一种光交联丝胶蛋白水凝胶及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明涉及一种光交联丝胶蛋白水凝胶及其制备方法和应用，将甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白配制成溶液，然后与光引发剂（Irgacure 2959）溶液混合，通过紫外光照射得到所述丝胶蛋白水凝胶。所得的丝胶蛋白水凝胶具有良好的生物降解性能、自发荧光特性及可注射性能，可有效减少生物材料植入或取出所造成的创伤。更重要的是，该丝胶蛋白水凝胶在体内及体外均具有良好生物相容性，可有效的促进所载细胞的粘附。作为2D及3D细胞支架，该丝胶蛋白水凝胶可在无血清支持的条件下有效促进所搭载细胞的增殖及促进其形成有功能化的组织，作为伤口辅料可以促进皮肤伤口修复，可作为组织工程及再生医学生物材料。
【专利说明】
[0001] 一种光交联丝胶蛋白水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
[0002] 本发明涉及生物医用复合材料领域，尤其涉及一种光交联丝胶蛋白水凝胶及其制 备方法和应用。
[0003]
【背景技术】
[0004] 水凝胶是一种具有三维网络结构的高分子材料。因其含水量高、柔软、粘弹性以及 良好的生物相容性，已被应用于医用移植、生物传感、以及药物控制释放等领域。在组织工 程领域，水凝胶可作为支持细胞生长和繁殖的2D或3D生物支架。
[0005] 水凝胶的交联方式通常有化学交联、高能辐射交联、紫外光照射交联等。本发明中 主要使用的是紫外光照射交联法制备水凝胶。该方法制备所得的水凝胶具有良好的生物学 性能，不仅可以避免交联剂及高能辐射对生物活性物质的破坏，且反应能够在生理条件下 进行，有效保护所包埋物质的生物及理化性质，使其在治疗过程中发挥更大的功效。
[0006] 丝胶蛋白（Silk Sericin)是包裹在丝素纤维表层的一种天然大分子蛋白。长期以 来由于人们对丝胶蛋白认识的不足和研究的局限性，导致每年约有50,000吨丝胶在繅丝工 业中被当作废物处理，浪费了大量宝贵的天然资源，并造成了严重的环境污染。如果将废弃 的丝胶蛋白回收作为绿色材料应用于生物医学领域，将可能会带来巨大的社会经济效益， 并且可减少废弃物的排放保护生态环境。
[0007] 近年来，在生物医学领域，丝胶蛋白因具有良好的生物性能如生物可降解性、低免 疫原性、抗氧化性、细胞粘附性而受到广泛的关注。目前，已有报道将丝胶蛋白制备成水凝 胶应用于药物载体或组织工程领域。但是，目前已报道的丝胶蛋白水凝胶也存在一些相应 的缺陷，例如使用低温溴化锂提取的丝胶蛋白水凝胶其原材料为特定的丝素缺陷型突变蚕 茧，来源有限，提取的丝胶蛋白只能以溶液状态低温短期保存，而且常规灭菌会导致其降 解或变性；而通过高温碱水法提取的丝胶蛋白虽然可以通过简单过滤的方式进行灭菌保 存，但是在提取的过程中大分子蛋白质被严重降解而难以制备成纯丝胶蛋白水凝胶，只能 与其他高分子聚合物混合制备水凝胶。目前，并没有以高温碱水法提取丝胶蛋白制备纯丝 胶蛋白水凝胶的报道。
[0008] 为了解决丝胶蛋白水凝胶制备过程中所存在的问题，我们使用高温碱水法提取了 丝胶蛋白，并使用甲基丙烯酸酐对其进行了相应的改性。改性后所得甲基丙烯基修饰的丝 胶蛋白可通过冻干，以固态粉末的形式进行长期保存，且可通过简单过滤的方式进行灭菌， 十分有利于其后续的开发应用。并且甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白能够在紫外光照射下交联 制备形成水凝胶。该丝胶蛋白水凝胶具有良好的生物降解性能及可注射性能，可有效减少 生物材料植入体内或取出所造成的创伤。更重要的是，该丝胶蛋白水凝胶在体内及体外均 具有良好生物相容性，可有效的促进搭载细胞的粘附。作为2D及3D细胞支架，该丝胶蛋白水 凝胶可在无血清支持的条件下有效促进所搭载细胞的增殖，并且能够促进搭载细胞形成有 功能化的组织，具有后续开发为临床组织工程材料的潜力。此外该丝胶蛋白水凝胶能够促 进皮肤全皮层损伤的修复，促进其恢复正常功能。综上所述，我们认为发开此类丝胶蛋白水 凝胶作为组织工程及再生医学生物材料是一项十分具有研究及开发前景的工作。
[0009]
【发明内容】
[0010] 为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种光交联丝胶蛋白水凝胶的制备 方法，该方法主要是使用甲基丙烯酸酐修饰丝胶蛋白，然后使用紫外光激发交联制备了具 有良好的生物学性能的丝胶蛋白水凝胶，操作简便易行。
[0011]本发明提供了一种可作为2D或3D细胞支架的光交联丝胶蛋白水凝胶，该丝胶蛋白 水凝胶具有良好的生物降解性和生物相容性，可搭载多种细胞。
[0012] 本发明所述的光交联丝胶蛋白水凝胶，具有良好的药物控制释放性能，并可通过 控制甲基丙烯基的接枝度调控所搭载药物的释放速度。
[0013] 本发明提供了所述光交联丝胶蛋白水凝胶作为荧光探针在生物医学领域的应用。
[0014] 本发明提供了光交联丝胶蛋白水凝胶冻干支架制备方法。由所述光交联丝胶蛋白 水凝胶冷冻24小时后取出，再置于冷冻真空干燥机中干燥得到的丝胶蛋白水凝胶冻干支 架。
[0015] 本发明提供了所述光交联丝胶蛋白水凝胶冻干支架在组织工程中的应用。
[0016] 本发明提供了所述光交联丝胶蛋白水凝胶在软骨组织再生中的应用。
[0017] 本发明提供了所述光交联丝胶蛋白水凝胶在皮肤损伤修复中的应用。
[0018] 本发明丝胶蛋白水凝胶以任何形态或形式存在并应用于制备生物医药材料。
[0019] 具体的丝胶蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤： 1)丝胶蛋白的提取： 称取蚕茧(丝素缺陷型蚕茧（140 Nds，185 Nds)，家蚕蚕茧（白玉、皓月等），棹蚕蚕茧 (A. myIitta)或蓖麻蚕茧等），并将其剪成碎片，用水清洗，去除水分； 按每克蚕茧加入10-50 mL的0.01- 0.2 mol/L Na2CO3水溶液，在70-100°C条件下搅拌 0.5-3小时，使丝胶蛋白溶解，得到丝胶蛋白溶液； 离心去除所述丝胶蛋白溶液中的不溶性物质，透析12~72小时，获得澄清丝胶蛋白溶 液，冻干，得到丝胶蛋白粉末。
[0020] 2)甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白的制备： 将步骤1)中得到的丝胶蛋白或商品化的丝胶蛋白粉末以0.02-1 g/mL的比例溶解于 10-100 mL的磷酸缓冲液（pH 7.4~9.0)中，再按照每克丝胶蛋白加入0.1-1 g的比例滴 加甲基丙烯酸酐，置于20~45°C下反应0.5~36小时。反应完成后在去离子水中透析(截留分 子量为3.5 kDa) 12~72小时，冻干得到甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白粉末。
[0021] 3)甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白溶液的配制 将步骤2)获得的甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白粉末溶于去离子水或PBS或培养基中，制 成浓度为1%_40% (W/V，g/mL)甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白溶液。
[0022] 4)光引发剂Irgacure 2959溶液的配制 称取I g Irgacure 2959分散于10-1000 mL去离子水中，加热至80-100 °C，制成浓度 为0.1%-10% (W/V，g/mL) Irgacure 2959溶液； 2)丝胶蛋白水凝胶的制备 按体积比1000/1~100/1将甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白溶液与Irgacure 2959溶液混 合，通过紫外光照射得到所述丝胶蛋白水凝胶。
[0023] 进一步的，在本申请的方案中，所述甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白溶液(丝素缺陷型 蚕苗（140 Nds、185 Nds)，家蚕蚕苗（白玉、暗月），棹蚕蚕苗(A. mylitta)，商品化丝胶蛋 白）的浓度为100~400 g/L。
[0024] 更进一步的，所述Irgacure 2959溶液的浓度为1-10 g/L。
[0025] 更进一步的，在本申请的方案中，使用的紫外光照射强度为3-10 mV/cm2 更进一步的，在本申请的方案中，使用的紫外光照射时间为10-300秒。
[0026] 本发明的方案具有以下优点： 1)本发明以丝素缺陷型蚕茧、家蚕蚕茧（白玉、皓月）、棹蚕蚕茧(A. mylitta)或商业 化的丝胶粉末作为原料，采用高温碱液法提取并通过甲基丙烯基修饰获得了具有良好生物 学特性的丝胶蛋白，该丝胶蛋白可通过简单过滤的方式进行灭菌，并可制备成粉末状长期 保存。
[0027] 2)本发明首次通过紫外光照射交联的方式制备了丝胶蛋白水凝胶，该丝胶蛋白 水凝胶具有良好的生物降解性和生物相容性，可作为细胞及药物载体。
[0028] 3)本发明制备的丝胶蛋白水凝胶可通过调整甲基丙基的取代度、丝胶蛋白浓度、 光引发剂浓度及凝胶温度调控凝胶时间及降解速度。
[0029] 4)本发明制备的丝胶蛋白水凝胶可作为3D生物支架搭载及培养各种细胞； 5) 本发明制备的丝胶蛋白水凝胶保持了丝胶蛋白良好的自发荧光特性； 6) 本发明制备的丝胶蛋白水凝胶可作为良好的细胞及药物载体，通过皮下注射或者 肌肉注射的方式注入体内，并可通过丝胶蛋白的自发荧光特性监测细胞及药物在体内的情 况。
[0030] 7)本发明制备的丝胶水凝胶可作为组织工程材料应用于骨损伤修复、皮肤损伤 修复、肌肉损伤修复等。
[0031] 8)本发明制备的丝胶水凝胶可经冷冻干燥得到不同孔径的丝胶蛋白水凝胶冻干 支架，该冻干支架可应用于多种组织损伤的修复。
[0032]
【附图说明】
[0033]图1为丝胶蛋白（2)、甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白（3,4,5)的SDS-PAGE电泳图谱。 [0034]图2A为甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白核磁共振图谱。
[0035]图2B为丝胶蛋白及甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白红外光谱。
[0036]图2C为甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白水凝胶红外光谱。
[0037]图2D为甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白水凝胶实物图。
[0038]图3A为甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白水凝胶压缩模量。
[0039] 图3B为丝胶蛋白水凝胶(SMH-I、SMH-2、SMH-3)的吸水膨胀率(37°C)。
[0040] 图3C为丝胶蛋白水凝胶(SMH-I、SMH-2、SMH-3)冻干产物内部结构SEM扫描。
[0041] 图30为丝胶蛋白水凝胶(31〇-1、31〇-2、31〇-3)的降解曲线（37°〇。
[0042] 图3E为丝胶蛋白水凝胶(SMH-I、SMH-2、SMH-3)体外HRP释放曲线。
[0043]图4A为丝胶蛋白荧光光谱。
[0044]图4B为甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白荧光光谱。
[0045]图4C、4D、4E为丝胶蛋白水凝胶荧光光谱。
[0046]图4F为激光共聚焦显微镜下观察到的丝胶蛋白水凝胶(SMH-I、SMH-2、SMH-3)冻干 产物荧光情况. 图4G为丝胶蛋白水凝胶体内小动物荧光成像。
[0047]图5A为Raw264.7细胞经丝胶蛋白水凝胶刺激后的细胞形态。
[0048]图5B为Raw264.7细胞经丝胶蛋白水凝胶刺激后红色荧光统计。
[0049] 图5C为Raw264.7细胞经丝胶蛋白水凝胶刺激后mRNA水平TNF-α表达量统计。
[0050] 图ro为Raw264.7细胞经丝胶蛋白水凝胶刺激后mRNA水平IL-Ιβ表达量统计。 图5E为Raw264.7细胞经丝胶蛋白溶液刺激后mRNA水平TNF-α表达量统计。 图5F为Raw264.7细胞经丝胶蛋白溶液刺激后mRNA水平IL-Ιβ表达量统计。
[0051] 图6A为丝胶蛋白水凝胶注入小鼠体内后，14天切出后H&E染色。
[0052]图6B为丝胶蛋白水凝胶注入小鼠体内后，14天切出后⑶68染色。
[0053]图6C为丝胶蛋白水凝胶注入小鼠体内后，14天切出后⑶68染色，阳性细胞统计。 [0054]图7A为小鼠肌细胞(C2C12)种植于丝胶蛋白水凝胶表面形态。
[0055]图7B为小鼠肌细胞(C2C12)种植于丝胶蛋白水凝胶细胞骨架染色。
[0056]图7C为人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、小鼠肌细胞(C2C12)与丝胶蛋白水凝胶共培养 后，细胞活力值统计。
[0057]图8为人脐静脉内皮细胞(HUVEC)种植于丝胶蛋白水凝胶表面形态。
[0058]图9A为丝胶蛋白促进小鼠成肌细胞(C2C12 )增殖统计。
[0059]图9B为丝胶蛋白水凝胶促进小鼠成肌细胞(C2C12)增殖统计。
[0060] 图9C为丝胶蛋白水凝胶与小鼠成肌细胞(C2C12)共孵育后，细胞周期。
[0061] 图IOA为丝胶蛋白促进原代软骨细胞增殖统计。
[0062] 图IOB为丝胶蛋白水凝胶促进原代软骨细胞增殖统计。
[0063] 图IOC为丝胶蛋白水凝胶与原代软骨细胞共孵育后，细胞周期。
[0064]图IIA为丝胶蛋白水凝胶3D培养流程图。
[0065]图IIB为丝胶蛋白水凝胶3D培养小鼠成肌细胞(C2C12)活死细胞染色。
[0066]图11C为丝胶蛋白水凝胶3D培养小鼠成肌细胞(C2C12)活细胞统计。
[0067]图IlD为丝胶蛋白水凝胶3D培养小鼠成肌细胞(C2C12)细胞活力统计。
[0068]图12A为丝胶蛋白水凝胶3D体内培养流程图。
[0069]图12B为丝胶蛋白水凝胶体内3D培养原代软骨细胞实物图。
[0070]图12C为丝胶蛋白水凝胶体内3D培养原代软骨细胞，各时间点H&E染色。
[0071]图13A为丝胶蛋白水凝胶作为全皮层损伤修复材料应用于皮肤损伤修复不同时 间点伤口恢复观察图。
[0072]图13B为伤口恢复程度统计。
[0073]图13C为丝胶蛋白水凝胶修复后不同时间点H&E染色图及Masson染色图， Tegaderm及皮耐克为商业化伤口敷料，作为对照。
[0074]图14A为丝胶蛋白水凝胶修复后，不同时间点小鼠皮肤CD68、ΜΡ0染色。
[0075] 图14B为CD68阳性细胞统计。
[0076] 图14C为MPO阳性细胞统计。
[0077]图15A为丝胶蛋白水凝胶修复后，不同时间点小鼠皮肤VEGFR、CD31染色。
[0078] 图15B为VEGFR阳性细胞统计。
[0079] 图15C为⑶31阳性细胞统计。
[0080] 图16为丝胶蛋白水凝胶修复后，不同时间点小鼠皮肤α-SM染色及α-SM阳性细胞 统计。
[0081] 图17A为修复后第14天伤口观察图。
[0082]图17B为修复后第14天伤口组织H&E染色。
[0083]图17C为修复后第14天伤口组织毛囊密度统计。
[0084]图17D为修复后第14天伤口组织皮肤厚度统计。
[0085]
【具体实施方式】
[0086] 实施例1本发明提供的丝胶蛋白水凝胶的制备 蚕苗的选择： 选用丝素缺陷型蚕茧（140 Nds、185 Nds)、家蚕蚕茧（白玉、皓月）、棹蚕蚕茧（A. mylitta)、商业购买的丝胶粉末(湖州新天丝生物技术有限公司购买），主要的化学成分为： 丝胶蛋白。
[0087]步骤1).丝胶蛋白的提取 1. 称取丝素缺陷型蚕茧（140 Nds、185 Nds)或家蚕蚕茧（白玉、皓月）或棹蚕蚕茧(A. mylitta)100 g剪成碎片，后置于洁净的烧杯中，用超纯水清洗3次，3500 rpm离心5分钟去 除水分； 2. 向步骤1的蚕茧碎片中加入3~4 L的摩尔浓度为0.02 mol/L的Na2CO3溶液或3~4 L 的去离子水，将其置于恒温水浴锅内l〇〇°C水浴1小时，使丝胶蛋白溶解，得到丝胶蛋白溶 液； 3. 将步骤2得到溶液转入离心管内3500 rpm离心5分钟，去除不溶性物质，得到澄清的 溶液； 4. 将步骤3中的澄清溶液转移至到预处理的透析袋(截留分子量:3.5 kDa)中，将透析 袋两端用透析袋夹夹紧，置于有ddH20的烧杯中，慢速搅拌透析，每隔3小时换一次水，共透 析72小时，获得丝胶蛋白溶液； 5. 可选的，将步骤4中丝胶蛋白溶液转到离心管中，3500 rpm离心5分钟，去除沉淀； 6. 将步骤5中得到的丝胶蛋白溶液冻干成丝胶蛋白粉末，置于-20°C冰箱保存备用。 [0088]步骤2).甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白的制备 1.称取步骤1)中丝胶蛋白粉末或商品化丝胶蛋白粉末6 g在35 °C条件下溶解于30 mL磷酸缓冲液中； 2. 将3.6 g甲基丙烯酸酐加入到步骤1中，反应12-72小时，得到甲基丙烯基修饰的丝 月父蛋白洛液； 3. 将甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白溶液转入到预处理的透析袋(截留分子量:3.5 kDa) 中，用透析袋夹夹紧，置于含有CldH2O的烧杯中，慢速搅拌透析，每隔3小时换一次水，共透析 48小时； 4. 将步骤3中的甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白溶液冻干，置于-20°C冰箱保存备用。
[0089] 步骤3). Irgacure 2959溶液的配制 1. 称取I g Irgacure 2959分散于 100 mL ddH2〇中； 2. 将步骤1中的溶液加热至80-100 °C。
[0090] 步骤4).甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白溶液的配制 将甲基丙烯基修饰的丝蛋白粉末溶解于ddH20中，浓度调整到100 g/L左右，得到的甲 基丙烯基修饰的丝胶蛋白溶液； 步骤5).丝胶蛋白水凝胶的制备 将甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白溶液与Irgacure 2959溶液按体积比1000/1-100/1充分 混匀，置于紫外光照射（6 mV/cm2，l min)得到丝胶蛋白水凝胶SMH-1。
[0091] 实施例2本发明提供的丝胶蛋白水凝胶的制备 本实施例中丝胶蛋白溶液制备方法与实施例1的制备方法相同，不同之处在于，步骤2) 按照以下进行： 1. 称取步骤1)中丝胶蛋白粉末或商品化丝胶蛋白粉末6 g在35 °C条件下溶解于30 mL磷酸缓冲液中； 2. 将0.024 g甲基丙烯酸酐加入到1)中，反应12-72小时，得到甲基丙烯基修饰的丝 月父蛋白洛液； 3. 将甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白溶液转入到预处理的透析袋(截留分子量:3.5 kDa) 中，用透析袋夹夹紧，置于含有CldH2O的烧杯中，慢速搅拌透析，每隔3小时换一次水，共透析 48小时； 4. 将3中的甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白溶液冻干，置于-20°C冰箱保存备用。
[0092] 5.将甲基丙烯基修饰的丝蛋白粉末溶解于ddH20中，浓度调整到100 g/L左右，得 到的甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白溶液； 6. 将Irgacure 2959粉末溶解于ddH2〇中，浓度调整到10 g/L左右，得到Irgacure 2959溶液； 7. 将甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白溶液与Irgacure 2959溶液按体积比1000/1-100/1 充分混匀，置于紫外光照射（6 mV/cm2，l min)得到丝胶蛋白水凝胶SMH-2。
[0093] 实施例3本发明提供的丝胶蛋白水凝胶的制备 本实施例中丝胶液制备方法与实施例1的制备方法相同，不同之处在于，步骤2)按照以 下进行： 1.称取步骤1)中丝胶蛋白粉末或商品化丝胶蛋白粉末6 g在35 °C条件下溶解于30 mL磷酸缓冲液中； 2. 将0.024 g甲基丙烯酸酐加入到1)中，反应12-72小时，得到甲基丙烯基修饰的丝 月父蛋白洛液； 3. 将甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白溶液转入到预处理的透析袋(截留分子量:3.5 kDa) 中，用透析袋夹夹紧，置于含有CldH2O的烧杯中，慢速搅拌透析，每隔3小时换一次水，共透析 48小时； 4. 将3中的甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白溶液冻干，置于-20°C冰箱保存备用。
[0094] 5.将甲基丙烯基修饰的丝蛋白粉末溶解于ddH20中，浓度调整到100 g/L左右，得 到的甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白溶液； 6. 将Irgacure 2959粉末溶解于ddH2〇中，浓度调整到10 g/L左右，得到Irgacure 2959溶液； 7. 将甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白溶液与Irgacure 2959溶液按体积比1000/1-100/1 充分混匀，置于紫外光照射（6 mV/cm2, I min)得到丝胶蛋白水凝胶SMH-3。
[0095] 实施例4丝胶蛋白水凝胶冻干支架的制备 将获得的丝胶蛋白水凝胶SMH-I，SMH-2，SMH-3置于-80°C，冷冻24小时后取出；将样品 置于冷冻真空干燥机中干燥，得到三种不同孔径丝胶冻干支架。
[0096] 实施例5丝胶蛋白、甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白、丝胶蛋白水凝胶、以及所述丝胶蛋白 水凝胶冻干支架的表征检测。
[0097] 图1为本申请实施例1步骤1)制成的丝胶蛋白、实施例1步骤2)制成的甲基丙烯基 修饰的丝胶蛋白SDS-PAGE电泳图谱。
[0098]使用SDS-PAGE电泳对实施例1中步骤1)、2)制成的丝胶蛋白，甲基丙烯基修饰的丝 胶蛋白进行分析，结果见图1。其中1为标准蛋白（marker)，2为丝胶蛋白，3、4、5为甲基丙烯 基修饰的丝胶蛋白。丝胶蛋白、甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白均主要为弥散型，说明甲基丙烯 基的修饰并不会改变丝胶蛋白的天然构象，有利于保持丝胶蛋白良好的生物学特性。
[0099]图2A为实施例1中步骤2)制成的甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白的核磁共振图谱。 [0100]由图2A可以看出，在位移为5.5-6.0之间出现的峰为双键峰，证明甲基丙烯基修饰 的丝胶蛋白已经成功制备。
[0101]图2B、2C分别为实施例1步骤2)制成的甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白（Sericin-MA)， 步骤1)制成的丝胶蛋白（Sericin)、以及实施例2步骤5)、实施例3步骤5)、实施例4步骤5)制 成的丝胶蛋白水凝胶(SMH-I、SMH-2、SMH-3)的红外光谱。
[0102] 利用傅里叶变换红外光谱仪(Nexus, Thermal Nicolet, USA)检测丝胶蛋白、甲 基丙烯基修饰的丝胶蛋白及丝胶蛋白水凝胶在4000-650 Cnf1的红外光谱。
[0103] 检测结果如图2B、2C所示：丝胶蛋白（Sericin)、甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白 (Sericin-ΜΑ)，丝胶蛋白水凝胶（SMH-I、SMH-2、SMH-3)的特征峰酰胺I、酰胺Π 、酰胺ΙΠ 谱 带基本相同，表明丝胶蛋白水凝胶（SMH-I、SMH-2、SMH-3)中的蛋白质二级结构基本没有改 变，丝胶蛋白水凝胶（SMH-I、SMH-2、SMH-3)能很好的维持丝胶蛋白的天然构象。
[0104] 图2D为实施例4步骤5 )制成的丝胶蛋白水凝胶(SMH-I、SMH-2、SMH-3)的实物图。
[0105] 实验结果表明甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白经紫外光照射后可成功制备成丝胶蛋 白水凝胶。
[0106] 图3A为实施例1-3制成的丝胶蛋白水凝胶SMH-I、SMH-2、SMH-3压缩模量图。
[0107] 如图3A所示，本发明制备的丝胶蛋白水凝胶有较好的机械性能，其机械性能的大 小可甲基丙烯基取代度调控。
[0108] 图3B为实施例1-3制成的丝胶蛋白水凝胶SMH-I、SMH-2、SMH-3吸水膨胀（37°C)。
[0109] 丝胶蛋白水凝胶吸水膨胀率的测定是通过将丝胶蛋白水凝胶冻干、称重、浸泡于 PBS溶液中，在不同时间点，取出按以下公式测定。（其中Ws为膨胀状态下的重量，Wd为干
重)。
[0110] 结果如图3B所示：丝胶蛋白水凝胶（SMH-I、SMH-2、SMH-3)最大的膨胀率可分别达到 10.31倍、9.02倍、7.51倍;表明丝胶蛋白水凝胶具有很好的吸水性能，且该水凝胶的吸水性 能可通过控制甲基丙烯基取代度调节。
[0111] 图3C为度丝胶蛋白水凝胶冻干产物内部结构SEM扫描观察图。
[0112] 观察如图3C所示：甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白水凝胶SMH-I (左）、SMH-2(中）、 SMH-3(右）的冻干产物在扫描电子显微镜下观察内部存在大量孔洞结构。丝胶蛋白水凝胶 这种独特的多孔结构十分适于作为细胞支架搭载支持细胞生长，并且十分有利于营养物质 的交换。
[0113] 图3D为丝胶蛋白水凝胶(SMH-I、SMH-2、SMH-3)的降解曲线(37°C)。
[0114] 将丝胶蛋白水凝胶浸泡于PBS(pH 7.4)溶液中，在不同时间点，取出冻干称重，结 果见图3D。
[0115] 如图3D所示，丝胶蛋白水凝胶在第1天内迅速降解，在5天后该水凝胶逐渐开始缓 慢降解。在第45天时分别降解72.80% (SMH-I) ,46.62% (SMH-2)，36.67% (SMH-3)。该丝胶 蛋白水凝胶的降解速度可通过控制甲基丙烯基的接枝度来调控。
[0116] 实施例6丝胶蛋白水凝胶作为大分子药物HRP控释载体 一、实验过程 1. 取4 yL辣根过氧化物酶(HRP)溶液（2 yg/yL)与150 yL甲基丙烯基修饰的丝胶蛋 白液(100 g/L)混合； 2. 向1中加入体积比15 yL的Irgacure 2959(1%，W/V)，紫外光照射（6 mV/cm2， lmin)，交联后放入4°C冰箱放置24小时； 3. 在样品中加入PBS (pH 7.4) 2 mL置于37°C; 4. 在第0·5、1、2、3、4、5、7、12、18天，小心取出清液，并重新加入I mL PBS (pH 7.4); 5. 采用酶联免疫法(ELISA)测量上清液中HRP的含量，通过计算各个时间点上清液中 累计的HRP含量与实际载药量的比值即得到累计释放率。
[0117]二、实验分析 如图3E所示:丝胶蛋白水凝胶对大分子蛋白质药物(HRP)有良好的控释作用，可通过调 节甲基丙烯基取代度调控释药速度，是良好的药物载体材料。
[0118] 实施例7丝胶蛋白水凝胶体外荧光特性 一、丝胶蛋白荧光特性测试 1. 分别称取冻干的丝胶蛋白粉末及甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白粉末各100 yg用水配 制成浓度为100 yg/mL的丝胶蛋白溶液； 2. 利用荧光光谱测试仪测试1中丝胶蛋白溶液从320 nm~600 nm的荧光光谱。
[0119] 二、丝胶蛋白水凝胶(SMH-I、SMH-2、SMH-3)荧光特性的测试 1. 分别取丝胶蛋白水凝胶(SMH-I、SMH-2、SMH-3)各IOOyL，制备成丝胶蛋白水凝胶膜； 2. 利用荧光光谱测试仪测试1中丝胶蛋白水凝胶(SMH-I、SMH-2、SMH-3)从320 nm~600 nm的荧光光谱。
[0120] 三、丝胶蛋白水凝胶(SMH-I、SMH-2、SMH-3)冻干产物激光共聚焦测试 1. 制备丝胶蛋白水凝胶(SMH-I、SMH-2、SMH-3)冻干产物； 2. 利用激光共聚焦显微镜观察丝胶蛋白水凝胶(SMH-I、SMH-2、SMH-3)的冻干产物。
[0121] 四、实验分析 1. 如图4A、4B所示，甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白与丝胶蛋白相比，荧光光谱并没有发 生明显的变化，说明甲基丙烯基修饰并不会影响丝胶蛋白的荧光特性； 2. 如图4C、4D、4E所示，丝胶蛋白交联形成水凝胶后荧光光谱并没有发生明显的变化， 说明丝胶蛋白水凝胶仍然保持了丝胶蛋白的荧光特性； 3. 如图4F所示，激光共聚焦结果表明丝胶蛋白水凝胶冻干产物仍然保持了丝胶的荧 光特性。
[0122] 实施例8丝胶蛋白水凝胶体内荧光特性 一、丝胶蛋白水凝胶(SMH-I、SMH-2、SMH-3)小鼠体内荧光成像检测 1. 将丝胶蛋白水凝胶(31^-1、31!1-2、30!1-3) 200以1^通过注射的方式注射到841^/(3小 鼠的背部； 2. 利用小动物体内荧光成像仪观察其在激发光为420 nm，发射光为520 nm的荧光情 况。
[0123] 二、实验分析 1.如图4G所示，小动物体内荧光成像结果表明丝胶蛋白水凝胶(SMH-I、SMH-2、SMH-3) 在体内仍旧保持了其荧光的特性，可利用其荧光的特性进行体内细胞及药物控释的示踪。
[0124] 实施例9丝胶蛋白水凝胶体外生物相容性测试 一、实验过程 1. 首先使用DMEM高糖培养基，在37°C，在5%的⑶2,100%湿度情况下培养Raw 264.7细 胞24小时 2. 接着将丝胶蛋白水凝胶(SMH-I、SMH-2、SMH-3)铺于6孔板中，每种丝胶蛋白水凝胶 各种三孔平行样； 3. 将细胞培养瓶收集的Raw 264.7细胞使用培养基重新悬浮、吹散后，种植于丝胶水 凝胶表面，每孔细胞数目约为IO5; 4.在第2天对其进行鬼笔环肽/DAPI染色； 二、实验分析 1. 如图5A、B所示，丝胶蛋白水凝胶(SMH-I、SMH-2、SMH-3)与对照组(LPS)相比，并不 会刺激Raw264.7细胞分化； 2. 实验结果证明，丝胶蛋白水凝胶有较好的细胞相容性。
[0125] 实施例10丝胶蛋白水凝胶体外生物相容性测试 一、 实验过程 1. 首先使用DMEM高糖培养基，在37°C，在5%的⑶2,100%湿度情况下培养Raw 264.7细 胞24小时； 2. 接着将丝胶蛋白水凝胶(SMH-I、SMH-2、SMH-3)铺于6孔板中，每种丝胶蛋白水凝胶 各种三孔平行样； 3. 将细胞培养瓶收集的Raw 264.7细胞使用培养基重新悬浮、吹散后，种植于丝胶水 凝胶表面，每孔细胞数目约为IO5; 4. 在第2天提取细胞RNA，对其进行TNF-a、IL-Ιβ的mRNA水平检测； 二、 实验分析 1 ·如图5C、D所示，丝胶蛋白水凝胶（3]\^-1、3]\^-2、3]\^-3)组了陬-(1、几-16的1111?嫩水平 明显低于阳性对照组(LPS )，接近于空白对照组； 2.实验结果证明，丝胶蛋白水凝胶有较好的细胞相容性。
[0126] 实施例11丝胶蛋白水凝胶体内生物相容性 一、 实验过程 1. 将丝胶蛋白溶液（100 g/L) 200 yL与20 yL Irgacure 2959(1%，W/V)混合通过注射 的方式注射到BALB/c小鼠的背部； 2. 利用紫外光照射(6 mV/cm2, Imin)交联形成水凝胶； 3. 在第14天将水凝胶及附近组织取出进行H&E与⑶68染色 二、 实验分析 1.如图6A所示，H&E染色结果表明丝胶蛋白水凝胶(SMH-I、SMH-2、SMH-3)在小鼠体内 并没有明显炎性反应发生。
[0127] 2.如图6B、7C所示，⑶68染色及⑶68阳性细胞（巨噬细胞)结果显示丝胶蛋白水凝 胶（SMH-I、SMH-2、SMH-3)在小鼠体内巨噬细胞数目与Alginate水凝胶组相比没有明显差 异，表明丝胶蛋白水凝胶有较好的体内生物相容性。
[0128] 实施例12丝胶蛋白水凝胶细胞毒性测试 一、实验过程 1. 首先使用DMEM高糖培养基，在37°C，在5%的CO2，100%湿度情况下培养人脐静脉内皮 细胞HUVEC、小鼠成肌细胞C2C12 24小时； 2. 接着将丝胶蛋白水凝胶(SMH-I、SMH-2、SMH-3)铺于96孔板中，每种丝胶蛋白水凝胶 各种三孔平行样； 3. 使用培养基对细胞培养瓶收集的人脐静脉内皮细胞HUVEC、小鼠成肌细胞C2C12重 新悬浮、吹散，种植于丝胶水凝胶表面，每孔细胞数目约为8000; 4. 孵育48、96小时； 5. 48、96小时后向3中每孔加入10 yL CCK-8孵育1小时； 6. 利用酶标仪测量其在490 nm和630 nm的吸光度值。
[0129] 二、实验分析 1. 如图7C所示，丝胶蛋白水凝胶(SMH-I、SMH-2、SMH-3)对HUVEC、C2C12细胞基本没有 毒性，细胞存活率(即细胞活力)基本都保持在90%左右； 2. 实验结果证明，丝胶蛋白水凝胶有较好的细胞相容性。
[0130] 实施例13丝胶蛋白水凝胶细胞粘附测试 一、 实验过程 1. 首先使用DMEM高糖培养基，在37°C，在5%的CO2，100%湿度情况下培养人脐静脉内皮 细胞HUVEC、小鼠成肌细胞C2C12 24小时； 2. 接着将丝胶蛋白水凝胶(SMH-I、SMH-2、SMH-3)铺于96孔板中，每种丝胶蛋白水凝胶 各种三孔平行样； 3. 使用培养基对细胞培养瓶收集的人脐静脉内皮细胞HUVEC、小鼠成肌细胞C2C12重 新悬浮、吹散，种植于丝胶水凝胶表面，每孔细胞数目约为8000; 4. 在相应时间点观察细胞形态； 5. 可选择的，在第2天对C2C12细胞进行鬼笔环肽/DAPI染色； 二、 实验分析 1. 如图7A、8所示，丝胶蛋白水凝胶(SMH-1、SMH-2、SMH-3 )可支持C2C12和HUVEC细胞 粘附、伸展，并可长期支持细胞生长； 2. 如图7B所示，丝胶蛋白水凝胶(SMH-I、SMH-2、SMH-3)可支持C2C12细胞粘附、伸展； 3. 实验结果证明，丝胶蛋白水凝胶有较好的细胞粘附性。
[0131] 实施例14丝胶蛋白促进细胞增殖测试 一、实验过程 1. 首先使用DMEM高糖培养基，在37°C，在5%的CO2，100%湿度情况下培养小鼠成肌细胞 C2C12 24小时； 2. 吸出1中含10% FBS的DMEM高糖培养基，将其分为7组，每组分别加入DMEM+10%FBS、 DMEM+0%FBS、DMEM+0.2% SMA、DMEM+0.4% SMA、DMEM+0.8% SMA、DMEM+1.0% SMA、DMEM+2.0% SMA； 3. 孵育24、48小时； 4. 48、96小时后向3中每孔加入10 yL CCK-8共孵育I小时； 5. 利用酶标仪测量其在490 nm和630 nm的吸光度值。
[0132] 二、实验分析 1.如图9B所示，丝胶蛋白（SMA-l、SMA-2、SMA-3)可部分代替血清的作用，促进细胞增 殖； 2.实验结果证明，丝胶蛋白有较好的促进细胞增殖作用，有应用于肌肉损伤修复的潜 力。
[0133] 实施例15丝胶蛋白促进细胞增殖测试 一、实验过程 1. 首先使用DMEM/F12培养基，在37°C，在5%的CO2，100%湿度情况下培养原代软骨细胞 24小时； 2. 吸出1中含10% FBS的DMEM/F12培养基，将其分为7组，每组分别加入DMEM+10%FBS、 DMEM+0%FBS、DMEM+0.2% SMA、DMEM+0.4% SMA、DMEM+0.8% SMA、DMEM+1.0% SMA、DMEM+2.0% SMA； 3. 孵育24、48小时； 4. 48、96小时后向3中每孔加入10 yL CCK-8共孵育I小时； 5. 利用酶标仪测量其在490 nm和630 nm的吸光度值。
[0134] 二、实验分析 1. 如图IOB所示，丝胶蛋白（SMA-l、SMA-2、SMA-3)可部分代替血清的作用，促进软骨 细胞增殖； 2. 实验结果证明，丝胶蛋白有较好的促进细胞增殖作用，有应用于软骨损伤修复的潜 力。
[0135] 实施例16丝胶蛋白水凝胶促进细胞增殖测试 一、实验过程 1. 首先使用DMEM高糖培养基，在37°C，在5%的CO2，100%湿度情况下培养小鼠成肌细胞 C2C12 24小时； 2. 吸出1中含10% FBS的DMEM高糖培养基，将其分为7组，每组分别加入DMEM+10%FBS、 DMEM+0%FBS、DMEM+0·2% (SMH-1、SMH-2、SMH-3)、DMEM+0·4% (SMH-1、SMH-2、SMH-3)、DMEM+ 0·8% (SMH-I、SMH-2、SMH-3)、DMEM+1·0% (SMH-I、SMH-2、SMH-3)、DMEM+2·0%(SMH-I、SMH-2、 SMH-3)； 3. 孵育24、48小时； 4. 48、96小时后向3中每孔加入10 yL CCK-8共孵育I小时； 5. 利用酶标仪测量其在490 nm和630 nm的吸光度值。
[0136] 二、实验分析 1. 如图9A所示，丝胶蛋白水凝胶(SMH-l、SMH-2、SMH-3)可部分代替血清的作用，促进 细胞增殖； 2. 实验结果证明，丝胶蛋白水凝胶有较好的促进细胞增殖作用，有应用于肌肉损伤修 复的潜力。
[0137] 实施例17丝胶蛋白水凝胶促进细胞增殖测试 一、实验过程 1.首先使用DMEM/F12培养基，在37°C，在5%的C〇2，100%湿度情况下培养原代软骨细胞 24小时； 2. 吸出1中含10% FBS的DMEM/F12培养基，将其分为7组，每组分别加入DMEM+10%FBS、 DMEM+0%FBS、DMEM+0·2% (SMH-1、SMH-2、SMH-3)、DMEM+0·4% (SMH-1、SMH-2、SMH-3)、DMEM+ 0·8% (SMH-I、SMH-2、SMH-3)、DMEM+1·0% (SMH-I、SMH-2、SMH-3)、DMEM+2·0%(SMH-I、SMH-2、 SMH-3)； 3. 孵育24、48小时； 4. 48、96小时后向3中每孔加入10 yL CCK-8共孵育I小时； 5. 利用酶标仪测量其在490 nm和630 nm的吸光度值。
[0138] 二、实验分析 1. 如图IOB所示，丝胶蛋白水凝胶(SMH-l、SMH-2、SMH-3)可部分代替血清的作用，促 进软骨细胞增殖； 2. 实验结果证明，丝胶蛋白水凝胶有较好的促进细胞增殖作用，有应用于软骨损伤修 复的潜力。
[0139] 实施例18流式细胞术检测细胞周期变化 一、 实验过程 1. 首先使用DMEM高糖培养基，在37°C，在5%的CO2，100%湿度情况下培养小鼠成肌细胞 C2C12 24小时； 2. 向 1)中加入SMA-l、SMA-2、SMA-3 (IOOyL, 10 g/L); 3. 孵育24小时； 4. 24小时后，对3中细胞进行细胞周期测试； 二、 实验分析 1. 如图9C所示，丝胶蛋白（SMA-l、SMA-2、SMA-3)促使细胞周期发生改变，促进C2C12 细胞分裂、增殖； 2. 实验结果证明，丝胶蛋白水凝胶有较好的促进细胞增殖作用。
[0140] 实施例19流式细胞术检测细胞周期变化 一、 实验过程 1. 首先使用DMEM/F12培养基，在37°C，在5%的C〇2，100%湿度情况下培养原代软骨细胞 24小时； 2. 向 1)中加入SMA-l、SMA-2、SMA-3 (IOOyL, 10 g/L); 3. 孵育24小时； 4. 24小时后，对3中细胞进行细胞周期测试； 二、 实验分析 1. 如图IOC所示，丝胶蛋白（SMA-l、SMA-2、SMA-3)促使细胞周期发生改变，促进C2C12 细胞分裂、增殖； 2. 实验结果证明，丝胶蛋白水凝胶有较好的促进细胞增殖作用。
[0141] 实施例20丝胶蛋白水凝胶3D细胞培养 一、实验过程 1. 首先使用DMEM高糖培养基，在37°C，在5%的CO2，100%湿度情况下培养小鼠成肌细胞 C2C12 24小时； 2. 接着将100 yL丝胶蛋白溶液（100 g/L)与1中细胞混合并加入10 uL Irgacure 2959(1%,W/V)； 3. 利用紫外光照射(6 mV/cm2，I min)交联形成凝胶； 4. 在第1、2、3、6天对水凝胶进行活死细胞染色； 5. 对4中染色细胞进行统计。
[0142] 二、实验分析 1.如图11A、B、C所示，丝胶蛋白水凝胶(SMH-l、SMH-2、SMH-3)可支持细胞3D培养，并 且细胞在丝胶蛋白水凝胶内可正常增殖。
[0143] 2.实验结果证明，丝胶蛋白水凝胶可作为3D生物支架支持细胞生长。
[0144] 实施例21丝胶蛋白水凝胶3D细胞培养 一、实验过程 1. 首先使用DMEM高糖培养基，在37°C，在5%的CO2，100%湿度情况下培养小鼠成肌细胞 C2C12 24小时； 2. 接着将100 yL丝胶蛋白溶液（100 g/L)与1中细胞混合并加入10 uL Irgacure 2959 (1%,W/V)； 3. 利用紫外光照射(6 mV/cm2, I min)交联形成凝胶； 4. 在第1、2、3天在该水凝胶中加入10 nL CCK-8; 5. 利用酶标仪测量其在490 nm和630 nm的吸光度值。
[0145] 二、实验分析 1.如图IID所示，丝胶蛋白水凝胶(SMH-I、SMH-2、SMH-3)3D培养细胞与空白对照组相 比细胞存活率达到90%。
[0146] 2.实验结果证明，丝胶蛋白水凝胶可作为3D生物支架支持细胞生长。
[0147] 实施例22丝胶蛋白水凝胶3D体内培养原代软骨细胞 一、实验过程 1. 首先使用DMEM/F12培养基，在37°C，在5%的C〇2，100%湿度情况下培养原代软骨细胞 24小时； 2. 接着将100 yL丝胶蛋白溶液（100 g/L)与1中细胞混合并加入10 yL Irgacure 2959 (1%,W/V)； 3. 通过注射的放射注入至小鼠皮下； 4. 利用紫外光照射(6 mV/cm2, I min)交联形成凝胶； 5. 在第8、10、12周将其取出，进行H&E染色。
[0148] 二、实验分析 I. H&E、Safranin 0、Collagen II染色结果如图12C所示，丝胶蛋白水凝胶中的软骨细 胞已经形成了成熟的软骨组织； 2. 实验结果表明，丝胶蛋白水凝胶是良好的3D生物支架，可以支持细胞在体内正常生 长，有应用于骨组织损伤修复的潜力。
[0149] 实施例23丝胶蛋白水凝胶应用于全皮层损伤的修复 一、实验过程 1.剪去BALB/c小鼠背部直径为1.2 cm全层皮肤； 2 ·将1中BALB/c小鼠随机分为三组：Tegaderm组，Tegaderm+皮耐克组，Tegaderm+ SMH-2 组； 3. 于治疗后第7、14、21天观察伤口恢复情况； 4. 将3中伤口处皮肤切除进行H&E、Mass〇n染色。
[0150]二、实验分析 1. 如图13A、B所示，SMH-2组BALB/c小鼠伤口尺寸在第7、14、21天明显小于其他两组； 2. H&E、Masson(图13C)结果表明SMH-2修复组恢复程度明显较其他两组好； 3. 实验结果说明本申请制备的丝胶蛋白水凝胶有较好的伤口修复效果，可用作伤口 修复材料使用应用于全皮层损伤的修复。
[0151] 实施例24再生组织炎性检测 一、实验过程 1.剪去BALB/c小鼠背部直径为Icm2全层皮肤； 2 ·将1中BALB/c小鼠随机分为三组：Tegaderm组，Tegaderm+皮耐克组，Tegaderm+ SMH-2 组； 3.于治疗后第14天切除伤口处皮肤，进行⑶68染色。
[0152] 二、实验分析 I. CD68、ΜΡ0染色及统计结果如图14A、B、C所示，SMH-2组小鼠皮肤伤口附近炎性较其 他两组轻。说明本申请制备的丝胶蛋白水凝胶作为伤口修复材料不会使损伤组织产生严重 的炎性反应。
[0153] 实施例25再生组织新生血管化检测 一、实验过程 1.剪去BALB/c小鼠背部直径为Icm2全层皮肤； 2 ·将1中BALB/c小鼠随机分为三组：Tegaderm组，Tegaderm+皮耐克组，Tegaderm+ SMH-2 组； 3.于治疗后第14天切除伤口处皮肤，进行VEGFR、⑶31、a-SMA染色。
[0154] 二、实验分析 I. VEGFR、⑶31、a-SMA染色及统计结果如图15A、B、C和图16A、B所示，SMH-2组小鼠皮肤 伤口附近新生血管的再生较其他两组多。说明本申请制备的丝胶蛋白水凝胶作为伤口修复 材料可促使损伤组织血管的快速再生。
[0155] 实施例26再生组织瘢痕化检测 一、实验过程 1.剪去BALB/c小鼠背部直径为Icm2全层皮肤； 2 ·将1中BALB/c小鼠随机分为三组：Tegaderm组，Tegaderm+皮耐克组，Tegaderm+ SMH-2 组； 3. 于治疗后第21天切除伤口处皮肤，进行H&E染色并统计再生组织中毛囊个数及皮肤 厚度。
[0156]二、实验分析 1. H&E染色及实物拍照结果如图17A、B所示，SMH-2组小鼠再生皮肤组织的形态较其他 两组更接近于正常组织； 2. SMH-2组小鼠再生皮肤组织的毛囊个数明显多于其他两组； 3.SMH-2组小鼠再生皮肤组织的皮肤厚度明显薄于其他两组； 4. 实验结果说明丝胶蛋白水凝胶是性能良好的全皮层损伤修复材料，可有效减少瘢痕 组织的生成及有效促进毛囊的再生。
【主权项】
1. 一种光交联丝胶蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤： 1) 甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白的制备： 将丝胶蛋白粉末以0.02-1 g/mL的比例溶解于10-100 mL的pH 7.4~9.0磷酸缓冲液 中，再按照每克丝胶蛋白加入0.1-1 g的比例滴加甲基丙烯酸酐，置于20~45°C下反应0.5~ 36小时;将反应溶液透析12~72小时，冻干得到甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白粉末； 2) 甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白溶液的配制 将步骤1)获得的甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白粉末溶于去离子水或PBS或培养基中，制 成浓度为1-400 g/L甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白溶液； 3) 光引发剂Irgacure 2959溶液的配制 取1 g Irgacure 2959分散于10-1000 mL去离子水中，加热至80_100°C，制成浓度为 0.01~1 g/L 的 Irgacure 2959溶液； 4) 光交联丝胶蛋白水凝胶的制备 按体积比1000/1~100/1将甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白溶液与Irgacure 2959溶液混 合，通过紫外光照射得到所述光交联丝胶蛋白水凝胶。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述丝胶蛋白粉末由下法得到：将蚕茧剪 成碎片，用水清洗，去除水分;按每克蚕茧加入10-50 mL的0.01- 0.2 mol/L Na2C03水溶液， 在70-100°C条件下搅拌0.5-3小时，使丝胶蛋白溶解，得到丝胶蛋白溶液;离心去除所述丝 胶蛋白溶液中的不溶性物质，透析12~72小时，获得澄清丝胶蛋白溶液，冻干，得到丝胶蛋白 粉末;所述蚕茧为丝素缺陷型蚕茧、家蚕蚕茧或棹蚕蚕茧。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述丝胶蛋白粉末为提取的丝胶蛋白或 商品化丝胶蛋白；所述甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白溶液浓度为1-400 g/L;所述Irgacure 2959溶液的浓度为1-10 g/L;使用的紫外光照射强度为3-10 mV/cm2,紫外光照射时间为 10-300秒。4. 由权利要求1-3所述任意方法得到的光交联丝胶蛋白水凝胶。5. 权利要求4所述光交联丝胶蛋白水凝胶作为荧光探针在生物医学领域的应用。6. 权利要求4所述光交联丝胶蛋白水凝胶在制备皮肤损伤，肌肉损伤，血管损伤，神经 损伤，软骨损伤，骨骼损伤或心肌损伤修复的产品中的应用。7. 权利要求4所述光交联丝胶蛋白水凝胶结合工具细胞、包装相应的治疗因子或药物 在制备组织修复产品、药物载体中的应用。8. 权利要求4所述丝胶蛋白水凝胶在制备生长因子、药物以及细胞的载体或支架中的 应用。9. 丝胶蛋白水凝胶冻干支架，由权利要求4所述光交联丝胶蛋白水凝胶冷冻24小时后 取出，再置于冷冻真空干燥机中干燥得到的丝胶蛋白水凝胶冻干支架。10. 权利要求1-3任一项所述方法制备得到的光交联丝胶蛋白水凝胶，其特征在于，该 丝胶蛋白水凝胶以任何形态或形式存在并应用于制备生物医药材料。
【文档编号】A61K49/00GK106075598SQ201610477682
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年9月22日
【发明人】王琳, 王征, 刘佳, 乞超, 徐鲁明, 李琪琳, 刘兴欣, 张剑, 常炳程
【申请人】华中科技大学同济医学院附属协和医院