一种血吸虫病快速诊断试剂盒及其制备方法与流程

本申请属于生物技术领域，具体地说，涉及一种血吸虫病快速诊断试剂盒及其制备方法。

背景技术：

血吸虫病是世界上分布最广泛的人畜共患寄生虫病之一，其易感动物包括人、牛、羊等家畜及野生动物，涉及40多种哺乳动物。家畜感染血吸虫不仅给畜牧业生产造成重大损失，更为重要的是，患病家畜还是人体血吸虫病最主要的传染源，其严重危害着人类健康并直接影响着全球经济发展。在我国，血吸虫病虽然得到了一定的控制，但其仍然是一个重要的公共卫生问题。目前，血吸虫病的诊断仍然是血吸虫病防治工作的关键，它是寻找并确定指示血吸虫在机体存在的直接或间接证据，为血吸虫感染的临床诊断提供依据。

血吸虫病传统的检测方法为粪检等病原学检测，但该方法在中度或低度血吸虫病流行区域的敏感性并不令人满意，且费时、费力、漏检率较高，而且不能对该病进行早期诊断。为了解决这一问题，至今逾半个世纪研究者们一直致力于免疫学诊断方法的研制，目前免疫学诊断已被广泛用于血吸虫病的筛查及监测，并成为血防工作的主要手段，常用的方法主要包括环卵沉淀实验(copt)，酶联免疫吸附实验(elisa)、间接血凝实验(iha)等，但由于这些方法均有一定的缺陷，灵敏度仍不够高，操作复杂费时，且需要昂贵的仪器及技术熟练的分析人员，严重阻碍了其在现场大规模筛查中的应用，不能完全适应目前血吸虫病防治工作的需要。本发明申请人经过长期研究和实践证明，在应用已有免疫学诊断技术的基础上，发展一种新颖、快速、简便、适合于基层的能诊断多种动物血吸虫病的免疫学诊断方法，以适用于现场大规模筛查家畜血吸虫病。

技术实现要素：

有鉴于此，本申请所要解决的技术问题是提供了一种血吸虫病快速诊断试剂盒及其制备方法，以适用于广大基层疫区血吸虫病的筛查及监测。

为了解决上述技术问题，本申请公开了一种血吸虫病快速诊断试剂盒及其制备方法。本申请的血吸虫病快速诊断试剂盒包括：盒体、pvc底板、样品吸收垫、金标垫、nc膜、吸收垫、检测线和控制线；所述pvc底板固设在所述盒体上，所述样品吸收垫、金标垫、nc膜和吸收垫水平方向顺序相接并固定在所述pvc底板上；所述检测线和控制线设置在所述nc膜上；盒体盒面上对应于样品吸收垫的位置设置有加样孔，盒体盒面上对应于nc膜的位置设置有观察窗口。

如上所述的试剂盒，其中，该试剂盒是由血吸虫可溶性虫卵抗原和血吸虫可溶性虫卵抗原包被硝酸纤维膜作为质量控制线和检测线，用胶体金标记血吸虫可溶性虫卵抗原，利用双抗原夹心法制成。

本申请提供的血吸虫病快速诊断试剂盒的制备方法包括下列步骤：

(1)样品吸收垫的制备：

将浓度为0.5mg/ml-1mg/ml的植物凝集素或抗人红细胞抗体缓冲溶液处理包被载体，低温冻干，裁切成长条备用；

(2)胶体金溶液的制备：

采用柠檬酸钠还原法制备40nm的胶体金；

(3)可溶性血吸虫虫卵抗原的制备：

将可溶性血吸虫虫卵抗原研磨后，加入0.85％的生理盐水溶液中，置于-20℃冷冻过夜，白天溶解，如此反复冻融5-10次后置于碎冰块中，用超声波破碎3min，反复破碎10次，12000rpm高速离心30min，取上清液即为可溶性血吸虫虫卵抗原；

(4)胶体金标记血吸虫可溶性虫卵抗原的缓冲液体系及标记过程：

待胶体金冷却后，用0.1-0.5m的碳酸钾调节ph至值7.0-8.0；并取1ml用tris-hci缓冲液稀释至60-100ug/ml的血吸虫可溶性虫卵抗原在磁力搅拌下逐滴加入调好ph值的10ml胶体金溶液中，搅拌5-20min后加入稳定剂，继续搅拌5-20min，12000rpm,4℃离心5-30min，弃上清，用稳定剂重悬沉淀，同上法重复洗离3次后重悬至2ml，加10％的nan3,终浓度为0.2％，后于4℃保存；

(5)金标垫的制备：

将玻璃纤维用均浆剂浸泡片刻，20-40℃干燥30min；将血吸虫可溶性虫卵抗原—胶体金探针以5-20ul/cm²喷于玻璃纤维上，低温冻干；

(6)nc膜的包被：

用ph7.0-7.5的0.01-0.1mtris-hcl溶液稀释血吸虫或可溶性虫卵抗原、抗血吸虫可溶性虫卵抗原抗体，分别以1ul/cm²喷膜，20-40℃干燥，用含1-5％脱脂奶粉的封闭液封闭30min，用0.01-0.1mtris-hcl洗脱液漂洗，20-40℃烘干30min，密封后装入含干燥剂的铝箔袋中密封，4-20℃保存备用；

(7)硝酸纤维素膜设置检测线和控制线：

用包被机将吸入到检测线注射泵中的1mg/ml可溶性血吸虫虫卵抗原和吸入到控制线注射泵中的1mg/ml的igg包被到硝酸纤维素膜上分别形成检测线和控制线，于37℃干燥过夜备用；

(8)试剂盒的组装：

将pvc底板固设在所述盒体的底面上，所述盒体的顶面上设置有加样孔和观察窗口；

将制备好的样品吸收垫、金标垫、包被好的nc膜和吸收垫依次水平方向顺序相接并固定在所述pvc底板上，使得样品吸收垫的位置与盒体盒面上的加样孔相对应，nc膜的位置与盒体盒面上的观察窗口相对应。

与现有技术相比，本申请可以获得包括以下技术效果：

1、灵敏度高，特异性及重现性好；

2、操作简便快捷，不需要特殊仪器、设备，不需要专业培训即可操作，特别适于广大基层疫区血吸虫病的筛查及监测；

3、结果判定直观、准确、可靠；

4、制备成本低，适于规模化生产。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1是本申请实施例的血吸虫病快速诊断试剂盒的结构示意图；

图2是本申请实施例的血吸虫病快速诊断试剂盒的制备方法的流程图。

具体实施方式

以下将配合附图及实施例来详细说明本申请的实施方式，藉此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

图1是本申请实施例的血吸虫病快速诊断试剂盒的结构示意图。如图1示，本实施例的血吸虫病快速诊断试剂盒包括：盒体101、pvc底板102、样品吸收垫103、金标垫104、nc膜105、吸收垫106、检测线107和控制线108；所述pvc底板102固设在所述盒体101上，所述样品吸收垫103、金标垫104、nc膜105和吸收垫106水平方向顺序相接并固定在所述pvc底板102上；所述检测线107和控制线108设置在所述nc膜105上；盒体101盒面上对应于样品吸收垫103的位置设置有加样孔109，盒体101盒面上对应于nc膜105的位置设置有观察窗口110。

如上所述的血吸虫病快速诊断试剂盒，其中，所述试剂盒是由血吸虫可溶性虫卵抗原和血吸虫可溶性虫卵抗原包被硝酸纤维膜作为质量控制线和检测线，用胶体金标记血吸虫可溶性虫卵抗原，利用双抗原夹心法制成。

图2是本申请实施例的血吸虫病快速诊断试剂盒的制备方法的流程图。如图2所示，该方法包括下列步骤：

s101：样品吸收垫的制备。

具体的，将浓度为0.5mg/ml-1mg/ml的植物凝集素或抗人红细胞抗体缓冲溶液处理包被载体，低温冻干，裁切成长条备用。

s102：胶体金溶液的制备。

具体的，采用柠檬酸钠还原法制备40nm的胶体金。

s103：可溶性血吸虫虫卵抗原的制备。

具体的，将可溶性血吸虫虫卵抗原加入0.85％的生理盐水溶液中，置于-20℃冷冻过夜，白天溶解，如此反复冻融5-10次后置于碎冰块中，用超声波破碎3min，反复破碎10次，12000rpm高速离心30min，取上清液即为可溶性血吸虫虫卵抗原。

s104：胶体金标记血吸虫可溶性虫卵抗原的缓冲液体系及标记过程。

具体的，待胶体金冷却后，用0.1-0.5m的碳酸钾调节ph至值7.0-8.0；并取1ml用tris-hcl缓冲液稀释至60-100ug/ml的血吸虫可溶性虫卵抗原在磁力搅拌下逐滴加入调好ph值的10ml胶体金溶液中，搅拌5-20min后加入稳定剂，继续搅拌5-20min，12000rpm,4℃离心5-30min，弃上清，用稳定剂重悬沉淀，同上法重复洗离3次后重悬至2ml，加10％的nan3,终浓度为0.2％，后于4℃保存。

s105：金标垫的制备。

具体的，将玻璃纤维用均浆剂浸泡片刻，20-40℃干燥30min；将血吸虫可溶性虫卵抗原—胶体金探针以5-20ul/cm²喷于玻璃纤维上，低温冻干。

s106：nc膜的包被。

具体的，用ph7.0-7.5的0.01-0.1mtris-hcl溶液稀释血吸虫或可溶性虫卵抗原、抗血吸虫可溶性虫卵抗原抗体，分别以1ul/cm²喷膜，20-40℃干燥，用含1-5％脱脂奶粉的封闭液封闭30min，用0.01-0.1mtris-hcl洗脱液漂洗，20-40℃烘干30min，密封后装入含干燥剂的铝箔袋中密封，4-20℃保存备用。

s107：硝酸纤维素膜设置检测线和控制线。

具体的，用包被机将吸入到检测线注射泵中的1mg/ml可溶性血吸虫虫卵抗原和吸入到控制线注射泵中的1mg/ml的igg包被到硝酸纤维素膜上分别形成检测线和控制线，于37℃干燥过夜备用。

s108：试剂盒的组装。

具体的，将pvc底板102固设在所述盒体101的底面上，所述盒体101的顶面上设置有加样孔109和观察窗口110；将制备好的样品吸收垫103、金标垫104、包被好的nc膜105和吸收垫106依次水平方向顺序相接并固定在所述pvc底板102上，使得样品吸收垫103的位置与盒体101盒面上的加样孔109相对应，nc膜105的位置与盒体101盒面上的观察窗口110相对应。

综上所述，本申请提供的血吸虫病快速诊断试剂盒试剂盒包括：盒体、pvc底板、样品吸收垫、金标垫、nc膜、吸收垫、检测线和控制线；pvc底板固设在盒体上，样品吸收垫、金标垫、nc膜和吸收垫水平方向顺序相接并固定在pvc底板上；检测线和控制线设置在nc膜上；盒体盒面上对应于样品吸收垫的位置设置有加样孔，盒体盒面上对应于nc膜的位置设置有观察窗口。本申请提供的血吸虫病快速诊断试剂盒灵敏度高，特异性及重现性好，且操作简便快捷，特别适于疫区血吸虫病的筛查及监测。另外，本申请提供的血吸虫病快速诊断试剂盒还具有制备成本低，适于规模化生产的特点。

上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改，并能够在本申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求的保护范围内。