一种基于适配体纳米金交联复合物的TNF‑α检测试试剂盒及方法与流程

本发明属于检测试纸技术领域，涉及一种基于适配体纳米金交联复合物的tnf-α检测试试剂盒及方法。

背景技术：

阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease，ad)是一种危害性高、医疗护理成本巨大、尚无根治方法的神经退行性疾病。随着我国社会老龄化过程，患者人数逐年增加，给社会带来了极大的负担，因此ad的早期诊断和干预具有重大意义。

已有的ad临床检测手段主要为：依靠认知量表测试结合核磁共振扫描，鉴定结果可靠度高，但对ad早期诊治敏感性不佳(患者没有明显症状或具有轻微的认知功能的减退(mildcognitiveimpairment，mci))；此外，检测样本为脑脊液，取样时常采用脊椎穿刺等手段，有副作用，并且不能进行多次取样，给疾病的追踪性检测带来困难。

体液标志物作为一种敏感性佳、特异性高、易于使用的指示剂，可真实反应ad的病理进程。肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor-α，tnf-α)是一种主要由巨噬细胞和单核细胞产生的炎症因子，参与机体的炎症反应。脑内慢性炎症反应是ad的重要病理特征之一。

技术实现要素：

本发明解决的问题在于提供一种基于适配体纳米金交联复合物的tnf-α检测试试剂盒及方法，利用核酸适配体和纳米金交联复合物比色检测tnf-α，能够简便、快速的检测待测样品中是否含有tnf-α。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种基于适配体纳米金交联复合物的tnf-α检测试剂盒，包括：

纳米金溶液，其中包括用于形成纳米金交联复合物的纳米金颗粒；

巯基化的单链序列dna1和dna2，dna1、dna2分别与纳米金颗粒连接，形成aunps-dna1颗粒和aunps-dna2颗粒；

单链连接序列linker，linker含有与tnf-α特异性结合的适配体序列，且linker的两端分别与dna1、dna2相互补；dna1、dna2和linker可杂交形成双链；

在进行检测时，aunps-dna1颗粒、aunps-dna2颗粒和linker在缓冲液中孵育后杂交形成纳米金交联复合物。

所述的纳米金交联复合物在与tnf-α结合前为团聚状态，反应溶液为蓝色；纳米金交联复合物与tnf-α结合后，tnf-α与linker上的适配体序列结合，破坏适配体纳米金交联复合物，纳米金由团聚状态变为分散状态，反应溶液由蓝色变为红色。

所述的dna1的核苷酸序列为：tcacttcgctgaaaaaaa-(ch3)3-sh；

所述的dna2的核苷酸序列为：sh-(ch3)6-ctgtattgtcgc；

所述的linker的核苷酸序列为：tcctccatccgcgagtgggcgacaatactgtcagcgttcact。

一种基于适配体纳米金交联复合物的tnf-α检测方法，包括以下操作：

1)纳米金的制备：利用柠檬酸钠还原法制备出粒径13～20nm的纳米金颗粒

2)巯基化的dna1、dna2分别与纳米金经盐老化方法连接形成aunps-dna1颗粒和aunps-dna2颗粒；

3)将aunps-dna1颗粒、aunps-dna2颗粒和linker杂交形成蓝色的适配体纳米金交联复合物；

4)将得到的适配体纳米金交联复合物离心，去除上清；沉淀重悬后得到重悬液；

5)向得到的重悬液中加入待检液，用加等量水作对照，孵育；

6)观察待检液加入后重悬液的颜色变化，若待检液中含有tnf-α，tnf-α特异性结合linker上的适配体，破坏纳米金交联复合物，纳米金由团聚状态变为分散状态，重悬液由蓝色变为红色；同时用紫外可见分光光度计测定其全波长。

所述纳米金的制备为：将氯金酸边搅拌边加热至沸腾，然后加入柠檬酸三钠水溶液，溶液由蓝转为红色后持续加热2～8min，冷却后得到纳米金溶液。

所述dna1、dna2在与纳米金结合前，先将其溶于灭菌超纯水中；dna1、dna2的浓度为0.1-1mm。

所述的linker的浓度为10-100μm；杂交条件为室温反应1小时，4℃过夜。

所述的dna1、dna2和linker的比例为1～10：1～10：1～10；

所述的重悬液含有100-300mmnacl和30mmtris-acetate；重悬液的ph为7～8；所述的待检液中tnf-α为溶解状态。

所述的孵育条件为室温孵育1h；全波长扫描时的波长为400-900nm。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的基于适配体纳米金交联复合物的tnf-α检测试纸条及方法，利用基于核酸适配体和纳米金交联复合物比色检测tnf-α，基于靶标特异性，优选出核酸适配体，核酸适配体无需标记，无需使用大型的仪器设备，克服了适配体需要标记而导致成本提高和电化学操作相对复杂的不足，降低了检测成本。

本发明提供的基于适配体纳米金交联复合物的tnf-α检测试纸条及方法，选择性和特异性好，这是由核酸适配体本身的特点和结构决定的，在筛选适配体的过程中加入tnf-α，用selex筛选方法，选出能与tnf-α特异性结合而不与其他物质发生特异性反应的核酸适配体；

本发明提供的基于适配体纳米金交联复合物的tnf-α检测试剂盒，基于ad进程中伴随的脑内神经炎症反应的发生，ad早期患者血清中tnf-α水平显著升高，可用于ad早期检测或其他炎症相关疾病的快速诊断，具有简便、快速、可靠性高等优点。

附图说明

图1为nupack模拟分析dna1、dna2和linker交联分析图；通过模拟分析，这三条单链杂交形成双链时所释放出的自由能为-52.11kcal/mol，可以看出这三条单链可以形成稳定的双链结构；

图2为本发明的检测原理示意图，小球为分散状态的纳米金颗粒，为dna1、dna2、巯基连接的aunps-dna1和aunps-dna2通过linker可以杂交形成网状结构的复合物，溶液由红色变为蓝色；引入tnf-α后，蓝色复合物的网状结构破坏，复合物分离成为aunps-dna1和aunps-dna2，纳米金呈现分散状态，溶液显示红色。

图3为适配体纳米金交联复合物交联前后的对比图，单分散状态的纳米金粒径在10～20nm左右，溶液呈现红色，当其通过适配体和纳米金表面的dna1、dna2交联后，溶液颗粒变大，呈现蓝紫色。

图4为适配体纳米金交联复合物交联前后的全波长扫描图，分散状态的纳米金最大吸收峰在520nm左右，当纳米金团聚后，溶液会发生红移现象。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明提供的基于适配体纳米金交联复合物的tnf-α检测试纸条及方法，利用核酸适配体和纳米金交联复合物比色检测tnf-α，基于核酸适配体和纳米金交联复合物来进行的，下面分别对其进行说明。

关于核酸适配体：

适配体是在体外通过selex过程人工筛选出来的一类和靶分子有着高度的特异性亲和能力的短链寡核苷酸序列，就像抗原-抗体结合一样，靶分子可以和它对应的适配体特异性地结合。

selex技术即指数富集的配基系统进化技术(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，selex)，利用分子生物学的技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，将寡核苷酸文库和靶分子相互作用，保留结合的寡核苷酸配基，经反复扩增、筛选数个循环，即可使与该靶分子特异性结合的寡核苷酸序列得到富集，利用该技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性与靶物质高度亲和的适配体。

dna1和dna2首先需与linker的对应区域互补，并通过linker连接后形成线性分子；同时，dna1、dna2自身以及之间不形成稳定的互补结构；linker设计时除考虑与dna1和dna2互补外，还考虑互补序列自身结构对适配体构象的影响，避免独自形成发夹结构等，影响对靶分子的识别。

具体的设计结果如表1所示，其中序列1为tnf-α适配体序列，序列2为dna1序列，序列3为dna2序列，序列4为linker序列。

序列表1

参见图1，图1为nupack模拟分析dna1、dna2和linker交联分析图，通过软件模拟分析，这三条单链杂交形成双链时所释放出的自由能为-52.11kcal/mol，可以看出这三条单链可以形成稳定的双链结构。

参见图2，红色小球为分散状态的纳米金颗粒，为dna1，为dna2，巯基连接的aunps-dna1和aunps-dna2通过linker可以杂交形成网状结构的复合物，溶液由红色变为蓝色；引入tnf-α后，蓝色复合物的网状结构破坏，复合物分离成为aunps-dna1和aunps-dna2，纳米金呈现分散状态，溶液显示红色。

具体的，本发明所提供的dna1、dna2、linker均由上海生工生物工程有限公司合成。

下面给出具体的检测方法：

(1)纳米金的制备：利用柠檬酸钠还原法制备出粒径13～20nm的纳米金备用；

(2)巯基化的dna1、dna2分别与纳米金经盐老化方法连接形成颗粒1(aunps-dna1)和颗粒2(aunps-dna2)；所述dna在和纳米金结合前，先将1od的dna溶解于60μl灭菌超纯水中，其中，dna1、dna2的浓度为0.1-1mm；具体的，dna1、dna2的浓度为0.5mm；

(3)aunps-dna1、aunps-dna2和linker杂交形成蓝色的适配体纳米金交联复合物；其中，杂交条件为室温反应1小时，4℃过夜；linker的浓度为10-100μm；

(4)将上一步骤中得到的适配体纳米金交联复合物离心，去除上清；离心条件为11600g，10min；dna1、dna2和linker的比例为1～10：1～10：1～10；

(5)沉淀用buffer重悬，得到重悬液；重悬液含有100-300mmnacl、30mmtris-acetate；重悬液的ph为7～8；

(6)向上一步骤中得到的重悬液中加入tnf-α，用加等量水作对照，孵育；孵育条件为室温，1h；所述的tnf-α溶解于200μl灭菌超纯水中，得到0.25mg/ml母液。

(7)观察颜色变化，加入tnf-α后溶液会由蓝色变为红色或者紫红色；同时用紫外可见分光光度计测定其400-900nm的全波长，观察样品最大吸收峰的波长，单分散状态的纳米金最大吸收峰在520nm处，当在linker的作用下发生团聚时，最大吸收峰的波长会红移至某一大于520nm的波长处(本发明中红移至550nm)，当加入tnf-α后，最大吸收峰会蓝移至520nm左右，通过一系列浓度梯度的tnf-α标品的a520/a550可以做出随tnf-α浓度变化的标准曲线。

上述方法中，tnf-α可以特异性结合其适配体，破坏适配体纳米金交联复合物，纳米金由团聚状态变为分散状态，溶液由蓝色变为红色，检测过程无需复杂的仪器和专业的操作人员，显色迅速，在室温下就可以进行，具有良好的灵敏性和特异性。

检测结果表明，本发明的灵敏度检测可达tnf-α190nm；检测速度：室温孵育1h后测定结果。

本发明的检测以定性为主，可进行半定量：在190～600nm浓度范围内，通过酶标仪测量结果可进行半定量。

进一步的，所述纳米金溶液的制备方法为：取50.0ml0.01％的氯金酸于100ml烧瓶中，在磁力加热搅拌器上加热至沸腾，加入1.0～5.0ml1％柠檬酸三钠水溶液，溶液由蓝转为红色后持续加热5min，即得所述纳米金溶液。

本发明的技术方案是基于以下原理实现的：dna1、dna2和linker是互补的单链核酸，在一定条件下，这三条单链可以杂交形成双链；linker中含tnf-α适配体序列，可与tnf-α特异性结合。巯基连接的aunps-dna1和aunps-dna2通过linker可以杂交形成网状结构的复合物，溶液由红色变为蓝色；检测时，无tnf-α，复合物不会发生变化，溶液仍为蓝色；引入tnf-α后，蓝色复合物的网状结构破坏，复合物分离成为aunps-dna1和aunps-dna2，纳米金呈现分散状态，溶液显示红色。

参见图3所示的，适配体纳米金交联复合物交联前后的全波长扫描图，分散状态的纳米金最大吸收峰在520nm左右，当纳米金团聚后，溶液会发生红移现象。

图4为适配体纳米金交联复合物交联前后的全波长扫描图，分散状态的纳米金最大吸收峰在520nm左右，当纳米金团聚后，溶液会发生红移现象；全波长扫描用以判断检测前后的具体状态的变化，辅助定性。

结果表明：酶标仪测定全波长表明，和0μl的tnf-α溶液对比，最大吸收峰从555nm移至530nm处，纳米金团聚体颗粒变小，溶液的蓝色增加。

以上给出的实施例是实现本发明较优的例子，本发明不限于上述实施例。本领域的技术人员根据本发明技术方案的技术特征所做出的任何非本质的添加、替换，均属于本发明的保护范围。