等电点低的抗体的纯化方法【专利摘要】本发明人发现，通过进行下述的步骤可以抑制其后的抗体的缔合化：将pI低的抗体使用蛋白A柱纯化，进行酸性处理和中和处理之后，经过规定的时间，然后除去所产生的抗体的缔合体。而且，本发明人发现：通过利用阴离子交换树脂的结合/洗脱模式、进而利用疏水性相互作用层析或多元层析树脂纯化pI低的抗体，与以往相比可有效地除去杂质。【专利说明】等电点低的抗体的纯化方法
技术领域：
[0001]本发明设及抗体的纯化方法，特别是设及用于等电点(pi)低的抗体的纯化方法。【
背景技术：
】[0002]由于基因重组技术的发展，各种蛋白质制剂能够W稳定的供应量提供。特别是，近年来通过基因重组技术开发了与普通的医药品相比选择性高的各种抗体医药品，且进入了临床试验阶段。[0003]通过运样的基因重组技术生产的含有生理活性蛋白质的制剂中，有必要除去来源于宿主细胞的蛋白质（宿主细胞蛋白，化Stcellproteins)或DNA、作为纯化原料之一的树脂配体片段、来源于目标蛋白质的缔合体或片段等。而且，为了确保制剂的病毒安全性，纯化步骤有必要显示具有充分的病毒除去能力或灭活能力。现在，据世界卫生组织(WHO)表示，生物医药品中的DNA的允许量是l(K)pgDNA/-次给予量W下。而且，关于病毒，据世界卫生组织(WHO)表示，在培养液中确认到逆转录病毒样颗粒存在时，在考虑纯化步骤中的逆转录病毒的除去能力或灭活能力的基础上，是1个病毒颗粒/1〇6给予量W下。为了满足该标准，通常，将含有得自宿主细胞的生理活性蛋白质的水性培养基通过用亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析、径憐灰石层析、疏水性相互作用层析或它们的组合进行处理而除去杂质。而且，近年来，新的纯化配体的开发正在推进，还将具有离子交换作用和疏水性相互作用的两种作用的多元层析用于纯化。[0004]特别是，生理活性蛋白质为将哺乳动物细胞作为宿主而获得的抗体时，利用蛋白A或蛋白G与IgG的Fc链结合的性质，进行基于蛋白A或蛋白G的亲和柱层析的处理之后，利用各种层析进行纯化。[0005]例如，在特表平5-504579号(专利文献1)中，将从哺乳动物细胞培养获得的含有抗体的水性培养基适用于蛋白A或蛋白G柱层析，使抗体吸附于柱上，其后，使用酸性溶液(浓度为约0.1M的巧樣酸、pH3.0-3.5)洗脱抗体，将所获得的酸性洗脱液依次适用于离子交换柱层析、尺寸排阻柱层析，进行纯化。[0006]W血中滞留性或体内动力学的提高为目的，已知有用于控制抗体的等电点(pi)的氨基酸取代技术，具体而言，通过改变(修饰)暴露于抗体表面的氨基酸残基来控制抗体的口1的技术(1007/114319(专利文献2))。天然抗体的等电点(91)为约7.5~9.5的范围，具有较高的pl。通过改变运样的抗体的氨基酸残基使pl变低，可期待延长抗体的血浆中滞留性或半衰期，从而关系到作为药物的抗体的给予量的减低或给予间隔的延长。[0007]但是，迄今为止，没有适于天然不存在的具有低pi的抗体的纯化方法的研究、或针对纯化步骤中的低pl抗体特有的问题的研究。因此，关于适于运样低pl抗体的纯化方法完全是未知的。[000引现有技术文献专利文献专利文献1:特表平5-504579号专利文献2:W007/114319。【
发明内容】[0009]发明所要解决的课题本发明的目的在于提供:特别是可从含有Pl低的抗体的组合物中有效除去杂质的抗体的纯化方法。[0010]通常，作为从培养液中粗纯化抗体的方法，W使用蛋白A柱的方法为主流。此时，通常如下进行:在从柱洗脱的步骤中，利用酸性的溶液进行洗脱，并且根据需要添加酸，维持规定时间的酸性状态，进行病毒的灭活处理，在中和处理后立即转移至下一纯化步骤。[0011]本发明人发现了下述的问题:特别是将pi改变成低值的抗体利用通常的纯化步骤纯化时，在纯化步骤结束后会产生新的缔合体。研究其原因，结果发现了下述的现象:该抗体在酸性状态放置规定时间后进行中和处理时，一部分抗体在规定期间渐渐不可逆地缔合化。[0012]通常的抗体，其pi值高且为碱性，因此利用蛋白A亲和树脂进行纯化后，由于碱性的特性，而在阳离子交换树脂中利用结合/洗脱模式、在阴离子交换树脂中利用通过(Passthrough)模式进行纯化。通常，已知在阳离子交换树脂中除去缔合体，在阴离子交换树脂中使DNA、宿主细胞蛋白、病毒等杂质吸附而除去。但是，在pi改变成低值的抗体的纯化方法的研究中，关于改变成pl低的抗体，明确了：在W往的纯化方法中，抗体的培养液中所含的杂质的除去效率不充分。[0013]用于解决课题的手段本发明人为了实现上述目的而进行了深入的研究，结果发现了：将pl低的抗体使用蛋白A柱纯化，进行中和处理之后，经过规定的期间，然后除去所产生的抗体的缔合体，由此可W抑制其后的抗体的缔合化。[0014]而且，发现了：通过将pi低的抗体利用阴离子交换树脂的结合/洗脱模式纯化，与W往相比，可有效地除去杂质。并且，发现了：通过使用阴离子交换层析、W及多元层析或疏水性相互作用层析，可W进一步除去杂质。[0015]旨P，本发明提供W下[1]~[19]。[0016][1]含有pi值为3.0~8.0的抗体的组合物的纯化方法，该方法包括下述的步骤：(a)将含有Pl值为3.0~8.0的抗体的组合物在酸性条件下处理的步骤；(b)将步骤(a)中获得的酸性组合物中和的步骤;W及(C)在中和后至少经过1小时后，从步骤(b)中获得的中和组合物中除去缔合体的步骤。[0017][2][1]所述的方法，其中，步骤(a)是将pi值为3.0~8.0的抗体利用蛋白A柱层析纯化之后进行的病毒灭活处理步骤。[0018][3][1]或[2]所述的方法，其中，步骤(C)是将步骤(b)中获得的中和组合物在中和后至少保持1小时后除去缔合体的步骤。[0019][4][1]~[3]中任一项所述的方法，其中，利用阴离子交换层析、疏水性相互作用层析、多元层析或径憐灰石层析进行缔合体的除去。[0020][引[1]~[4]中任一项所述的方法，其中，抗体的pi值为5.0~7.5。[002。[6]山~[4]中任一项所述的方法，其中，抗体的pi值为5.ο~6.5。[0022][7]从含有pi值为3.0~8.0的抗体的组合物中除去杂质的方法，该方法包括下述的步骤：(a)将含有Pl值为3.0~8.0的抗体的组合物负载到阴离子交换树脂上；(b)使用比(a)的组合物的盐浓度高的盐浓度的洗脱溶液，利用结合/洗脱模式，从阴离子交换树脂中洗脱pl值为3.0~8.0的抗体的步骤。[0023][引[7]所述的方法，其中，在步骤(b)之前包括:使用清洗溶液清洗阴离子交换树脂的步骤。[0024][9][7]或[引所述的方法，其中，步骤(b)的洗脱溶液是含有选自氯化钢、Tris盐、硫酸钢盐、憐酸钢盐的至少一种的溶液。[0025][10][7]~[9]中任一项所述的方法，该方法还包括下述的步骤:将通过步骤(b)获得的含有pl值为3.0~8.0的抗体的洗脱产物负载到使用具有疏水性配体和/或多元配体的树脂的层析上，获取流通(Flowt虹ough)组分和/或洗脱组分的步骤。[0026][11][1]~[6]中任一项所述的方法，其特征在于，通过[7]~[10]中任一项所述的方法进行缔合体的除去。[0027][12][1]~[11]中任一项所述的方法，其中，抗体为人源化抗体或人抗体。[0028][13][1]~[12]中任一项所述的方法，其中，抗体为抗IL-6受体抗体或抗IL-31受体抗体。[0029][14]制备含有PI值为3.0~8.0的抗体的组合物的方法，其中，通过[1]~[13]中任一项所述的方法，使抗体的缔合体的含有比例为3%W下。[0030][15]抗体的缔合体的含有比例为3%W下的组合物，其是含有pi值为3.0~8.0的抗体的组合物。[0031][16]缔合体的含有比例为3%W下的组合物，其是通过[14]所述的方法制备的含有pl值为3.0~8.0的抗体的组合物。[0032][17]制备含有pi值为3.0~8.0的抗体的药物组合物的方法，该方法包括下述的步骤：1)通过[14]所述的制备方法，制备pi值为3.0~8.0的抗体和/或含有该抗体的组合物的步骤；W及2)将步骤1)中制备的pi值为3.0~8.0的抗体和/或含有该抗体的组合物与药学上可接受的载体和/或添加剂混合制成制剂的步骤。[0033][1引从含有pi值为3.0~8.0的抗体的组合物中除去抗体的缔合体的方法，该方法包括W下的步骤：(a)将含有Pl值为3.0~8.0的抗体的组合物在酸性条件下处理的步骤；(b)将步骤(a)中获得的酸性组合物中和的步骤;W及(C)在中和后至少经过1小时后，从步骤(b)中获得的中和组合物中除去缔合体的步骤。[0034][19]含有pi值为3.0~8.0的抗体的组合物的纯化方法，该方法包括W下的步骤：(a)将含有Pl值为3.0~8.0的抗体的组合物在酸性条件下处理的步骤；(b)将步骤(a)中获得的酸性组合物中和的步骤;W及(c)在经过对于缔合体的形成充分的时间之后，从步骤(b)中获得的中和组合物中除去缔合体的步骤。【具体实施方式】[0035]W下，对本发明进行详细说明。[0036]本发明设及从含有等电点（pi)低的抗体的组合物中除去该抗体的缔合体或杂质的方法。具体而言，本发明设及从含有pi值为3.0~8.0的抗体的组合物中除去其缔合体的方法，该方法包括W下的步骤：(a)将含有Pl值为3.0~8.0的抗体的组合物在酸性条件下处理的步骤；(b)将步骤(a)中获得的酸性组合物中和的步骤;W及(C)在中和后至少经过1小时后，从步骤(b)中获得的中和组合物中除去缔合体的步骤。[0037]本发明中，在经过对于步骤(b)中获得的中和组合物中所产生的缔合体的形成充分的时间之后，从该组合物中除去缔合体，由此可W抑制纯化后的新的缔合体形成。[0038]具体而言，在中和后至少经过1小时后，通过从步骤(b)中获得的中和组合物中除去缔合体，可W抑制纯化后的新的缔合体形成。[0039]旨P，本发明的步骤(C)还可W表述如下：?在经过对于缔合体的形成充分的时间之后，从步骤(b)中获得的中和组合物中除去缔合体的步骤?相对于步骤(b)中获得的中和组合物中可产生的缔合体量，在至少形成80%W上的缔合体之后，从该组合物中除去缔合体的步骤?相对于将步骤(b)中获得的中和组合物保持至少24小时后形成的缔合体量，在至少形成80%W上的缔合体之后，从该组合物中除去缔合体的步骤?步骤(b)中获得的中和组合物中可发生的缔合体的形成完成80%W上之后，从该组合物中除去缔合体的步骤?步骤(b)中获得的中和组合物中缔合体的形成完成的至少1小时前，从该组合物中除去缔合体的步骤。[0040]而且，本发明设及从含有pi值为3.0~8.0的抗体的组合物中除去杂质的方法，该方法包括下述的步骤：(a)将含有Pl值为3.0~8.0的抗体的组合物负载到阴离子交换树脂上的步骤;W及(b)使用比(a)的组合物的盐浓度高的盐浓度的洗脱溶液，通过结合/洗脱模式，从阴离子交换树脂中洗脱pl值为3.0~8.0的抗体的步骤。[0041]上述方法中，在步骤(b)之前可W包括:使用清洗溶液清洗阴离子交换树脂的步骤。[0042]本发明中，从含有pi值为3.0~8.0的抗体的组合物中除去其缔合体的方法还可W表述为:从含有pl值为3.0~8.0的抗体的组合物中纯化该抗体(抗体单体)的方法、从含有pi值为3.0~8.0的抗体的组合物中除去杂质的方法、抑制pi值为3.0~8.0的抗体的缔合化的方法等。[0043]而且，从含有pi值为3.0~8.0的抗体的组合物中除去杂质的方法还可W表述为：从含有pi值为3.ο~8.ο的抗体的组合物中纯化该抗体(抗体单体）的方法、从含有pi值为3.0~8.0的抗体的组合物中除去该抗体的缔合体的方法等。[0044]本发明中，含有抗体的组合物还可W表述为:含有抗体的溶液、抗体的培养液、抗体的培养培养基等。[0045]本发明中使用的抗体只要与所期望的抗原结合就没有特别限定，可W是多克隆抗体也可W是单克隆抗体，但从可稳定生产均质的抗体的角度考虑，优选单克隆抗体。[0046]作为本发明中使用的单克隆抗体，不仅包含来自人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、骆驼、猴等动物的单克隆抗体，还包含嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体等进行了人为改变的基因重组型抗体。并且，还包含为了进行W血中滞留性或体内动力学的改善为目的的抗体分子的物性改变(具体而言，等电点(pl)改变、Fc受体的亲和性改变等)而人为改变了抗体的恒定区等的基因重组型抗体。[0047]而且，本发明中使用的抗体的免疫球蛋白类别没有特别限定，可W是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4等的IgG、IgA、I曲、I巧、IgM等任一类别，优选IgG和IgM。[0048]并且，本发明使用的抗体中不仅包含具有恒定区和可变区的抗体(全抗体），还包含Fv、Fab、F(ab)2等的抗体片段、或将抗体的可变区用肤接头等接头连接而成的1价或2价W上的单链。￥(3[。￥、3(3巧￥)2)或3。。￥二聚体等的双价抗体(01日130(17)等的低分子化抗体等，优选全抗体。[0049]上述的本发明中使用的抗体可通过本领域技术人员熟知的方法制作。对于产生单克隆抗体的杂交瘤，可W基本上使用公知技术如下进行制作。即，将所期望的抗原或表达所期望抗原的细胞用作致敏抗原，用该致敏抗原按照通常的免疫方法进行免疫，利用通常的细胞融合方法使所获得的免疫细胞与公知的母细胞进行融合，利用通常的筛选方法，筛选产生单克隆抗体的细胞(杂交瘤），由此进行制作。杂交瘤的制作例如可按照Milstein等人的方法化ohler.G.andMilstein,C.,MethodsE；nz;ymol.(1981)73:3-46)等进行。抗原的免疫原性低时，可与白蛋白等的具有免疫原性的大分子结合，再进行免疫。[0050]而且，可使用:从杂交瘤克隆抗体基因，插入到适当的载体中，将其导入宿主，使用基因重组技术产生的基因重组型抗体（例如，参照化rl,A.K.Borrebaeck,化mes,W.Larrick,Τ皿RA阳UTICMONOCLONALANTIBODIES,化WishedintheUnitedKingdombyMACMILLANPlffiLIS皿RSLTD,1990)。具体而言，使用逆转录酶从杂交瘤的mRNA合成抗体的可变区（V区）的cDNA。当获得编码目标抗体的V区的DNA时，将其与编码所期望的抗体恒定区（C区）的DNA连接，再将其插入到表达载体中。或者，还可将编码抗体V区的DNA插入到含有抗体C区的DNA的表达载体中。插入到表达载体中W在表达调控区例如增强子、启动子的调控下表达。其后，可利用该表达载体转化宿主细胞，使抗体表达。[0051]本发明中，可使用W使对人的异种抗原性降低等为目的而人为改变的基因重组型抗体，例如嵌合(化imeriC)抗体、人源化(HumaniZed)抗体等。运些改变抗体可使用已知的方法制备。嵌合抗体是由人W外的哺乳动物例如小鼠抗体的重链、轻链的可变区和人抗体的重链、轻链的恒定区构成的抗体，可如下得到:将编码小鼠抗体的可变区的DNA与编码人抗体的恒定区的DNA连接，将其插入到表达载体中并导入宿主而产生。[0052]人源化抗体也称为重构(reshaped)人抗体，将人W外的哺乳动物例如小鼠抗体的互补性决定区（CDR;complementaritydeterminingregion)移植到人抗体的互补性决定区而得到的抗体，其通常的基因重组方法也是已知的。具体而言，设计小鼠抗体的CDR与人抗体的框架区（frameworkregion;FR)连接的DNA序列，将其制作成末端部具有重叠部分的多个寡核巧酸，利用PCR法由该多个寡核巧酸进行合成。将所获得的DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接，其后，插入到表达载体并将其导入到宿主而产生，由此获得(参照欧州专利申请公开号6?239400、胖096/02576)。对于经由〔03连接的人抗体的。1?，可选择互补性决定区形成良好的抗原结合位点的FR。根据需要，可取代抗体可变区的框架区的氨基酸，W使重构人抗体的互补性决定区形成适当的抗原结合位点（Sato,K等人，CancerRes.(1993)53,851-856)ο[0053]作为为了改善抗体的活性、物性、药物动力学、安全性等而取代抗体的氨基酸的技术，例如还已知W下所述的技术，本发明所使用的抗体还包含进行了运样的氨基酸取代(还包含缺失或添加)的抗体。[0054]关于对IgG抗体的可变区进行氨基酸取代的技术，报道了：人源化技术(TsurushitaN,HintonPR,KumarS.,Designofhumanizedantibodies:fromanti-TactoZenapax.,Methods.2005May;36(1):69-83.);基于用于使结合活性增强的基于互补性决定区（CDR)的氨基酸取代的亲和力成熟技术（RajpalA,BeyazN，HaberL,CappuccilliG,YeeH,BhattRR,TakeuchiT,LernerRA,CreaR.,Ageneralmethodforgreatlyimprovingtheaffinityofantibodiesbyusingcombinatoriallibraries.,ProcNatlAcadSciUSA.2005Jun14;102(24):8466-71.);基于框架（FR)的氨基酸取代的提高物理化学稳定性的技术化wedS，HoneggerA,PluckthunA.,Stabilityimprovementofantibodiesforextracellularandintracellularapplications:CDRgraftingtostableframeworksandstructure-basedframeworkengineering.,Methods.2004Oct;34(2):184-99.Review)。而且，作为进行IgG抗体的化区的氨基酸取代的技术，已知有使抗体依赖性细胞毒活性(ADCC)或补体依赖性细胞毒活性(CDC)增强的技术化imSJ，ParkY，HongHJ.,Antibodyengineeringforthedevelopmentoftherapeuticantibodies.,MolCells.2005Aug31;20(1):17-29.Review.)。并且，报道了：不仅使运样的效应子功能增强，而且使抗体的血中半衰期提高的Fc的氨基酸取代的技术(HintonPR,XiongJM,JohlfsMG,TangMT,KellerS,TsurushitaN.,AnengineeredhumanIgGlantibodywithlongerserumhalf-life.,JImmunol.2006Jan1;176(1):346-56.；GhetieV,PopovS,BorvakJ,RaduC,MatesoiD,MedesanC,OberRJ,WardES.,IncreasingtheserumpersistenceofanIgGfragmentbyrandommutagenesis.,NatBiotechnol.1997Jul;15(7):637-40.)。并且，还已知W改善抗体的物性为目的的恒定区的各种氨基酸取代技术(W009/41613)。[0055]而且，人抗体的获取方法也是已知的。例如，在体外用所期望的抗原或表达所期望抗原的细胞致敏人淋己细胞，使致敏淋己细胞与人骨髓瘤细胞、例如U266融合，也可W获得具有抗原结合活性的所期望的人抗体(参照特公平1-59878)。而且，通过用抗原免疫具有人抗体基因所有组成成分的转基因动物，可W获取所期望的人抗体(参照W093/12227、W092/03918、W094/02602、W094/25585、W096/34096、W096/33735)。并且，使用人抗体文库，通过淘选获取人抗体的技术也是已知的。例如，可W将人抗体的可变区W单链抗体(scFv)形式通过隧菌体展示法表达在隧菌体的表面，并选择与抗原结合的隧菌体。分析所选择的隧菌体基因，可W确定编码与抗原结合的人抗体可变区的DNA序列。如果能够明确与抗原结合的scFv的DNA序列，则可制作包含该序列的适当的表达载体，W获取人抗体。运些方法已经是熟知的，可W参照W092/01047、W092/20791、W093/06213、W093/11236、W093/19172、W095/01438、W095/15388。本发明所使用的抗体还包含运样的人抗体。[0056]将暂时分离的抗体基因导入适当的宿主来制作抗体时，可使用适当的宿主与表达载体的组合。将真核细胞用作宿主时，可使用动物细胞、植物细胞、真菌细胞。作为动物细胞，已知有：（1)哺乳类细胞，例如CH0、COS、骨髓瘤、BHK(幼仓鼠肾，babyhamsterkidney)、HeLa、Ve;ro;(2)两栖类细胞，例如非洲爪赡卵母细胞;或(3)昆虫细胞，例如sf9、sf21、Τη5等。作为植物细胞，已知有：来源于烟草（Nicotiana)属例如烟草（Nicotianatabacum)的细胞，可W将其进行愈伤组织培养。作为真菌细胞，已知有：酵母，例如酵母(Saccharomyces)属、例如酿酒酵母（Saccharomycesserevisiae);丝状真菌，例如曲霉(Aspe巧illus)属、例如黑曲霉(Aspergillusniger)等。使用原核细胞时，存在使用细菌细胞的产生体系。作为细菌细胞，已知有大肠杆菌化.coli)、枯草杆菌。通过转化向运些细胞中导入目标抗体基因，将所转化的细胞在体外培养，由此获得抗体。[0057]并且，本发明所使用的抗体中包含抗体片段或低分子化抗体、W及抗体修饰物。例如，作为抗体片段或低分子化抗体，可举出：。曰6^(曰13'）2^乂、或将齡连与1^连的。乂用适当的接头连接而得的一价或二价W上的单链Fv(scFv、sc(Fv)2等KHuston,J.S.等人，Proc.化tl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，5879-5883)。具体而言，利用酶例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶处理抗体，生成抗体片段，或者，构建编码运些抗体片段的基因，将其导入表达载体之后，在适当的宿主细胞中表达(例如，参照Co,M.S.等人，J.Immunol.(1994)152，2968-2976；Better,Μ.andHorwitz,A.H.,MethodsEnzymol.(1989)178,476-496;Pluckthun,A.andSkerra,A.,Methodslinzymol.(1989)178,497-515;Lamoyi,E.,MethodsEnzymol.(1986)121,652-663;Rousseaux,J.等人，MethodsEnzymol.(1986)121,663-669；Bird,R.E.andWalker,B.W.,TrendsBiotechnol.(1991)9，132-137)。[0058]作为抗体修饰物，还可使用与聚乙二醇(PEG)或细胞毒性药物等的各种分子结合的抗体（Farmaco.1999Aug30;54(8):497-516.;CancerJ.2008May-Jun;14(3):154-69.)。本发明所使用的抗体中还包含运些抗体修饰物。运样的抗体修饰物可通过对抗体进行化学修饰而获得。运些方法在该领域中已经确立。[0059]作为本发明中使用的抗体，可举出：抗组织因子抗体、抗IL-6受体抗体、抗IL-6抗体、HM1.24抗原单克隆抗体、抗甲状旁腺激素相关肤抗体(抗PTOrP抗体）、抗憐脂酷肌醇蛋白聚糖-3抗体、抗神经节巧脂GM3抗体、抗TP0受体激动剂抗体、第VIII凝固因子替代抗体、抗IL31受体抗体、抗HLA抗体、抗A)(L抗体、抗CXCR4抗体、抗NR10抗体、因子IX与因子X的双特异性抗体等，但不限于运些。[0060]作为本发明中使用的优选的重构人源化抗体，可举出：人源化抗白细胞介素6(IL-6)受体抗体(托珠单抗(Toei1izumab)、hPM-1或MRA)(参照W092/19759)、人源化抗HM1.24抗原单克隆抗体(参照W098/14580)、人源化抗甲状旁腺激素相关肤抗体(抗PTOrP抗体）（参照W098/13388)、人源化抗组织因子抗体(参照W099/51743)、抗憐脂酷肌醇蛋白聚糖-3人源化IgGlκ抗体(参照PCT/肝05/013103)、抗NRIO人源化抗体(参照W02009/072604)、因子IX与因子X的双特异性人源化抗体等，但不限于运些。作为本发明中使用的人源化抗体，特别优选为人源化抗IL-6受体抗体、抗NR10人源化抗体、W及因子IX与因子X的双特异性人源化抗体。[0061]作为人IgM抗体，优选抗神经节巧脂GM3重组型人IgM抗体(参照W005/05636)等。[0062]作为低分子化抗体，优选抗TP0受体激动剂双价抗体（Diabody)(参照W002/33072)、抗CD47激动剂双价抗体(Diabody)(参照W001/66737)等。[0063]本发明中，等电点低的抗体(低pi抗体)是指，特别是在天然中难W存在的具有低等电点的抗体。作为运样的抗体的等电点，例如可举出：3.0~8.0、优选5.0~7.5、更优选5.0~7.0、更优选5.0~6.8、进一步优选5.0~6.5、特别优选5.0~6.0，但不限于运些。需要说明的是，天然的(或通常的)抗体被认为通常具有7.5~9.5范围的等电点。[0064]并且，作为本发明中使用的抗体，优选通过改变暴露于抗体表面的氨基酸残基使抗体的pl降低的pl改变抗体。运样的pl改变抗体是指，与改变前的抗体的pl相比，使pl降低上、优选2W上、进一步优选3W上的抗体。如后述的实施例所记载，将Mab3(等电点：9.4)的氨基酸序列改变来控制等电点的Mabl的等电点为5.8。而且，将利用胖02009/072604的实施例12中记载的方法制作的完全人源化NS22抗体(等电点：7.8)的氨基酸序列改变来控制等电点的Mab2的等电点为5.6。[0065]作为等电点得到改良的抗体，例如可举出:W02009/041621中记载的抗IL-6受体抗体]?曰61化链八69IDNO:1、L链/SEQIDNO:2)、为抗NR10人源化抗体并通过W02009/072604的实施例12中记载的方法制作的完全人源化NS22抗体化链/SEQIDNO:3、L链/SEQIDNO:4)等，但不限于运些。[0066]作为暴露于抗体表面的氨基酸残基，Η链可变区的情形，可举出：选自基于Kabat编号的下述氨基酸残基中的氨基酸残基:H1、册、册、册、H10、H12、H13、H15、H16、H19、H23、H25、肥6、H31、册9、H42、H43、H44、H46J61J62、H64J65J68、H71、H72、H73、H75、H76J81J82b、册3、册5、册6、化05、H108、化10、化12，但不限于运些。而且，1^连可变区的情形，可举出：选自基于Kabat编号的下述氨基酸残基中的氨基酸残基:L1、L3、L7、L8、L9、L11、L12、L16、L17、L18、L20、L22、L24、L27、L38、L39、L41、L42、L43、L45、L46、L49、L53、L54、L55、L57、L60、L63、165、1^66、1^68、1^69、1^70、1^74、1^76、1^77、1^79、1^80、1^81、1^85、1^00、1^03、1^05、1^06、1^07，但不限于运些。[0067]本发明中，"改变"是指，将原氨基酸残基取代成其它氨基酸残基、使原氨基酸残基缺失、添加新的氨基酸残基等，优选是指将原氨基酸残基取代成其它氨基酸残基。[0068]在氨基酸之中，已知存在带有电荷的氨基酸。通常，作为带有正电荷的氨基酸（正电荷氨基酸），已知有赖氨酸化）、精氨酸(R)、组氨酸化)。作为带有负电荷的氨基酸(负电荷氨基酸），已知有天冬氨酸(D)、谷氨酸化)等。已知将运些W外的氨基酸看作不带有电荷的氨基酸。[0069]作为本发明中改变后的氨基酸残基，优选可从W下的(a)或(b)任一组所含的氨基酸残基中适当选择，不特别限于运些的氨基酸。[0070](a)谷氨酸化）、天冬氨酸(D);(b)赖氨酸化)、精氨酸(R)、组氨酸化)。[0071]而且，改变前的氨基酸残基已经带有电荷时，改变成不带有电荷的氨基酸残基也是优选方案之一。[0072]目P，作为本发明中的改变，可举出：(1)从带有电荷的氨基酸取代成不带有电荷的氨基酸；(2)从带有电荷的氨基酸取代成与该氨基酸带有相反电荷的氨基酸；(3)从不带有电荷的氨基酸取代成带有电荷的氨基酸。[0073]等电点的值可通过本领域技术人员公知的等电点电泳进行测定。而且，理论等电点的值可使用基因和氨基酸序列分析软件(Genetyx等)进行计算。[0074]氨基酸残基的电荷得到改变的抗体可如下获取:改变编码抗体的核酸，将该核酸在宿主细胞中培养，从宿主细胞培养物中纯化抗体。本发明中"改变核酸"是指，改变核酸序列使形成对应于通过改变而导入的氨基酸残基的密码子。更具体而言，是指，改变核酸的核巧酸序列使改变前的氨基酸残基的密码子成为通过改变而导入的氨基酸残基的密码子。即，编码待改变的氨基酸残基的密码子被编码通过改变而导入的氨基酸残基的密码子取代。关于运样的核酸的改变，本领域技术人员可采用公知技术、例如位点特异性诱变法、PCR突变导入法等适当进行。[0075]在本发明的优选的一个方案中，通过包括W下步骤的方法，可W从含有pi值为3.0~8.0的抗体的组合物中有效除去所产生的缔合体：(a)将含有Pl值为3.0~8.0的抗体的组合物在酸性条件下处理的步骤；(b)将步骤(a)中获得的酸性组合物中和的步骤;W及(C)在中和后至少经过1小时后，从步骤(b)中获得的中和组合物中除去缔合体的步骤。[0076]作为本发明中的pi为3.0~8.0的抗体的缔合体，可举出：1.5聚体、二聚体、Ξ聚体、四聚体、五聚体等，但不限于运些。[0077]通过本发明的方法，可有效除去在溶液中产生的低pi抗体的缔合体，且可抑制其后新缔合体产生的风险。本发明中，作为将含有抗体的组合物处理的酸性条件，可示例:通常为P肥.0~4.0，优选为P册.0~3.9，进一步优选为P册.1~3.8，但不限于运些。[0078]作为将含有抗体的组合物在酸性条件下处理的方法，可举出：将盐酸、巧樣酸、憐酸、乙酸等公知的酸添加到含有抗体的组合物中的方法，但不限于运些。[0079]本发明中，优选将在酸性条件下处理了的含有抗体的组合物保持规定的时间。作为保持时间，例如可举出：15分钟~4小时、优选30分钟~2小时、进一步优选1~1.5小时，但不限于运些。[0080]本发明中，中和酸性组合物的步骤是指，将经酸性处理的含有pi值为3.0~8.0的抗体的组合物中和的步骤。作为中和后的pH值，可举出：通常抑4.5~8.5、优选抑6.5~8.5、进一步优选pH7.0~8.5，但不限于运些。[0081]根据本申请的实施例的结果判明了：本发明的抗体的纯化方法中，使上述酸性组合物的pH值提高的步骤（中和的步骤等）间断性地进行时，每次都持续形成缔合体。因此，本发明的抗体的纯化方法或缔合体的除去方法中，优选除去所生成的抗体的缔合体的步骤最终在使抑值提高的步骤（中和的步骤等)结束之后进行。而且，优选在进行缔合体的除去之后不进行再次使pH值提高的步骤。[0082]而且，本发明中，可W进一步包括下述的步骤:将含有抗体的酸性组合物中和，在比抗体的pl低的pH值下，将该组合物保持规定时间时，将该组合物的pH值调节成比抗体的PI高的值，将该组合物保持规定时间的步骤。[0083]更具体而言，本发明设及含有pi值为3.0~8.0的抗体的组合物的纯化方法，该方法包括下述的步骤：(a)将含有Pl值为3.0~8.0的抗体的组合物在酸性条件下处理的步骤；(b)将步骤(a)中获得的酸性组合物中和，在比抗体的pi低的pH值下保持该组合物的步骤；(C)将步骤(b)中获得的中和组合物的pH值调节成比抗体的pi高的值的步骤;和(d)在中和后至少经过1小时后，从步骤(b)中获得的中和组合物中除去缔合体的步骤。[0084]作为比抗体的PI低的抑值，可示例：比抗体的PI例如低0.3W上、优选低0.5W上、进一步优选低1.0W上的pH值，但不限于运些。另一方面，作为比抗体的pi高的pH值，可示例：比抗体的pl例如高0.3W上、优选高0.5W上、进一步优选高1.0W上的pH值，但不限于运些。而且，作为保持中和后的组合物的时间，例如可示例：1小时W上（例如，1小时~7天、优选1~3天）、优选2小时W上(例如，2小时~7天、优选2~72小时）、更优选6小时W上(例如，6小时~7天、优选6~72小时）、进一步优选12小时W上（例如，12小时~7天、优选12~72小时），但不限于运些。[0085]中和可使用缓冲液进行。作为用于中和的缓冲液，通常，只要是用于pH值调节的缓冲液即可，没有特别限定，例如可举出Tris、憐酸氨二钢等，优选可举出化is,但不限于运些。[0086]本发明的特征在于，首次发现了：将含有抗体的酸性溶液中和之后，在一定的时间持续地不断生成不可逆性的缔合体。运样的现象是对于pl未改变的通常的抗体(pl为9左右的抗体)观察不到的现象。虽然生成不可逆性缔合体的原因仍不清楚，但认为可能是由于：低pi抗体在酸性溶液中受到应激、在抗体pi值的附近调节组合物的pH值、或通过跨越抗体pi值进行组合物的抑值调节而引起的抗体分子的电荷变化等。无论如何，在本发明的方法中，将经酸性处理的pi值为3.0~8.0的抗体中和之后，经过一定的时间，然后除去所生成的抗体缔合体，由此防止在缔合体除去后产生新的缔合体。[0087]更具体而言，作为中和后至进行抗体的缔合体除去为止的时间，可示例:通常1小时W上（例如，1小时~7天、优选1~3天）、优选2小时W上（例如，2小时~7天、优选2~72小时）、更优选6小时W上(例如，6小时~7天、优选6~72小时）、进一步优选12小时W上(例如，12小时~7天、优选12~72小时）、特别优选20小时、23小时、24小时或66小时或其W上，但不限于运些。[0088]或者，本发明中，在经过对于缔合体的形成充分的时间之后，从中和的组合物中除去缔合体。本发明中，对于缔合体的形成充分的时间是指，被中和的组合物中期待形成缔合体的抗体形成缔合体所必要的时间。本发明的对于缔合体的形成充分的时间，不仅包含期待形成缔合体的所有抗体形成缔合体所必要的时间，还包含期待形成缔合体的抗体中至少50%W上、优选70%W上、进一步优选80%W上、特别优选90%W上的抗体形成缔合体所必要的时间。本领域技术人员可考虑实施例1所示的缔合体的生成时间，设定中和后至进行抗体缔合体的除去为止的时间。[0089]或者，本发明中，还可在相对于中和组合物中能够产生的缔合体量，至少形成50%W上、优选70%W上、进一步优选80%W上、特别优选90%W上的缔合体之后，从该组合物中除去缔合体。本发明中，中和组合物中能够产生的缔合体量是指，由中和组合物中期待形成缔合体的抗体形成的缔合体的量。作为中和组合物中能够产生的缔合体量，可示例：中和后，保持通常1小时W上(例如，1小时~7天、优选1~3天）、优选2小时W上(例如，2小时~7天、优选2~72小时）、进一步优选6小时W上（例如，6小时~7天、优选6~72小时）、特别优选24小时后所形成的缔合体的量，但不限于运些。[0090]或者，本发明中，还可W在中和组合物中能够引起的缔合体的形成至少完成50%w上、优选70%W上、进一步优选80%W上、特别优选90%W上之后，从该组合物中除去缔合体。本发明中，中和组合物中能够引起的缔合体的形成是指，期待形成缔合体的抗体形成缔合体。[0091]或者，本发明中，还可W在中和组合物中缔合体的形成完成的至少1小时前，从该组合物中除去缔合体。本发明中，缔合体的形成完成是指，期待形成缔合体的抗体的缔合体形成完成。对于本发明的缔合体的形成完成，不仅指期待形成缔合体的所有抗体形成缔合体，而且指期待形成缔合体的抗体中至少50%W上、优选70%W上、进一步优选80%W上、特别优选90%W上的抗体的缔合体形成完成。[0092]抗体的缔合体的形成是否完成，可如下进行确认:例如，如后述的实施例所示的方法，中和处理后经时性地将本发明的中和组合物利用尺寸排阻层析(SEC)进行分析，将所产生的缔合体量制图。[0093]本发明中，可使用阴离子交换层析、多元层析、疏水性相互作用层析、径憐灰石层析等，利用公知的方法，除去所产生的缔合体。特别优选使用阴离子交换层析或径憐灰石层析。[0094]而且，通过使用基于后述的阴离子交换层析的结合/洗脱模式的纯化步骤，可有效地除去本发明的缔合体。[0095]本发明中，阴离子交换树脂只要显示阴离子交换作用则没有限定。作为阴离子交换树脂，可举出：YMC-BioPro(YMC公司）、QSepharoseHighPerformance(GEHealthcare公司）、QSepharoseFastFlow(GEHealthcare公司）、QSepharoseXL(GEHealthcare公司）、(iiptoQImpRes(GEHealthcare公司）、&ptoQ(GEHealthcare公司）、&ptoDEAE(GEHealthcare公司）、SOURCE30Q(GEHealthcare公司）、SOURCE15Q(GEHealthcare公司）、POROS册化ifetechnologies公司）、POROSDiXifetechnologies公司）、POROSPKLifetechnologies公司）、EshumunoQ(MerckMillipore公司）、FractogelTMAE(MerckMillipore公司）、FractogelDEAE(MerckMillipore公司）、Macro-PrepQ(Bi〇-民adL过bor过tories公司)、Macro-PrepDEAE(Bi〇-RadLaboratories公司）、GigaCapQ-650M(T0S0H公司）、GigaCapDEAE-650M(T0S0H公司）、QHyperCeKPA化公司）等，但不限于这些D[0096]而且，作为用于鞋麟灰石柱层析的树脂，可示例：CeramicHydroxyapatite(Bi〇-RadLaboratories公司）、CeramicFluoloapatite(Bi〇-RadLaboratories公司）、MPCCeramicHydroxyfluoloapatite(Bi〇-RadLaboratories公司）、HA叫tragel(PA化公司）等，但不限于这些D[0097]而且，作为用于多元层析的树脂，可示例：CaptoAdhere(GEHealthcare公司）、C^ptoMMC(GEHeal化care公司）、EshumunoHCX(MerckMillipore公司），但不限于这些D[0098]而且，作为用于疏水性相互作用层析的树脂，可示例：PhenylSepharoseHighPerformance(GEHealthcare公司）、ButylSepharoseHighPerformance(GEHealthcare公司）、PhenylSepharose6FastFlow(GEHealthcare公司）、Butyl-SSepharose6FastFlow(GEHealthcare公司）、ButylSepharose4FastFlow(GEHealthcare公司）、OctylSepharose4FastFlow(GEHealthcare公司）、CaptoPhenylImp民es(GEHealthcare公司）、CaptoPhenyl(GEHealthcare公司）、C^ptoButyl(GEHeal化care公司）、C^ptoOctyl(GEHeal化care公司）、FractogelPhenyl(MerckMillipore公司）、FractogelPropyl(MerckMillipore公司）、TOYOPEA化Butyl(TOSOH公司）、TOYOPEAI^LE化er(T0S0H公司）、TOYOPEA化He巧KTOSOH公司）、TOYOPEA化Phe町KTOSOH公司）、TOYOPEA化PPG(TOSOH公司）、TOYOPEA化SuperButyKTOSOH公司）、TOYOPEA化Butyl-600(T0S0H公司）、Macro-PrepHIC(Bi〇-RadLaboratories公司）等，但不限于这些D[0099]缔合体是否被除去，可利用尺寸排阻层析(SEC)等本领域技术人员公知的方法进行判定，但不限于此。[0100]本发明中，在酸性条件下处理的含有抗体的组合物可通过蛋白A柱层析等公知的纯化方法进行纯化。即，本发明的缔合体的除去方法可在"将(a)含有pi值为3.0~8.0的抗体的组合物在酸性条件下处理的步骤"之前，包括"将含有pl值为3.0~8.0的抗体的组合物利用蛋白A柱层析进行纯化的步骤"。[0101]而且，本发明中，在用于除去pi值为3.0~8.0的抗体的缔合体的上述步骤(a)~(C)之后，可W包括:利用后述的阴离子交换层析的结合/洗脱模式(结合/洗脱组分)的纯化步骤、和/或、利用多元层析的流通模式(流通组分)或疏水性相互作用层析的流通模式的纯化步骤。若将运些步骤组合，则也包含除去缔合体W外的杂质，可有效地纯化pl值为3.0~8.0的抗体。[0102]目P，本发明设及从含有pi值为3.0~8.0的抗体的组合物中有效除去杂质的方法，该方法包括W下的步骤：(a)将含有pi值为3.0~8.0的抗体的组合物负载于阴离子交换树脂的步骤;和(b)使用比(a)的组合物的盐浓度高的盐浓度的洗脱溶液，通过结合/洗脱模式，从阴离子交换树脂中洗脱pl值为3.0~8.0的抗体的步骤。[0103]上述方法中，在步骤(b)之前，还包括:使用清洗溶液清洗阴离子交换树脂的步骤。[0104]如后所述，本发明中，来自阴离子交换树脂的洗脱组分还可进一步供于多元层析或疏水性相互作用层析。由此可W进一步除去杂质。[0105]所除去的杂质只要是目标蛋白质W外的物质，则可W是任何物质。作为杂质的例子，可举出：来源于宿主细胞的蛋白质（宿主细胞蛋白，Hostcellproteins)或DNA、蛋白A(来自柱的洗脱物）、来源于目标蛋白质的缔合体或片段、病毒、内毒素、培养基成分Hy-Fish(FL)、IGF、膜岛素、抗生物质、消泡剂等，但不限于运些。本发明中，优选可除去宿主细胞蛋白或DNA、蛋白A、来源于目标蛋白质的缔合体(例如，抗体的缔合体）、病毒，但不限于运些。[0106]通过本发明的方法除去的病毒没有特别限定。本发明的病毒中包含DNA病毒和RNA病毒。作为DNA病毒，可举出：MVM等的细小病毒，作为RNA病毒，可举出：MuLV等的逆转录病毒、Reo3等的呼肠孤病毒，但不限于运些。作为通过本发明的方法除去的病毒的具体例子，例如可举出：]\1祉￥、？1?￥、1^〇3、]\1￥]\1、5￥40、￥5￥、单纯瘤疹病毒、0^、辛德毕斯病毒、腮腺炎病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、风疹病毒、流感病毒、带状瘤疹病毒、巨细胞病毒、副流感病毒、EB、HIV、HA、皿、NANB、ATL、EC册、细小病毒等的病毒，优选可举出：]?化￥、1^〇3、]\1￥]\1、？1?￥、5￥40等的病毒，但不限于运些。[0107]本发明中，活用低pi抗体的特征，初次确立了对于迄今为止的具有较高的pi的抗体未能实现的、基于阴离子柱的结合/洗脱模式的抗体的纯化方法。而且，初次确立了：通过将其与多元层析或疏水性相互作用层析结合使用，可更一步除去杂质的纯化方法。[0108]本发明的方法中，作为利用阴离子交换树脂纯化含有pi值为3.0~8.0的抗体的组合物的条件，通常使用经下述缓冲液平衡的柱来进行：添加有浓度1~lOOmmol/L的Tris、BIS-TRIS、组氨酸，W氯离子、醋酸根离子作为反离子，pH值为抑6~抑9的缓冲液。优选使用经下述缓冲液平衡的柱来进行：添加有浓度10~50mmol/L的化is，W氯离子或醋酸根离子作为反离子，pH值为抑7~抑8的缓冲液，但不限于运些。[0109]其次，在本发明的方法中，可W包括:清洗吸附有pi值为3.0~8.0的抗体的阴离子交换树脂的步骤。清洗在与通常的平衡化条件同样的条件下进行;或者，相比洗脱的条件使用低浓度、或者同等或较高pH值的缓冲液来进行。具体而言，使用经下述缓冲液平衡的柱来进行:添加有浓度1~lOOmmol/L的化is、BIS-TRIS、组氨酸，W氯离子、醋酸根离子作为反离子，pH值为pH6~pH9的缓冲液。优选使用下述缓冲液来进行：添加有浓度10~50mmol/L的Tris，W氯离子或醋酸根离子作为反离子，pH值为抑7~抑8的缓冲液，但不限于运些。[0110]其次，在本发明的方法中，使用比含有Pl值为3.0~8.0的抗体的组合物的盐浓度高的盐浓度的洗脱溶液，通过结合/洗脱模式从阴离子交换树脂中洗脱抗体。作为洗脱条件，通常使用下述缓冲液来进行:添加有浓度1~500mmol/L的化is、BIS-TRIS、组氨酸，W氯离子、醋酸根离子作为反离子，根据需要进一步添加氯化钢、氯化钟、硫酸钢、憐酸钢，pH值为抑6~抑9的缓冲液。优选使用下述缓冲液来进行:添加有浓度10~500mmol/L的化is,W氯离子或醋酸根离子作为反离子，根据需要进一步添加50~500mmol/L的氯化钢、憐酸钢、硫酸钢，pH值为抑7~抑8的缓冲液，但不限于运些。作为比含有pi值为3.0~8.0的抗体的组合物的盐浓度高的盐浓度，例如可举出：5mmol/LW上、优选lOmmol/LW上，但不限于运些。作为洗脱溶液，可举出：含有选自氯化钢、Tris盐、硫酸钢盐、憐酸钢盐的至少一种的溶液，但不限于运些。[0111]本发明中，还可W将从阴离子交换树脂中获得的含有pi值为3.0~8.0的抗体的洗脱组分(洗脱液)使用多元层析(例如，具有疏水性相互作用和阴离子交换作用的两种作用的树脂)进一步纯化。[0112]就利用多元层析树脂纯化含有抗体的组合物而言，通常使用下述缓冲液来进行：添加有浓度1~500mmol/L的化is、BIS-TRIS、组氨酸，W氯离子、醋酸根离子作为反离子，根据需要进一步添加氯化钢、氯化钟、硫酸钢、硫酸锭、巧樣酸钢、精氨酸，抑值为pH4~抑9的缓冲液。优选使用经下述缓冲液平衡的柱来进行:添加有浓度10~500mmol/L的化is,W氯离子或醋酸根离子作为反离子，根据需要进一步添加50~500mmol/L的氯化钢和/或硫酸钢，pH值为抑6~抑7的缓冲液，但不限于运些。[0113]将通过本发明的方法获得的阴离子交换层析的洗脱组分负载于多元层析，可流通组分和/或洗脱组分的形式获得含有目标的pi值为3.0~8.0的抗体的组分。通常，负载组分可预先调节成与平衡化条件同样的抑值，根据需要可进一步添加与用于平衡化的缓冲液同样的盐。[0114]本发明中，流通组分是指，负载于柱的组分中未吸附于柱而回收的组分(杂质吸附于柱，目标物质未吸附于柱）。另一方面，洗脱组分是指，负载于柱的组分中流过比负载的组分的盐浓度高的盐浓度的缓冲液而回收的组分（目标物质吸附于(根据情况也有杂质)柱）。[0115]而且，本发明中，从阴离子交换树脂获得的含有pi值为3.0~8.0的抗体的洗脱组分(洗脱液），还可使用疏水性相互作用层析进一步纯化。[0116]就利用疏水性相互作用层析树脂纯化含有抗体的组合物而言，通常使用下述缓冲液来进行:添加有浓度1~500mmol/L的化is、BIS-TRIS、组氨酸，W氯离子、醋酸根离子作为反离子，根据需要进一步添加氯化钢、氯化钟、硫酸钢、硫酸锭、巧樣酸钢、精氨酸，pH值为pH4~抑9的缓冲液。优选使用经下述缓冲液平衡的柱来进行:添加有浓度10~500mmol/L的Tris，W氯离子或醋酸根离子作为反离子，根据需要进一步添加50~500mmol/L的氯化钢和/或硫酸钢，pH值为7~8的缓冲液，但不限于运些。[0117]将通过本发明方法获得的阴离子交换层析的洗脱组分负载于疏水性相互作用层析，可流通组分和/或洗脱组分的形式获得含有目标抗体的组分。通常，负载组分可预先调节成与平衡化条件同样的抑值，根据需要，可进一步添加与用于平衡化的缓冲液同样的盐。[0118]本发明的方法中，通过将缓冲液和负载组分调制成不含氯离子的组成，可W期待缓冲液用罐和组分用罐的防诱效果。[0119]本发明的从含有pi值为3.0~8.0的抗体的组合物中除去杂质的方法中，对于负载于阴离子交换树脂的组合物，在负载于阴离子交换树脂之前，可利用蛋白A柱层析等公知的纯化方法纯化。而且，负载于阴离子交换树脂的组合物可W供于包括W下(a)~(C)的步骤：(a)将含有pi值为3.0~8.0的抗体的组合物在酸性条件下保持的步骤；(b)将步骤(a)中获得的酸性组合物中和的步骤;W及(C)在中和后至少经过1小时后，从步骤(b)中获得的中和组合物中除去缔合体的步骤。[0120]关于杂质是否被除去的判定，杂质为蛋白质时，可利用尺寸排阻层析（SEC)来进行，但不限于运些。[0121]而且，杂质为DNA时，可利用qPCR法、阔值法等来进行，但不限于运些。[0122]杂质为来源于细胞的蛋白质化ostcellprotein/肥P)时，可利用使用抗HCP抗体的化ISA法来进行，但不限于运些。[0123]杂质为蛋白A时，可利用使用抗蛋白A抗体的化ISA法来进行，但不限于运些。[0124]杂质为病毒时，可利用qPCR法、组织感染法、隧菌斑法等来进行，但不限于运些。[0125]杂质为IG即寸，可利用使用抗IGF抗体的化ISA法来进行，但不限于运些。[0126]杂质为膜岛素时，可利用使用抗膜岛素抗体的化ISA法来进行，但不限于运些。[0127]杂质为化时，可利用使用抗化抗体的化ISA法来进行，但不限于运些。[01%]杂质为消泡剂时，可利用NMR来进行，但不限于运些。[0129]杂质为内毒素时，根据将整的血细胞提取成分LAL(整阿米己样细胞溶解物，LimulusAmebocyteLysate)活化的反应，利用比色法或比浊法进行测定，但不限于运些。[0130]杂质为抗生物质时，利用使用特异性识别庆大霉素等抗生物质的抗体的化ISA法，测定其浓度，但不限于运些。[0131]而且，本发明设及pi值为3.0~8.0的抗体的制备方法，该方法包括下述的步骤:从含有pl值为3.0~8.0的抗体的组合物中除去该抗体的缔合体和/或杂质的步骤。而且，本发明设及含有pl值为3.0~8.0的抗体的组合物的制备方法，该方法包括下述的步骤：(a)获取含有pl值为3.0~8.0的抗体的组合物的步骤;W及(b)使用本说明书中记载的纯化方法等，从步骤(a)的组合物中纯化pi值为3.0~8.0的抗体的步骤。[0132]抗体的纯化包含:从含有抗体的组合物中除去抗体的缔合体和/或杂质。本发明中获得的含有pl值为3.0~8.0的抗体的组合物中，关于缔合体的含有比例，例如可举出：5%W下、优选4%W下、特别优选3%W下，但不限于运些。本发明中，缔合体的含有比例是指，形成缔合体的抗体相对于组合物中所含的抗体的比例。[0133]而且，本发明设及通过本说明书中记载的纯化方法等或制备方法获得的pi值为3.ο~8.ο的抗体、或含有该抗体的组合物。而且，本发明设及通过本说明书中记载的纯化方法等或制备方法获得的ρ?值为3.0~8.0的抗体、或含有该抗体的药物组合物。本发明的药物组合物可W含有药学上可接受的载体和/或添加剂。[0134]并且，本发明设及制备含有pi值为3.0~8.0的抗体的药物组合物的方法，该方法包括W下的步骤：1)通过本说明书中记载的方法获取pl值为3.0~8.0的抗体的步骤;W及2)将步骤1)中制备的pi值为3.0~8.0的抗体与药学上可接受的载体和/或添加剂混合制成制剂的步骤。[0135]本发明的药物组合物可W是溶液制剂(含有抗体的溶液制剂)或冻干剂。本发明的溶液制剂还包含冻干制剂的制备步骤中的冻干处理前的溶液或再溶解后的溶液。本发明的溶液制剂优选在制备过程中不包括冻干步骤而制备的溶液制剂。而且，本发明的冻干剂可通过本领域技术人员公知的方法将本发明的溶液制剂冻干而获得。[0136]而且，本发明的制剂中根据需要可W包含:冻结保护剂、悬浮剂、助溶剂、等渗剂、保存剂、吸附防止剂、稀释剂、赋形剂、pH值调节剂、镇痛剂、含硫还原剂、抗氧化剂等添加材料或载体。[0137]作为冻结保护剂，例如可举出：海藻糖、薦糖、山梨糖醇等的糖类，但不限于运些。[0138]作为助溶剂，例如可举出：聚氧乙締氨化藍麻油、聚山梨醇醋80、烟酷胺、聚氧乙締失水山梨醇单月桂酸醋、聚乙二醇、藍麻油脂肪酸乙醋等，但不限于运些。[0139]作为等渗剂，例如可举出：氯化钢、氯化钟、氯化巧等，但不限于运些。[0140]作为保存剂，例如可举出：对径基苯甲酸甲醋、对径基苯甲酸乙醋、山梨酸、苯酪、甲酪、氯甲酪等，但不限于运些。[0141]作为吸附防止剂，例如可举出：人血清白蛋白、卵憐脂、葡聚糖、环氧乙烧/环氧丙烧共聚物、径丙基纤维素、甲基纤维素、聚氧乙締氨化藍麻油、聚乙二醇等，但不限于运些。[0142]作为含硫还原剂，例如可举出：N-乙酷半脫氨酸、N-乙酷高半脫氨酸、硫辛酸、硫二甘醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨糖醇、琉基乙酸及其盐、硫代硫酸钢、谷脫甘肤、碳原子数1~7的硫代链烧酸等具有琉基的化合物等，但不限于运些。[0143]作为抗氧化剂，例如可举出：异抗坏血酸、二下基径基甲苯、下基径基茵香酸、α-生育酪、生育酪醋酸醋、L-抗坏血酸及其盐、L-抗坏血酸栋桐酸盐、L-抗坏血酸硬脂酸醋、亚硫酸氨钢、亚硫酸钢、没食子酸Ξ戊醋、没食子酸丙醋、或乙二胺四乙酸二钢化DTA)、焦憐酸钢、偏憐酸钢等的馨合剂，但不限于运些。[0144]本发明的制剂，可口服或胃肠外的任一种形式给予，通常，通过胃肠外途径给予。具体而言，可通过注射、经皮、经粘膜、经鼻、经肺等给予。作为注射剂型的例子，例如可通过皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射等全身或局部给予。皮下注射时，虽然有注射液量的限制，但可使1次抗体给予量为大量（100~200mg左右）。因此，本发明的制剂特别适用于皮下给予(注射）。[0145]需要说明的是，本说明书中引用的所有现有技术文献均作为参照而纳入本说明书中。实施例[0146]W下，通过实施例进一步详细地说明本发明，但本发明的范围不仅仅限于运些实施例。[0147]实施例1.通过病毒灭活和中和后的保持来抑制后续步骤中的缔合体形成本实施例中，提供了W下的抗体。[0148]Mabl:W02009/041621中记载的抗IL-6受体抗体，通过改变Mab3的氨基酸使pi值达到S.SsMabl抗体的氨基酸序列由Η链/SEQIDNO:1、L链/SEQIDNO:2表示。[0149]Mab2:利用W02009/072604的实施例12中记载的方法制作的完全人源化NS22抗体，即抗NR10(化-31受体)抗体。抗体类别为IgG2，是通过改变氨基酸序列使PI值降低至5.6的抗体。Mab2抗体的氨基酸序列由Η链/SEQIDNO:3、L链/SEQIDNO:4表示。[01加]]?曰63:托珠单抗化链/56910^:5、1^连/56910^:6)冲1值为9.4。[0151]使用C册细胞稳定表达株，利用本领域技术人员公知的方法表达上述抗体，利用包含蛋白A柱层析的本领域技术人员公知的方法进行纯化，用于下述实施例的缔合体的除去的评价。[0152]将Mabl和Mab2分别模仿实际生产及纯化步骤中的病毒灭活步骤，向纯化的抗体溶液中添加Imol/L盐酸，然后在抑3.8W下保持了30分钟W上。将保持了的组分用1~2mol/LTris在PH6.5W上进行了中和处理。使用中和后的保持时间不同的组分，利用包含径憐灰石柱层析的本领域技术人员公知的方法或包含阴离子交换层析的方法除去缔合体，高纯度地进行了纯化。将除去了缔合体的组分进一步保持，使用尺寸排阻层析(SEC)，利用面积百分比法，算出了与纯化后的保持时间对应的缔合体量。[0153]在径憐灰石柱层析中，关于Mabl，利用lOmmol/L憐酸缓冲液(PH6.5)将柱进行了平衡化之后，负载了经中和处理的组分。利用lOmmol/L憐酸缓冲液(P册.5)将柱进行了清洗之后，通过利用500mmol/LNaCl、lOmmol/L憐酸缓冲液(pH6.5)使盐浓度提高，从而使Mabl洗脱。关于Mab2,利用lOmmol/L憐酸缓冲液(PH6.5)将柱进行了平衡化之后，负载了经中和处理的组分。利用lOOmmol/LMES、5mmol/L憐酸缓冲液(P册.0)将柱进行了清洗之后，通过利用200mmol/LNaCl、17.5mmol/L憐酸缓冲液(P册.6)使盐浓度提高，从而使Mab2洗脱。[0154]在阴离子交换层析中，关于Mabl，利用20mmol/LTris-醋酸缓冲液(P册.0)将柱进行了平衡化之后，负载了经中和处理的组分。利用20mmol/LTris-醋酸缓冲液(P册.0)将柱进行了清洗之后，通过利用267mmol/LTris-醋酸缓冲液(PH8.0)使盐浓度提高，从而使Mabl洗脱。关于Mab2,利用20mmol/LTris-HCl缓冲液(PH7.0)将柱进行了平衡化之后，负载了经中和处理的组分。利用20mmol/L化is-HCl缓冲液(PH7.0)将柱进行了清洗之后，通过利用350~360111111〇1/1化(：1、20111111〇1/1化13-肥1缓冲液(9^.0~7.2)使盐浓度提高，从而使Mab2洗脱。[0155]关于Mab3,也同样利用盐酸保持之后，进行中和处理，算出了中和后的保持时间中的缔合体量。[0156]实施尺寸排阻层析(SEC)，W分析各保持时间中的抗体的缔合体量。利用下述流动相将各样本稀释至约1.Og/L，利用G3000SW)(L柱(Tosoh)分析了运些样本。流动相使用包含300mmol/L化C1的50mmol/L憐酸缓冲液(pH7.5)，W流速0.5ml/min进行了分析。将比单体更早洗脱的峰作为缔合体进行分析，利用面积百分比法算出了单体和缔合体的含量(％)。[0157]将Mabl和Mab2的、中和后的保持时间和实施径憐灰石柱层析后的缔合体量（缔合体的比例）示于表1。将实施阴离子交换层析后的缔合体量示于表2。将Mabl、Mab2、Mab3的、与中和后的保持时间对应的缔合体量示于表3。根据运些结果明确了：关于Mabl和Mab2任一种，即使在中和后利用层析立即除去缔合体也会再度形成缔合体，相对于此，通过在中和后放置规定时间后进行纯化，则纯化后的缔合体增加几乎观察不到。另一方面，关于Mab3,可W判断为:观察不到中和后的缔合体的增加，不需要到下一个步骤为止的保持时间。[015引[表1]该3]在低抑3.1下保存1小时后，在抑7.ο下中和(利用蛋白A柱纯化后的抗体溶液中的醋酸浓度:50mM)《2在低抑3.1下保存1小时后，在抑7.0下中和(利用蛋白A柱纯化后的抗体溶液中的醋酸浓度:20mM)《3在低抑3.6下保存1小时后，在抑7.0下中和(利用蛋白A柱纯化后的抗体溶液中的醋酸浓度:50mM)《4在低抑3.4下保存1小时后，在抑7.0下中和(利用蛋白A柱纯化后的抗体溶液中的醋酸浓度:20mM)《5在低抑3.4下保存1小时后，在抑7.0下中和(利用蛋白A柱纯化后的抗体溶液中的盐酸浓度:2.5mM)。[0159]实施例2.低pi抗体的纯化过程实施例2-1.Mabl在阴离子交换层析的含氯化钢洗脱液中的缔合体除去抗IL-6受体抗体Mab1为低PI(PI<8;P15.8)的改变抗体，使用CHO细胞稳定表达株，利用本领域技术人员公知的方法，使其表达，利用包含蛋白A柱层析的本领域技术人员公知的方法高纯度地进行纯化，用于下述的实施例的纯化。[0160]将Mabl模拟实际生产及纯化步骤中的病毒灭活步骤，向纯化的抗体溶液中添加Imol/L盐酸，在抑3.6W下保持了30分钟W上。将保持了的组分用Imol/LTris在抑7W上进行了中和处理。然后，保持24小时W上用于纯化。[0161]作为阴离子交换层析，使用表4所示的市售树脂进行了纯化。用20mmol/LTris-HCl缓冲液(p册.0)将柱进行了平衡化之后，负载了经中和处理的组分。用20mmol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)将柱进行了清洗之后，通过利用20mmol/LTris-HCl、100~150mmol/LNaCl缓冲液(p册.0)使盐浓度提高，从而使Mabl洗脱。使用尺寸排阻层析(SEC),利用面积百分比法，算出了纯化后的缔合体量。[0162][表4]实施尺寸排阻层析(SEC)，W分析各保持时间中的抗体的缔合体量。利用下述流动相将各样本稀释至约l.Og/L，利用G3000SWXL柱（Tosoh)分析了运些样本。流动相使用包含300mmol/L化〔1的50mmol/L憐酸缓冲液(pH7.5)，W流速0.5ml/min进行了分析。将比单体更早洗脱的峰作为缔合体进行分析，利用面积百分比法算出了单体和缔合体的含量(％)。[0163]将Mabl的、阴离子交换层析纯化后的缔合体量示于表5。根据该结果明确了：在阴离子交换层析中分离了Mabl的单体和缔合体。[0164][表5][01化]实施例2-2.Mab2在阴离子交换层析的含氯化钢洗脱液中的缔合体除去抗IL-31受体抗体Mab2是低pi(ρΚ8;pI5.6)的改变抗体，使用CH0细胞稳定表达株，利用本领域技术人员公知的方法，使其表达，利用包含蛋白A的本领域技术人员公知的方法高纯度地进行纯化，用于下述的实施例的纯化。[0166]将Mab2模拟实际生产及纯化步骤中的病毒灭活步骤，向纯化的抗体溶液中添加Imol/L盐酸，在抑3.6W下保持了30分钟W上。将保持了的组分用Imol/LTris在抑7W上进行了中和处理。然后，保持20小时W上用于纯化。[0167]作为阴离子交换层析，使用表6所示的市售树脂进行了纯化。用20mmol/LTris-HCl缓冲液(pH7.0或8.0)将柱进行了平衡化之后，负载了经中和处理的组分。用20mmol/LTris-HCl缓冲液（pH7.0)将柱进行了清洗之后，通过利用20mmol/LTris-HCl、200~300mmol/L化Cl缓冲液(pH7.0)使盐浓度提高，从而使Mab2洗脱。使用尺寸排阻层析(SEC),利用面积百分比法，算出了纯化后的缔合体量。[0168][表6]将Mab2的、阴离子交换层析纯化后的缔合体量示于表7。根据该结果明确了：在阴离子交换层析中分离了Mab2的单体和缔合体。[0169][表7][0170]实施例2-3.Mabl在阴离子交换层析的各种洗脱液中的缔合体除去将Mabl模拟实际生产及纯化步骤中的病毒灭活步骤，向纯化的抗体溶液中添加Imol/L肥1，在抑3.6W下保持了30分钟W上。将保持了的组分用Imol/L化is在抑7.0W上进行了中和处理。然后，保持24小时W上用于纯化。[0171]作为阴离子交换层析，使用表8所示的市售树脂进行了纯化。用20mmol/LTris-肥1缓冲液(P册.0)或20mmol/LTris-醋酸缓冲液(p册.0)将柱进行了平衡化之后，负载了经中和处理的组分。用20mmol/L化is-HCl缓冲液(P服.0)或20mmol/LTris-醋酸缓冲液(P册.0)将柱进行了清洗之后，通过利用240~270mmol/LTris-醋酸缓冲液(P册.0)或40~60mmol/L憐酸钢缓冲液(P册.0)或20mmol/LTris-肥1中包含20~50mmol/L硫酸钢的缓冲液(P册.0)使盐浓度提高，从而使Mabl洗脱。使用尺寸排阻层析(SEC)，利用面积百分比法，算出了纯化后的缔合体量。[0172][表8]将Mabl的、阴离子交换层析纯化后的缔合体量示于表9。根据该结果明确了：在阴离子交换层析中分离了Mabl的单体和缔合体。[0173][表9][0174]实施例2-4.Mabl在阴离子交换层析的含Tris洗脱液中的病毒清除能力将Mabl模拟实际生产及纯化步骤中的病毒灭活步骤，向纯化的抗体溶液中添加Imol/L盐酸，在P册.6W下保持了30分钟W上。将保持了的组分用Imo1/LTriS在pH7W上进行了中和处理。然后，保持20小时W上用于纯化。[017日]作为阴离子交换层析，使用市售的P0R0S册树脂化ifetechnologies公司制造）进行了纯化。用20mmol/LTris-醋酸缓冲液(PH7.8)将柱进行了平衡化之后，负载了向经中和处理的组分中添加有逆转录病毒的模型病毒MuLV而得的物质。用20mmol/LTris-醋酸缓冲液(pH7.8)将柱进行了清洗之后，通过利用225~275mmo1/LTriS-醋酸缓冲液(pH7.8)使盐浓度提高，从而使Mabl洗脱。纯化后测定负载组分和洗脱组分的病毒效价，算出了病毒量。[0176]将Mabl的、阴离子交换层析纯化中的病毒清除能力示于表10。根据该结果明确了：通过利用阴离子交换层析使用Tris-醋酸进行纯化，可W有效除去病毒。[0177][表10][017引实施例2-5.Mab2在阴离子交换层析的含Tris洗脱液中的缔合体除去将Mab2模拟实际生产及纯化步骤中的病毒灭活步骤，向纯化的抗体溶液中添加Imol/L盐酸，在P册.6W下保持了30分钟W上。将保持了的组分用Imol/LTris在pH7W上进行了中和处理。然后，保持20小时W上用于纯化。[0179]作为阴离子交换层析，使用表11所示的市售树脂进行了纯化。用20mmol/LTris-HCl缓冲液(pH7.0或8.0)将柱进行了平衡化之后，负载了经中和处理的组分。用20mmol/LTris-醋酸缓冲液(PH7.0或8.0)将柱进行了清洗之后，通过利用300~500mmol/LTris-醋酸(PH7.0或8.0)使盐浓度提高，从而使Mab2洗脱。使用尺寸排阻层析(SEC),利用面积百分比法，算出了纯化后的缔合体量。[0180][表11]将Mab2的、阴离子交换层析纯化后的缔合体量示于表12。根据该结果明确了：在阴离子交换层析中分离了Mab2的单体和缔合体。[0181][表12][01剧实施例2-6.Mab2在阴离子交换层析的含Tris洗脱液中的病毒清除能力将Mab2模拟实际生产及纯化步骤中的病毒灭活步骤，向纯化的抗体溶液中添加Imol/L盐酸，在P册.6W下保持了30分钟W上。将保持了的组分用Imol/LTris在pH7W上进行了中和处理。然后，保持20小时W上用于纯化。[0183]作为阴离子交换层析，使用市售的P0R0SPI树脂化ifetechnologies公司制造）进行了纯化。用20mmol/L化is-HCl缓冲液(P册.0)将柱进行了平衡化之后，负载了向经中和处理的组分中添加有逆转录病毒的模型病毒MuLV而得的物质。用20mmol/L化is-HCl缓冲液(P册.0)将柱进行了清洗之后，通过利用470mmo1/L化iS-肥1缓冲液(P册.0)使盐浓度提高，从而使Mab2洗脱。纯化后测定负载组分和洗脱组分的病毒效价，算出了病毒量。[0184]将Mab2的、阴离子交换层析纯化中的病毒清除能力示于表13。根据该结果明确了：通过利用阴离子交换层析使用Tris-HCl进行纯化，可W除去病毒。[0185][表13][0186]实施例2-7.利用阴离子交换层析和多元层析来纯化Mabl使用CH0细胞稳定表达株，利用本领域技术人员公知的方法表达Mabl，利用包含蛋白A柱层析的本领域技术人员公知的方法高纯度地进行纯化之后，利用实施例2-3和2-4中所示的阴离子交换层析进行纯化，用于下述的实施例的纯化。[0187]使用醋酸将阴离子交换层析的洗脱组分调节至pH6.5±0.3。使用市售的CaptoA化ere(GE化althcare公司制造)作为多元层析(疏水+阴离子交换）的树脂进行了纯化。用250+/-25mmol/L化iS-醋酸缓冲液(pH6.5)将柱进行了平衡化之后，负载了经pH值调节的组分。回收了流通组分的Mab1。[018引通过运些一系列的纯化，使来源于步骤的杂质DNA除去至<1.Opg/mg-Mabl(不足定量极限）、宿主细胞蛋白除去至<17ng/mg-Mabl(不足定量极限）、浸出蛋白A除去至<0.4ng/mg-Mabl(不足定量极限），同时如实施例2-3所示，可除去Mabl的缔合体。关于病毒清除能力，除了如实施例2-4所示的充分的病毒清除能力之外，在多元层析步骤中对于逆转录病毒的模型病毒MuLV也可确保5.42Logio的高病毒清除能力。[0189]DNA按照定量PCR法进行了测定。宿主细胞蛋白按照使用抗宿主细胞蛋白抗体的ELISA法进行了测定。浸出蛋白A按照使用抗蛋白A抗体的ELISA法进行了测定。[0190]实施例2-8.利用阴离子交换层析和疏水性相互作用层析来纯化Mab2使用CH0细胞稳定表达株，利用本领域技术人员公知的方法，使Mab2表达，利用包含蛋白A的本领域技术人员公知的方法高纯度地进行纯化之后，利用实施例2-2和2-6中所示的阴离子交换层析进行纯化，用于下述的实施例的纯化。[0191]向阴离子交换层析的洗脱组分中添加盐(例如，硫酸钢)使终浓度达到250mmol/LW上，调节至P册.8~8.0,使用疏水性相互作用层析的树脂(例如，具有苯基的树脂)进行了纯化。用与所添加的盐具有同等浓度的缓冲液(P册.8~8.0)进行了平衡化之后，负载组分，回收了流通组分的Mab2。[0192]通过运些一系列的纯化，使来源于步骤的杂质DNA除去至1.9pg/mg-Mab2、宿主细胞蛋白除去至<8.0ng/mg-Mab2(不足定量极限）、浸出蛋白A除去至<0.4ng/mg-Mab2(不足定量极限），同时如实施例2-2所示，可除去Mab2的缔合体。关于病毒清除能力，除了如实施例2-6所示的充分的病毒清除能力之外，在疏水性相互作用层析步骤中对于逆转录病毒的模型病毒MuLV也可确保5.94Logio的高病毒清除能力，对于细小病毒的模型病毒MVM也可确保1.55Logio的高病毒清除能力。[0193]DNA按照定量PCR法进行了测定。宿主细胞蛋白按照使用抗宿主细胞蛋白抗体的ELISA法进行了测定。浸出蛋白A按照使用抗蛋白A抗体的ELISA法进行了测定。[0194]实施例3.取决于病毒灭活后的中和后的保持pH值的不同的缔合体形成本实施例中，提供了W下的抗体。[0195]Mabl:W02009/041621中记载的抗IL-6受体抗体，通过改变Mab3的氨基酸使pi值达到S.SsMabl抗体的氨基酸序列由Η链/SEQIDNO:1、L链/SEQIDNO:2表示。[0196]使用CHO细胞稳定表达株，利用本领域技术人员公知的方法，使上述抗体表达，利用包含蛋白A柱层析的本领域技术人员公知的方法进行纯化，用于评价下述的实施例的缔合体形成量。[0197]将Mabl模拟实际生产及纯化步骤中的病毒灭活步骤，向纯化的抗体溶液中添加Imo1/L盐酸，在pH3.8W下保持了30分钟W上。将保持了的组分用2mo1/LTriS、在比当抗体的pl低的抑5.0和比pi高的抑7.0下进行了中和处理。中和后，随着时间采集样本，现憶了缔合体量。并且，关于用抑5.0中和的样本，在22小时中和保持后进一步添加2mol/LTris，保持在高于pl的抑7.0下，随着时间采集样本，测定了缔合体量。使用尺寸排阻层析(SEC),利用面积百分比法，算出了缔合体量。[0198]实施尺寸排阻层析(SEC)，W分析各保持时间中的抗体的缔合体量。利用下述流动相将各样本稀释至约1.Og/L，利用G3000SW)(L柱(Tosoh)分析了运些样本。流动相使用包含300mmol/LNaCl的5mmol/L憐酸缓冲液(pH7.5)，W流速0.5ml/min进行了分析。将比单体更早洗脱的峰作为缔合体进行分析，利用面积百分比法算出了单体和缔合体的含量(％)。[0199]将在pH7.0下保持时随着时间的缔合体增加量和在P册.0下保持22小时后在pH7.0下保持时随着时间的缔合体增加量示于表14(在抑7.0下保持时)和表15(在抑5.0下保持22小时后提高至抑7.0时）。根据运些结果明确了：将Mab1在P册.0(比Mab1的pi低）下中和，即使随着时间的缔合体增加稳定，如再次使抑值提高至抑7.0(比Mabl的pi高)进行保持，则再次可见随着时间的缔合体增加，保持规定时间后变得稳定。[0200]「亲Μ?[表15][0201]产业实用性根据本发明可W提供:可有效除去特别是含有pi低的抗体的组合物中所含的抗体的缔合体或杂质的纯化方法。根据本发明可W提供:含有缔合体生成得到抑制的抗体的制剂。本发明的纯化方法在要求高纯度的生物医药品的制备中有用。【主权项】1.含有pi值为3.0~8.0的抗体的组合物的纯化方法，该方法包括下述的步骤：(a)将含有ρI值为3.0~8.0的抗体的组合物在酸性条件下处理的步骤；(b)将步骤(a)中获得的酸性组合物中和的步骤；以及(c)在中和后至少经过1小时后，从步骤(b)中获得的中和组合物中除去缔合体的步骤。2.权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)是将pi值为3.0~8.0的抗体利用蛋白A柱层析纯化之后进行的病毒灭活处理步骤。3.权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(c)是将步骤(b)中获得的中和组合物在中和后至少保持1小时后除去缔合体的步骤。4.权利要求1~3中任一项所述的方法，其中，利用阴离子交换层析、疏水性相互作用层析、多元层析或羟磷灰石层析进行缔合体的除去。5.权利要求1~4中任一项所述的方法，其中，抗体的pi值为5.0~7.5。6.权利要求1~4中任一项所述的方法，其中，抗体的pi值为5.0~6.5。7.从含有pi值为3.0~8.0的抗体的组合物中除去杂质的方法，该方法包括下述的步骤：(a)将含有pi值为3.0~8.0的抗体的组合物负载到阴离子交换树脂上；(b)使用比（a)的组合物的盐浓度高的盐浓度的洗脱溶液，利用结合/洗脱模式，从阴离子交换树脂中洗脱pi值为3.0~8.0的抗体的步骤。8.权利要求7所述的方法，其中，在步骤(b)之前包括:使用清洗溶液清洗阴离子交换树脂的步骤。9.权利要求7或8所述的方法，其中，步骤(b)的洗脱溶液是包含选自氯化钠、Tris盐、硫酸钠盐、磷酸钠盐的至少一种的溶液。10.权利要求7~9中任一项所述的方法，该方法还包括下述的步骤:将通过步骤(b)获得的含有pi值为3.0~8.0的抗体的洗脱产物负载到使用具有疏水性配体和/或多元配体的树脂的层析，获取流通组分和/或洗脱组分的步骤。11.权利要求1~6中任一项所述的方法，其特征在于，通过权利要求7~10中任一项所述的方法进行缔合体的除去。12.权利要求1~11中任一项所述的方法，其中，抗体为人源化抗体或人抗体。13.权利要求1~12中任一项所述的方法，其中，抗体为抗IL-6受体抗体或抗IL-31受体抗体。14.制备含有ρI值为3.0~8.0的抗体的组合物的方法，其中，通过权利要求1~13中任一项所述的方法，使抗体的缔合体的含有比例为3%以下。15.抗体的缔合体的含有比例为3%以下的组合物，其是含有pi值为3.0~8.0的抗体的组合物。16.缔合体的含有比例为3%以下的组合物，其是通过权利要求14所述的方法制备的含有pi值为3.0~8.0的抗体的组合物。17.制备含有pi值为3.0~8.0的抗体的药物组合物的方法，该方法包括以下的步骤：1)通过权利要求14所述的制备方法，制备pi值为3.0~8.0的抗体和/或含有该抗体的组合物的步骤；以及2)将步骤1)中制备的pi值为3.0~8.0的抗体和/或含有该抗体的组合物与药学上可接受的载体和/或添加剂混合制成制剂的步骤。18.从含有pi值为3.0~8.0的抗体的组合物中除去抗体的缔合体的方法，该方法包括以下的步骤：(a)将含有pI值为3.0~8.0的抗体的组合物在酸性条件下处理的步骤；(b)将步骤(a)中获得的酸性组合物中和的步骤；以及(c)在中和后至少经过1小时后，从步骤(b)中获得的中和组合物中除去缔合体的步骤。19.含有pi值为3.0~8.0的抗体的组合物的纯化方法，该方法包括下述的步骤：(a)将含有pI值为3.0~8.0的抗体的组合物在酸性条件下处理的步骤；(b)将步骤(a)中获得的酸性组合物中和的步骤；以及(c)在经过对于缔合体的形成充分的时间之后，从步骤(b)中获得的中和组合物中除去缔合体的步骤。【文档编号】C07K1/22GK106029682SQ201480076437【公开日】2016年10月12日【申请日】2014年12月26日【发明人】上田康史,小林祥平,柳田智子,川濑琢央,福永匡宏【申请人】中外制药株式会社