一种三层人工血管制备技术的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种三层(内层，中层和外层)人工血管的制备方法，内层是由墨水打印法制备的光滑致密薄层构成，能够抑制血浆蛋白和血小板粘附，防止急性血栓形成，同时提供轴向的力学支持。中层是由湿法纺丝或熔融纺丝制备的取向微米纤维缠绕构成，其主要作用是引导组织细胞向取向纤维空隙内部生长，实现细胞外基质取向沉积排布，同时取向微米纤维能够提供径向力学支持。外层由粗的聚合物纤维缠绕并与中层紧密粘接在一起，主要是在人工血管弯曲时起到防止打折的作用。本发明制备的人工血管能够显著提高通畅率，而且能够利用植入部位微环境实现拟天然重塑再生，在冠脉搭桥、血液透析、脑和外周血管替换方面具有良好的应用前景。
【专利说明】
一种三层人工血管制备技术
技术领域
[0001] 本发明属于组织工程领域，具体地说是涉及一种三层人工血管制备方法。
【背景技术】
[0002] 血管性疾病是全球致死率最高的疾病，该疾病的发生常由于血管狭窄或阻塞导致 血流减少和营养物质缺乏，从而使组织或器官受损，通常表现为冠心病、脑血管病、外周动 脉疾病和深静脉血栓。据世界卫生组织预测，到2030年全世界每年死于心血管相关疾病的 人数会增加到2330万。血管移植手术仍是治疗这类疾病常规手段，这类手术首选是采集使 用患者自体血管如大隐静脉，两侧胸廓内动脉、桡动脉等。但是有些患者由于自体血管已经 被采集过或者患有复杂的血管病变而只能选择小口径人工血管代替。另外，血液透析动静 脉痿构建，外伤性动脉损伤，外周动脉瘤等也要用到小口径人工血管。目前，聚苯二甲酸乙 二醇酯（Dacron?)，膨体聚四氟乙烯(Gore-Tex?)和聚氨酯等材料制备的大口径（内径> 6mm)人工血管移植后长期通畅率较高，已广泛应用于临床。但用这类非降解材料制备的小 口径血管在临床上应用中通畅率很低，尽管研究者对其进行修饰例如接枝肝素等来改善其 抗凝血性能，但问题依然没有得到解决。因此，开发新型小口径人工血管（内径<6mm)日益 受到国内外科学家的重视。
[0003] 目前，科学家已开发出多种工艺用来制备各种类型的小口径人工血管，大致可分 三类:包括以合成材料和天然材料为基质制备人工血管技术，天然血管脱细胞技术和自组 装技术。其中利用合成材料或天然材料制备得到的人工血管，可以通过活性修饰植入到体 内后，利用宿主重塑潜能来体内再生出拟天然的人工血管，这也是当前该领域研究的热点 之一。研究者利用静电纺丝，粒子沥滤，相分离等多种技术制备具有孔隙的人工血管，然而 在利用这些技术制备人工血管的过程中极少考虑并控制人工血管内表面物理拓扑结构。大 量基础研究显示人工血管材料表面的拓扑结构(如光滑与粗糙程度），会影响血浆蛋白以及 血小板的粘附，同时也会影响内皮细胞和平滑肌细胞的粘附和增殖，进而影响人工血管的 通畅。可降解聚合物类人工血管还存在一个问题就是在长期植入体内后容易变形，并形成 动脉瘤，主要原因之一是由于人工血管材料的孔结构没有规则，材料降解后导致新生血管 的细胞外基质无法形成拟天然取向排布，以致不能长期承受体内的血液压力。另外，大量研 究中所制备的人工血管经过一定角度的弯曲会形成死折，在植入体内后会阻碍血液流通。
[0004] 为了解决上述问题，我们设计并制备了由内层、中层和外层组成的三层人工血管。 内层由10-100微米的光滑致密薄层构成，由于内表面光滑致密所以能够抑制血浆蛋白和血 小板粘附，同时防止在植入时血液向人工血管壁渗透，引发急性血栓，另外致密的内层能够 提供轴向的力学支持。中层由5-100微米具有一定角度排布的螺旋取向微米纤维缠绕而成， 其主要作用是引导周围组织细胞向支架内部取向生长，实现细胞外基质取向沉积排布，同 时取向微米纤维能够提供径向力学支持。外层由50-500微米的聚合物纤维缠绕并与中层紧 密粘接在一起，主要是在人工血管弯曲时起到防止打折的作用。
【发明内容】
[0005] 本发明专利分为三步完成，第一步是利用墨水打印的方法制备人工血管致密光滑 薄层。具体方法包括，以化学纯试剂(包括四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸、丙酮、三氟 乙醇、六氟异丙醇等)为溶剂，配制一定浓度(质量/体积分数为1%_60%)的可降解聚合物 (包括聚己内酯(PCL)、聚丙交酯(PLA)、聚（丙交酯-乙醇酸)共聚物(PLGA)、聚乙醇酸(PGA)、 聚羟基脂肪酸酯(PHA)聚(丙交酯-己内酯)共聚物(PLCL)、聚对二氧六环己酮(TOS)等)或天 然材料(包括丝素蛋白、壳聚糖、明胶、胶原等)溶液，溶解完全后，将溶解的合成或天然材料 溶液装入注射器中，利用微量注射栗将注射器中的聚合物溶液打印到位于下方转速和移动 速度均可控的光滑金属接收棒上，流速为0.1_50ml/h，注射器针头与下方接收棒距离为 0.1-5cm，接收棒的转速为l-500rpm，移动速度为lmm-50mm/ sec，挤出的聚合物溶液中的溶 剂成分挥发，从而固化形成薄膜，调节聚合物浓度、流速、接受棒转动速度和移动速度等参 数从而制备厚度可控(5-200微米)的人工血管内层。
[0006] 发明专利的第二步是人工血管中层具有取向微米纤维的制备方法。具体可用湿法 纺丝或熔融纺丝加工而成，将第一步所制备的带有光滑致密内层接收棒安装在湿法纺丝仪 器上，将一定浓度聚合物溶液加入到注射器里，将注射器安装在注射栗上，调整注射栗推进 速度、接收棒转速和移动速度等参数来调控中层微米纤维的直径以及纤维之间的角度从而 制得直径为5-100微米取向纤维中层。同时也可以将第一步所制备的带有光滑致密内层接 收棒安装在熔融纺丝仪上，将聚合物添加到恒温加热料筒里，升温使聚合物融化后，通过调 节料筒推进活塞速度、针头粗细、接收棒转速和横向移动速度等参数来调控中层微米纤维 直径、以及纤维之间的角度从而制得直径为10-100微米取向纤维的人工血管中层。
[0007] 本发明专利的第三步是制备人工血管抗打折外层。具体是使用熔融纺丝的方法， 将第二步所制备的带有中层和内层的接收棒安装在熔融纺丝仪上，将聚合物添加到恒温加 热料筒里，升温使聚合物融化后，调节料筒加热温度、活塞推进速度、针头粗细、接收棒转速 和移动速度等参数来调控外层微米纤维直径、以及纤维之间的角度从而制得直径为50-500微米具有取向纤维的人工血管外层。通过调节加热料筒温度使外层与中层紧密粘接。
[0008] 本发明专利与现有可降解聚合物类小口径人工血管相比，具有以下优点：1、该人 工血管具有超薄致密光滑的内表面，与现有研究中常用的静电纺丝技术制备的纳米或微米 纤维人工血管的粗糙内表面相比能够显著降低血小板和蛋白的粘附，同时致密内层能够防 止血液向人工血管壁内渗透，减少血小板的激活和急性血栓的形成，另外内层能够增强该 人工血管的轴向力学;2、由于该人工血管中层具有螺旋取向微米纤维结构，这种取向的微 米纤维具有增强该人工血管的径向力学作用，同时植入血管部位周围组织细胞会向取向微 米纤维的孔隙快速迀移，并分泌胶原和弹性蛋白等细胞外基质，分泌的细胞外基质呈圆周 取向排布，这也能够增强人工血管体内植入后的径向力学，取向微米纤维和取向细胞外基 质二者共同作用可使人工血管在植入体内后能够长期抵抗血液压力，从而避免动脉瘤的形 成;3，该人工血管外层是由粗聚合物纤维螺旋缠绕而成，并且外层纤维与中层紧密粘接，这 样在将该人工血管弯曲时可以防止打折;4、该人工血管制备工艺可控性强，可调控内层薄 膜的厚度，中层和外层纤维直径以及纤维之间的角度和粘接程度等，同时也可以调控人工 血管的直径。
【具体实施方式】
[0009] 实施例1:聚己内酯(PCL)三层人工血管的制备
[0010] 人工血管内层制备：称取2. Og数均分子量为80000的PCL加入到IOml氯仿中，室温 搅拌溶解过夜，制得浓度分数为20% (质量/体积）的PCL溶液。在室温通风橱中利用直接打 印法制备人工血管内层。将直径为2. Omm不锈钢接收棒安装在打印机上。将PCL溶液吸入到 注射器中，将注射器安装在注射栗上，将注射器针头置于距离金属接收棒上方2mm的位置。 设定注射栗推进速度为2ml/h，接收棒转速为lOOrpm，横向移动速度为0.2mm/sec，打印时间 为2min，制备完成后将带有人工血管内层的接收棒真空干燥。
[0011] 人工血管中层制备：在室温通风橱中利用湿法纺丝制备人工血管中层。具体是将 带有光滑致密内层的接收棒安装在湿法纺丝仪上，将20 % PCL纺丝溶液吸入注射器中，将注 射器安装在注射栗上，将注射器针头置于纺丝凝固浴中距离接收棒Icm位置处。设定注射栗 速度为4ml/h，接收棒转速为1000 rpm，移动速度为lmm/sec，纺丝时间为15min，完成后除去 凝固浴和纺丝液溶剂。
[0012] 人工血管外层制备:利用熔融纺丝法制备人工血管外层。具体是将带有内层和中 层的接收棒安装在熔融纺丝仪上，将20.0 gPCL添加到恒温加热料筒里，升温到100°C使PCL 充分融化后，设定料筒推进活塞速度为l〇ml/h，接收棒转速为400rpm，移动速度lmm/sec，时 间为2min。完成外层纺丝后将三层人工血管取下备用。
[0013] 实施例2:聚L-丙交酯-己内酯(PLCL)三层人工血管制备
[0014] 人工血管内层制备:称取1.5g PLCL加入到IOml四氢呋喃溶剂中，室温搅拌溶解过 夜，制得浓度分数为15% (质量/体积)的PLCL溶液。在室温通风橱中利用直接打印法制备人 工血管内层。将直径为3.Omm不锈钢接收棒安装在打印机上。将PLCL溶液吸入注射器后安装 在注射栗上，将注射器针头置于距离金属接收棒上方3. Omm的位置，设定注射栗推进速度为 3ml/h，接收棒转速为200rpm，横向移动速度为0.4mm/sec，打印时间为Imin，制备完成后将 带有人工血管内层的接收棒真空干燥。
[0015] 人工血管中层制备：在室温通风橱中利用熔融纺丝制备人工血管中层。将带有光 滑致密内层的接收棒安装在熔融纺丝仪上，将20.OgPLCL添加到恒温加热料筒里，升温到 240 °C使PLCL融化后，设定料筒推进活塞速度为lml/h，接收棒转速为200rpm，移动速度 0.5mm/sec，时间为lOmin。
[0016] 人工血管外层制备：在室温通风橱中利用熔融纺丝制备人工血管外层。具体是将 带有内层和中层的接收棒安装在熔融纺丝仪上，将20.0 gPLCL添加到恒温加热料筒里，升温 到240 °C使PLCL充分融化后，设定料筒推进活塞速度为12ml/h，接收棒转速为200rpm，移动 速度2. Omm/sec，时间为lmin。完成外层纺丝后将三层人工血管取下备用。
[0017] 实施例3:聚丙交酯(PLA)三层人工血管制备
[0018] 人工血管内层制备:称取1.2g PLA加入到IOml二氯甲烷中，室温搅拌溶解过夜，制 得浓度分数为12 % (质量/体积)的PLA溶液。在室温通风橱中利用直接打印法制备人工血管 内层。将直径为4. Omm不锈钢接收棒安装在打印机上。将PLA溶液吸入注射器后安装在注射 栗上，将注射器针头置于距离金属接收棒上方3. Omm的位置，设定注射栗推进速度为3ml/h， 接收棒转速为200rpm，横向移动速度为0.41111]1/86〇，打印时间为11]1；[11，制备完成后将带有人 工血管内层的接收棒真空干燥。
[0019] 人工血管中层制备：在室温通风橱中利用熔融纺丝制备人工血管中层。将带有光 滑致密内层的接收棒安装在熔融纺丝仪上，将10.OgPLA添加到恒温加热料筒里，升温到260 TMiPLA融化后，设定料筒推进活塞速度为2ml/h，接收棒转速为IOOrpm，移动速度0.7mm/ sec，时间为12min。
[0020] 人工血管外层制备：在室温通风橱中利用熔融纺丝制备人工血管外层。具体是将 带有内层和中层的接收棒安装在熔融纺丝仪上，将20.OgPLA添加到恒温加热料筒里，升温 至|J260°C使PLA充分融化后，设定料筒推进活塞速度为14ml/h，接收棒转速为600rpm，移动速 度3. Omm/sec，时间为lmin。完成外层纺丝后将三层人工血管取下备用。
【主权项】
1. 一种三层人工血管制备方法，其特征在于该方法所采用的技术方案包括以下步骤： 步骤一，人工血管内层制备。以生物可降解高分子为原料，由墨水打印法制备人工血管 内层，是由10-100微米的光滑致密薄层构成，由于内表面光滑致密所以能够抑制血浆蛋白 和血小板粘附，同时防止在植入时血液向人工血管壁渗透，引发急性血栓，另外致密的内层 能够增强轴向的力学强度； 步骤二，人工血管中层制备。中层是在人工血管内层外侧通过静电纺丝，湿法纺丝，熔 融纺丝或3D打印技术中的一种或者几种制备得到，由具有一定角度排布的直径为5-100微 米螺旋取向纤维缠绕而成，其主要作用是引导组织细胞向取向纤维空隙生长，实现细胞外 基质取向沉积排布，同时取向微米纤维和取向排布的细胞外基质能够增强径向力学强度。 步骤三，人工血管外层制备。外层是在人工血管内层和中层外侧通过熔融纺丝和3D打 印法制备，由50-500微米的聚合物纤维缠绕并与中层紧密粘接在一起，主要是在人工血管 弯曲时起到防止打折的作用。2. 根据权利要求1所述的三层人工血管的制备方法，其中，所述的生物可降解高分子可 以是合成高分子聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)，聚L-丙交酯-己内酯(PLCL)，聚羟基脂肪酸 酯(PHA)，聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)，聚二噁烷酮(PDS)，聚氨酯(PU)中的一种或几 种，所述的可降解天然材料包括丝素蛋白、壳聚糖、明胶、胶原的一种或几种。
【文档编号】A61L27/18GK106075596SQ201610589001
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月21日 公开号201610589001.3, CN 106075596 A, CN 106075596A, CN 201610589001, CN-A-106075596, CN106075596 A, CN106075596A, CN201610589001, CN201610589001.3
【发明人】朱美峰, 孔德领, 王恺, 董显豪
【申请人】南开大学