离了人组织提取物进行随后的Western分析(图5)。这些结果显示了LIMK-1在睾丸、心脏、血小板、肌肉和脑组织中表达。虽然其表达并非绝对是血小板特异性的，但LIMK-1并非在所有组织中都普遍表达。这一发现得到Taqman分析的证实(图6)，该图显示了LIMK-1在脑、胎脑和睾丸中的表达。血小板没有在该Taqman组中表示。
权利要求
1.LIMK-1或LIMK-1类似物用于结合GPIIb的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中LIMK-1类似物是GPIIb/IIIa下游信号传递的激活剂或抑制剂，优选为其抑制剂。
3.根据权利要求1或2的用途，用于GPIIb/IIIa下游信号传递的激活或抑制，优选用于其抑制。
4.LIMK-1配体用于激活或抑制GPIIb/IIIa下游信号传递的用途，优选用于其抑制。
5.根据权利要求4的用途，其中LIMK-1配体是一种LIMK-1激动剂或LIMK-1拮抗剂，优选为LIMK-1拮抗剂。
6.LIMK-1、LIMK-1类似物或LIMK-1配体在制备用于预防或治疗血栓形成或血液凝固疾病的药物中的用途。
7.根据权利要求6的用途，其中LIMK-1类似物是GPIIb/IIIa下游信号传递的抑制剂，或者其中LIMK-1配体是LIMK-1拮抗剂。
8.根据权利要求6或7的用途，其中所述疾病是与血栓形成或血液凝固增加相关的疾病。
9.根据权利要求6至8任一项的用途，其中所述疾病是动脉血栓形成性疾病。
10.根据权利要求6至9任一项的用途，其中所述疾病选自心肌梗塞、不稳定型心绞痛、急性冠状动脉综合症、冠状动脉疾病、冠状动脉溶栓后再闭塞、血栓形成期间的闭塞和冠状动脉再狭窄、中风、短暂性脑缺血发作、肺栓塞、左心室功能障碍、患有心血管和脑血管疾病的患者的临床血管并发症的二级预防、动脉粥样硬化、血管介入性策略的结合药物治疗。
11.一种筛选LIMK-1类似物的方法，其中该方法包括步骤(a)提供GPIIb蛋白和任选地至少一个其下游信号传递元件；(b)提供测试化合物；和(c)检测测试化合物对GPIIb蛋白的结合，其中所述测试化合物衍生自LIMK-1。
12.根据权利要求11的方法，包括如下步骤以替换步骤(c)(c’)检测GPIIb/IIIa和/或其下游信号传递的激活或抑制。
13.一种筛选LIMK-1配体的方法，其中该方法包括步骤(a)提供LIMK-1蛋白；(b)提供测试化合物；和(c)检测测试化合物对LIMK-1蛋白的结合。
14.根据权利要求13的方法，还包括如下步骤以替换步骤(c)(c’)检测LIMK-1或GPII/IIIa下游信号传递的激活或抑制，优选检测其失活。
15.一种筛选与GPIIb/IIIa和/或其下游信号传递级联相互作用的测试化合物的方法，其中该方法包括步骤(a)提供LIMK-1蛋白；(b)提供GPIIb和/或至少一种其下游信号传递元件；(c)提供测试化合物；和(d)检测该化合物与LIMK-1蛋白的相互作用。
16.根据权利要求13至15任一项的方法，其中以化学化合物文库的形式提供所述测试化合物。
17.根据权利要求11至16任一项的方法，其中测试化合物与所述GPIIb蛋白或所述LIMK-1蛋白的结合或其对GPIIb和/或其下游信号传递的效应通过异质或均质测定法检测。
18.根据权利要求17的方法，其中异质测定法是ELISA(酶联免疫吸附试验)、DELFIA(解离增强镧系荧光免疫分析)或SPA(闪烁亲近测定法)。
19.根据权利要求17的方法，其中均质测定法是TR-FRET(时间分辨荧光共振能量转移)测定法、FP(荧光偏振)测定法、ALPHA(增强发光邻近均质分析)、EFC(酶片断互补)测定法。
20.根据权利要求11至19任一项的方法，其中该方法在阵列上进行。
21.根据权利要求11至17任一项的方法，其中该方法使用整个细胞进行。
22.根据权利要求11至21任一项的方法，其中该方法在机器人系统中进行。
23.根据权利要求11至22任一项的方法，其中该方法使用微流体学进行。
24.根据权利要求11至23任一项的方法，其中该方法是一种高通量输出筛选LIMK-1类似物或LIMK-1配体的方法。
25.一种制备用于预防或治疗血栓形成或血液凝固疾病的药物的方法，其中该方法包括步骤(a)实施根据权利要求11至24任一项的方法，(b)提供适量的所检测的化合物，和(c)将所检测的测试化合物与一种或多种药学上可接受的载体或辅助物质一起配制。
26.根据权利要求25的方法，其中该疾病是一种动脉血栓形成性疾病。
27.根据权利要求26的方法，其中动脉血栓形成性疾病选自心肌梗塞、不稳定型心绞痛、急性冠状动脉综合症、冠状动脉疾病、冠状动脉溶栓后再闭塞、血栓形成期间的闭塞和冠状动脉再狭窄、中风、短暂性脑缺血发作、肺栓塞、左心室功能障碍、患有心血管和脑血管疾病的患者的临床血管并发症的二级预防、动脉粥样硬化、血管介入性策略的结合药物治疗。
全文摘要
本发明涉及LIMK－1、LIMK－1类似物或LIMK－1配体用于结合GPIIb和/或激活或抑制GPIIb/IIIa下游信号传递(的用途)，用于制备预防或治疗血栓形成或血液凝固疾病的药物(的用途)，(涉及)筛选LIMK－1类似物或LIMK－1配体的方法以及制备治疗血栓形成或血液凝固疾病的药物的方法。
文档编号G01N33/86GK1889973SQ200480036080
公开日2007年1月3日 申请日期2004年11月23日 优先权日2003年12月4日
发明者A·吕克, T·莱乌, M·赫尔曼, G·西本霍恩 申请人:塞诺菲-安万特德国有限公司