抗体的改良方法

专利名称：：抗体的改良方法
技术领域：
：本发明涉及通过人抗体分子的氨基酸置换进行分子修饰，以改善表达量或稳定性等性状的技术。该技术对于在推进使用抗体的研究或开发上的大障碍一一生产量低、使用时发生凝聚或改性、失活等，有望成为使它们得到改善的方法。
背景技术：
：抗体药物是以人所具有的机体防御机能为基础，以特定的功能性分子作为靶的分子靶向治疗药。受到人们很大的关注，特别是在癌症领域和类风湿领域中显示很高的有效性，其有力推动了近年来的世界性开发热潮，世界市场规模持续扩大。伴随着这样的社会背景，在抗体药物或抗体工程领域中取得了显著的技术进步，但是所获得的抗体分子的克隆常常是由于生产量低或稳定性低等，常常是应用上非常麻烦，解决上述问题并不容易。上述问题在推进使用抗体进行的研究或开发方面遇到的很大的障碍。抗体药物所遇到的问题有成本问题。治疗时必须有较大量的抗体，另外在制备设备等方面也发生较大投资，不仅患者负担加重，也使国家医疗费用增加。因此，在抗体药物的开发中，实现生产率的提高、降低成本成为大的课题。生物体内的抗体的序列是由于伴随B细胞成熟而发生的随机的基因重组或突变而产生，并选择其中具有最佳的抗体序列的B细胞进行增殖。其最佳化主要与抗原结合能力有关，除此之外还是结构域的稳定性、H链和L链的相互作用、可变区和恒定区的相互作用、蛋白酶的壽丈感性、以及细胞的分泌效率等多种因素复杂作用的结果。因此，天然的抗体序列其稳定性未必是最佳。以分离的抗体克隆作为重组蛋白，使其表达并对其进行分析，也往往是非常不稳定的状态。结果必须面对下述问题(l)表达量非常低、(2)不是可溶性地表达，而是形成内含体，必须进行重折叠；(3)纯化时暴露在酸中，容易引起变性；或者(4)在室温或4。C下通过静置就会发生沉淀或改性，反应性消失。作为解决上述问题的对应方法，目的之一是对每一种抗体克隆分别进行操作条件或緩沖液等最佳条件的探讨。但是，该探讨不仅需要很多的劳力和成本，有时也可能无法解决，只好放弃对有希望的具有反应性的抗体克隆进行的分析或开发。目的之二是如改良抗体，进行氨基酸置换或分子转化等分子修饰。通常，为了提高蛋白质的稳定性而进行的修饰的方法有以下从具有同源性的其它序列中移植更保守的氨基酸的方法；实施计算机建模，进行合理设计，使分子表面的亲水性提高，或者使疏水性芯的内部的疏水性提高、增加堆积强度等方法(非专利文献l)。关于通过抗体分子的氨基酸置换提高稳定性或提高表达量，目前的报告例中有很多是对每种抗体克隆的序列进行特征性的氨基酸修饰，可常规化进行的修饰技术的例子尚未出现。可能作为常规化的修饰技术有Worn等人的报道对VH进行1或2处的氨基酸置换，由此提高单链抗体(scFv)的稳定性(非专利文献2);Knappik等人的报道对VH进行1或多处氨基酸置换，使Fv片段的表达量提高，抑制凝聚反应(非专利文献3);Steipe等人的报道对VL进行1或2处的氨基酸置换，提高VL结构域的稳定性(非专利文献4);Hugo等人的报道修饰VL的34位(按照Kabatnumbermg体系)，从而提高scFv的稳定性和表达量(非专利文献5),其中作为修饰对象的抗体都是小鼠抗体。关于抗体药物，如果使用小鼠抗体，由于其高免疫原性，在给予人时被识别为杂质并排除。因此，难以将它们作为疾病的治疗药物使用。作为解决该问题的方法，可以使用蛋白质工程学的方法，将小鼠单克隆抗体进行嵌合化，但是，来自小鼠的序列占三成或以上，因此如果反复给予或长期给予，产生抑制所给予的嵌合抗体活性的抗体，不但其效果显著减弱，并且可能导致严重的副作用。因此，目前的主流思路是通过构建将小鼠可变区的互补性决定区(CDR)移植到人可变区的人源化抗体、或者具有完全来自人的序列的人抗体来解决上述问题。Ewert等人报道以人抗体为对象，对VH进行1或多处氨基酸置换，可以使scFv的稳定性和表达量提高(非专利文献6)。但是，其中作为修饰对象的是VH6家族，属于该家族的基因的使用频率不过1.4-2.4%(非专利文献7),因此难以说这是可广泛采用的技术。如上所述，以疾病相关抗原作为靶的特异性抗体在人的诊断或治疗等临床中非常有效，因此人们普遍希望能够确立同时具有高抗原特异性、低免疫原性、以及高生产率的特征的抗体的制备技术。非专利文献l:Vnend等人，J.Comput.AidedMol.Des.,7(4),367-396页(1993)Worn等人，Biochemistry,37,13120画13127页(1998)Knappik等人，ProteinEng.,8(1),81-89页(1995)Steipe等人,J.Mol.Biol.,240,188-192页(1994)Hugo等人，ProteinEng.,16(5),381画386页(2003)Ewert等人，Biochemistry,42，1517-1528页(2003)Brezinschek等人，J.Clin.Invest.,99(10),2488-2501非专利文献2非专利文献3非专利文献4非专利文献5非专利文献6非专利文献7页(1997)
发明内容本发明的目的在于建立以对人的免疫原性低的人抗体或人源化抗体作为对象，用于获得可保持低免疫原性和特异结合性、同时具有高生产率和优异的稳定'性的抗体的常规改良方法。针对上述情况，本发明人进行了深入的研究，结果成功地发现通过将人抗体的可变区轻链(VL链)的氨基酸用其它氨基酸序列置换，可以显著提高抗体的表达性或稳定性，从而完成了本发明。更具体地说，本发明的特征在于将人抗体的可变区轻链(以下称为VL链)的8位、12位、15位或18位(按照Kabatnumbermg)的至少其中一个氨基酸置换为除脯氨酸或半胱氨酸之外的其它氨基酸。即，本发明包含下述1)-18)的发明。1)改良人抗体或人源化抗体以得到表达量和/或稳定性提高的抗体VL链)的8;立、U位、15位或18位(;安照2abatnumbLing)的至少;中二个氨基酸置换为除脯氨酸或半胱氨酸之外的其它氨基酸。2)上述l)的方法，其特征在于将位于VL链的8位、12位、15位或18位的至少一个脯氨酸、或15位的氨基酸置换为除脯氨酸或半胱氨酸之外的其它氨基酸。3)上述1)或2)的方法，其中，置换后的各位的氨基酸分别选自下述的任意一种氨基酸8位Gly、Thr、Arg或Ser12位:Ser、His、Val、Gly、Leu、Arg、Phe、Met或Glu15位:Arg、Ser、Gly或Phe18位:Arg、Ser、Phe、Ala、Trp、Leu或Gln4)上述l)-3)中任一项的方法，其中，该VL链属于人VKl家族、人Vk2家族或人Vk3家族的其中之一。5)上述l)-4)中任一项的方法，其中，属于人Vid家族的VL链在置换后的各位氨基酸分别选自下述任意一种氨基酸。8位:Gly、Thr、Arg或Ser15位Arg或Ser6)上述5)的方法，其中，该属于人Vid家族的VL链在置换前的FRl具有来自DPK9(GenBank检索号No.X59315)的序列。7)上述5)或6)中任一项的方法，其中，置換后的属于人Vk1家族的VL链的FR1是选自SEQIDNo.2-7中的氨基酸序列的氨基酸序列。8)上述l)-4)中任一项的方法，其中，属于人VK2家族的VL链在置换后的各位氨基酸分别选自下述任意一种氨基酸。12位:Ser、His、Val、Gly、Leu、Arg、Phe、Met或Glu15位Arg18位:Arg、Ser、Phe、Ala、Trp、Leu或Gln9)上述8)的方法，其中，属于该人VK2家族的VL链在置换前的FR1具有来自DPK18(GenBank检索号No.X63403)的序列。10)上述8)或9)中任一项的方法，其中，置換后的属于人Vk2家族的VL链的FR1是选自SEQIDNo.9-25的氨基酸序列的氨基酸序列。11)上述l)-4)中任一项的方法，其中，属于人VK3家族的VL链在置换后的各位氨基酸选自下述任意一种氨基酸。15位Arg、Ser、Gly或Phe12)上述11)的方法，其中，属于该人VK3家族的VL链在置换前的FR1具有来自DPK22(GenBank检索号No.X59315)的序列。13)上述11)或12)中任一项的方法，其中，置換后的属于人Vk3家族的VL链的FR1是选自SEQIDNo.27-30的氨基酸序列的氨基酸序列。14)上述1)-13)中任一项的方法，其中，该抗体是完全抗体、或者Fab、Fab，、F(ab，)2、scAb、scFv、双抗体[含有由短连4妻肽连接的同种或不同种可变区域重链(VH链)和VL链的重组二聚体抗体]或scFv-Fc的抗体片段、或者它们与其它蛋白的融合抗体或融合抗体片段、结合有低分子标记物的抗体或抗体片段、被高分子修饰物修饰的抗体或抗体片革殳。15)上述1)-14)中任一项的方法，该方法是通过基因重组技术进行氨基酸置换。16)人抗体或人源化抗体、或者人抗体片段或人源化抗体片l殳，它们由上述1)-14)中任一项的方法得到，表达量和/或稳定性提高。17)人抗体或人源化抗体、或者人抗体片段或人源化抗体片段的制备方法，该方法是将人抗体或人源化抗体、或者人抗体片段或人源化抗体片段的可变区轻链(以下称为VL链)的8位、12位、15位或18位(按照Kabatnumbering)的至少一个氨基酸用除脯氨酸或半胱氨酸之外的其它氨基酸置换，得到表达量和/或稳定性提高的抗体的方法，该方法包含以下步骤制备编码含有置换后的VL链的氨基酸序列的该人抗体或人源化抗体、或者人抗体片段或人源化抗体片段的氨基酸序列的基因，将该基因转化真核系统或原核系统生物的宿主，使该人抗体或人源化抗体、或者人抗体片段或人源化抗体片段在该宿主中表达，接着回收该人抗体或人源化抗体、或者人抗体片段或人源化抗体片段。18)人抗体或人源化抗体、或者人抗体片段或人源化抗体片段，它们是由上述17)的方法制备的，表达量和/或稳定性提高。发明效果根据本发明，通过人抗体分子的氨基酸置换进行分子修饰，结果可以显著改善抗体的表达量或稳定性等性状。该技术对于在推进使用抗体的研究或开发上的大障碍一一生产量低、使用时发生凝聚或改性、失活等，有望成为使它们得到改善的方法。架区的氨基酸作为改变对象，因此可广泛地应用于作为诊断药或治疗药的抗体药物的开发。另外，只改变一个氨基酸，因此可以将给予人时抗原性诱发的问题抑制在最低限度。已经有报道指出通过分子修饰提高热稳定性，这可以提高对体内癌组织的打靶(WiUuda等人，CancerRes.，59，5788-5767页(1999)),稳定性的提高也有望与药效的提高相联系。这样，本发明的抗体改良方法有望对抗体医疗的发展带来很大贡献。并且，抗体的应用范围并不限于医疗领域，也涉及^艮多领域，因此，本发明还有望在相关的研究或产业发展等广泛区域内适用。因此，由本发明的改良方法得到的人抗体或人源化抗体、或者人抗体或人源化抗体片段的表达量和/或稳定性优异，具有使纯化阶段由于活性消失或凝聚物的生成等导致的损失降低的效果，在抗体生产或纯化阶段也可以提供其有用性。并且，本发明的改良方法可以提供稳定性优异的人抗体分子或人源化抗体分子，这自不待言，由此，在制剂设计方面可提供较多的选择肢，在制剂化方面可提供很大的优越性。附图简述图l是表示Fab的表达中使用的质粒的结构图。图2是对于SEB3-2-7野生型和L链8位突变体的周质组分，通过ELISA对具有功能的Fab蛋白的表达量进行比较的图。图3是对于Seb3-2-7野生型和L链8位突变体，通过ELISA对在42。C下处理时的热稳定性进行比较的图。图4是对于Seb3-2-7野生型和L链8位突变体，通过ELISA对在pH4.5下处理时的酸耐性进行比较的图。图5是对于RNOK203野生型和L链12位突变体的培养上清组分，通过ELISA对作为具有功能的Fab蛋白质的表达量进行比较的图。图6是对于RNOK203野生型和L链12位突变体，通过ELISA对40。C下处理时的热稳定性进行比较的图。图7是对于RNOK203野生型和L链12位突变体，通过ELISA对在pH4.0下处理时的酸耐性进行比较的图。图8是对于RNOK203野生型和L链12位突变体，通过ELISA对冻融耐性进行比较的图。图9是对于CTLA4-3-l的野生型和L链15位突变体的周质组分，通过ELISA对具有功能的Fab蛋白质的表达量进行比较的图。图10是表示在Fd链的C末端插入编码Etag的合成低聚DNA得到的CTLA4-3-lFab野生型和P15R突变体的表达质粒的结构图。图(a)表示野生型，图(b)表示P"R突变体的表达质粒。图11是对构成CTLA4-3-lFab-E的野生型和P15R突变体的Fd链和L链，通过蛋白质印迹分析进行培养上清组分和周质组分的表达量的比较图。图(a)是通过HRP标记抗-EtagAb检测Fd链时的情况，图(b)表示通过HRP标记抗-c-myctagAb冲全测L链时的情况。泳道l:标记、泳道2:CTLA4-3-lFab-E的野生型培养上清组分，泳道3:CTLA4-3-lFab-E的P15R突变体培养上清组分，泳道4:CTLA4-3-lFab-E野生型周质组分，泳道5:CTLA4-3-lFab-E的P15R突变体的周质组分。图12是对CTLA4-3-lFab-E的野生型和P15R的突变体的培养上清组分和周质组分，通过夹层ELISA进行Fd链和L链复合物表达量的比较图。图(a)表示培养上清组分，图(b)表示周质组分。图13是对于CTLA4-3-l的野生型和L链15位突变体，通过ELISA对在28。C下处理时的热稳定性进行比较的图。图14是对CTLA4-3-l的野生型和L链15位突变体，通过ELISA进行酸耐性比较的图。图(a)是表示用pH4.0进行处理时的情况，图(b)表示用pH3.5处理时的情况。图15是对于RNOK203野生型和L链15位突变体的培养上清组分，通过ELISA对具有功能的Fab蛋白质的表达量进行比较的图。图16是对于RNOK203野生型和L链15位突变体，通过ELISA对用pH5.0处理时的酸耐性进行比较的图。图17是对SEB3-2-7的野生型和L链15位突变体，通过ELISA对42。C下处理时的热稳定性进行比较的图。图18是对SEB3-2-7的野生型和L链15位突变体，通过ELISA对酸耐性进行比较的图。图(a)是表示用pH《5处理时的情况，图(b)表示用pH4.0处理时的情况。图19是对RNOK203的野生型和L链18位突变体，通过ELISA对45°C下处理时的热稳定性进行比较的图。图20是对RNOK203的野生型和L链18位突变体，通过ELISA对pH4.0处理时的酸耐性进行比较的图。图21是对RNOK203的野生型和L链18位的突变体，通过ELISA对冻融耐性进行比较的图。实施发明的最佳方式要进行修饰的人抗体的VL链有X链或k链，小鼠的L链中，97。/。是k链(免疫学辞典第二版、2001年、东京化学同人)，在人源化技术中几乎都是使用人vk作为模板序列，并且人的L链中，k链占670/。，为多数(Knappik等人、J.Mol.Biol.,296,57-86(2000)),因此优选使用k链。并且，已知人Vk有Vk1-Vk6的家族，Vk1、Vk2和Vk3的使用頻率合计为92%，覆盖了人vk的大部分(Foster等人、J.Clin.Invest,99(7),1614-1627页(1997))，因此更优选使用Vid-VK3三种的其中之一。作为抗体修饰的策略，是以氨基酸残基——脯氨酸(Pro;P)作为置换对象，进行氨基酸置换的研究。该脯氨酸位于对保持人源化抗体VL链的立体结构最为重要的构架区(FR)1的区、是在折叠的定速时或破坏a螺旋或(3片层结构时已知的氨基酸残基。具体来说，是以人抗体或人源化抗体的VL链的8位、12位、15位或18位的至少一个氨基酸作为修饰对象。本说明书中，抗体VL链中氨基酸残基位置的确定是按照Kabat的numberingscheme进行(Kabat,E.A.等、SequencesofProteinsofImmunologicalInterest、第5版、NIHPublicationNo.91-3242、1991)。目前为止的报告例子中，关于修饰的方法如上所述，几乎都是通过合理设计的思路。对于移植可更高度保守的氨基酸的方法，如上所述，自然界选择的抗体序列是抗原结合能力、结构域稳定性、H链和L链的相互作用、可变区和恒定区的相互作用、蛋白酶敏感性、细胞的分泌效率等多种因素复杂地作用而选择的，因此未必天然抗体序列就是稳定性最佳，该方法是有限度的。另外，关于利用计算机建模的方法，不仅需要很大的劳力，实际上也不一定使稳定性增加，目前很难说是有效的思路。本发明人根据进化工程学的思路进行研究。即，将作为修饰对象的氨基酸置换成随机的氨基酸，从该基团中选择显示优选性状的突变体。结果，如以下实施例所示，可以确认，在VL链的FR1(l位-23位)上进行了下述其中之一的氨基酸置换的抗体显示表达量或稳定性的改主口。8位:Gly、Thr、Arg或Ser12位Ser、His、Val、Gly、Leu、Arg、Phe、Met或Glu15位Arg、Ser、Gly或Phe18位:Arg、Ser、Phe、Ala、Trp、Leu或Gln这里，要进行置换原来的VL链的FR1序列(野生型)的代表性例子有以下氨基酸序列。Vk1(抗SEBfe体SEB3-2-7):DIVMTQSPSSLSASVGDTVTITC(SEQIDNO:1)Vk2(抗FasUt体RNOK203):DWMTQTPLSLPVTLGQPASISC(SEQID冊8)Vk3(抗CTLA-4^元体CTLA4-3-1):EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC(SEQIDNO:26)更具体地说，本发明中，对进行了下迷所示修饰得到的抗体的表达量和稳定性(耐热性、耐酸性、冻融耐性等)进行了评价，结果可确认均得到了显著改善的效果。"-"所示的位置是与野生型(野生型)的氨基酸序列同样。(1)Vk1野生型DIVMTQSPSSLSASVGDTVTITC(SEQIDNO:1)p8G;------g--------(SEQIDNO:2)P8T:-------T--------(SEQIDNO:3)P8R:-------R-----(SEQIDNO:4)P8S:-------S-------------(SEQIDNO:5)V15R------------R-------(SEQIDNO:6)V15S:-------S--(SEQIDNO:7)(2)vk2野生型dwmtqtplslpvtlgqpasisc(seqidno:8)p12s:---------s----------(SEQIDNO:9)p12h:----------h----------(SEQIDNO:10)p12v:--------v---------(SEQIDNO:11)p12g:---------G--------(SEQIDNO:12)p12l:---------l----------(SEQIDNO:13)p12r:-----------r-----------(SEQIDNO:14)p12f:(SEQIDNO:15)p12m:WHV■■1,,画—.....—^^^^■■一^^(SEQIDNO:16)p12e:---------e--------(SEQIDNO:17)u5r:-----------------r-------(SEQIDNO:18)p18r:--------r-----(SEQIDNO:19)p18s:---------------------s——(SEQIDNO:20)p18f:---------F——(SEQIDNO:21)p18a:-----------------a-----(SEQIDNO:22)p18w:------w----(SEQIDNO:23)p18l:---------------l——(SEQIDNO:24)p18q:-----------------q——(SEQIDNO:25)(3)vk3野生型eivltqspgtlslspgeratlsc(SEQIDNO:26)p15r;-------------R-------(SEQIDNO:27)p15s:-------------s-------(SEQIDNO:28)p15g:(SEQIDNO:29)p15f_——fT——(SEQIDNO:30)关于这些修饰，来自人的抗体从未言及，即使来自其它动物种类的抗体在目前的报告例或先有专利中也均未实施，本申请的报告是初次的探讨例。特别是L链15位被置换为Arg(R)的突变体(P15R)中，功能性分子的表达量增加至约100倍，显示了极强烈的效果。只是Fab的一个氨基酸的置换就显示了这样大的效果，目前尚未有这样例子的报导。另外，通过将L链15位置换为Arg或Ser来提高表达量或稳定性的修饰技术至少适用于Vk1家族、Vk2家族和Vk3家族追用，可以确认是通用性高的^支术。本发明中的氨基酸置换是使用模型抗体，向VL链的8位、12位、15位、或18位导入随机氨基酸，分别构建突变体文库。模型抗体是对VKl、Vk2和Vk3的各家族分別使用人抗SEB抗体(克隆名SEB3-2-7)、人抗CTLA-4抗体(克隆名CTLA4-3-l)以及人源化抗FasL抗体RNOK。使用将各抗体的VL链基因对应的氨基酸的密码子用随机密码子NNK(N为A或C或G或T,K为G或T)置换得到的低聚DNA引物，以野生型VL为模板，通过PCR法扩增变异导入型VL链。将该扩增的变异导入型VL链与野生型Fab表达质粒的VL区置换，从而构建了变异型Fab表达质粒。转化JM83,将所得克隆分离，在96孔孩吏量滴定板中诱导表达。通过斑点印迹法对周质组分中表达Fab进行评价，对确认了其表达的克隆进行性状分析，Fab是在大肠杆菌中可以可溶性地表达的抗体分子，同时是可以简便地研究其可变区的性状的分子。对于从变异型Fab表达量的比较中选择的、与野生型相比被认为表达量高的克隆进行DNA碱基序列分析，可以确认为一个氨基酸置换的置换体。再对该克隆进行表达量、热稳定性、对酸的耐性、冻融的耐性进行评价。表达量例如是通过摇瓶培养进行表达的诱导，使用回收的培养上清或周质组分进行ELISA,以所得吸光度表示具有功能的Fab蛋白质的量，在克隆之间进行比较、评价。热稳定性例如可如下进行评价将表达Fab的培养上清或周质组分进行稀释，在规定温度的水浴下进行2小时处理，然后回复至室温，进行ELISA,以所得吸光度的与未处理样品的吸光度的比例作为残留活性，在克隆之间进行比较。对酸的耐性例如可如下进行评价将表达Fab的培养上清或周质组分稀释，调节成规定的pH,静置2小时，然后中和，进行ELISA,以所得的吸光度与未处理样品的吸光度的比例作为残留活性，在克隆之间进行比较。冻融耐性例如可如下进行评价对于表达Fab的培养上清或周质组分，重复规定次数进行冻融，制成样品，进行ELISA,以进行了多次的样品的吸光度与进行了l次的样品吸光度的比例作为残留活性，在克隆之间进行比较。由这些修饰评价的结果，本发明人发现通过施加以上详述的修饰，可以改善抗体的性状。本发明中，制备的改变抗体不仅是完全抗体，也可以以Fab、Fab，、F(ab，)2、scAb、scFv、双抗体或scFv-Fc等抗体片段的形式使用。这些抗体或抗体片段还可以是与其它蛋白质或肽融合的融合抗体。这些表达抗体可以标记各种药物或放射性元素等使用，还可以用聚乙二醇等合成高分子进行修饰。通过本发明而改善的抗体或抗体片段可以使用基因重组技术，以编码该抗体或抗体片段的基因序列信息为基础，导入到适当的宿主(例如细菌、枯草杆菌、酵母、动物细胞等)中，使其表达来制备。本说明书中，"人源化抗体"是指在人抗体中，只有可变区的互补决定区(CDR)是来自小鼠等非人动物抗体，CDR以外的可变区的构架区(FR)和恒定区均来自人抗体。以下，根据实施例详细说明本发明，但本发明并不受此任何限定。实施例《实施例1:大肠杆菌菌抹和DNA》(1)大肠杆菌菌抹使用JM83菌林(Gene,33,103-119页(1995))。(2)质粒质粒pTrc99A-Fab-myc在trc启动子的控制下编码各Fab克隆。为了使其在大肠杆菌中表达以及顺利地进行折叠，将CHl和CK区C末端的Cys残基置换为Ser,形成两链之间的二硫键缺损的分子型。为了容易地检测，在L链的C末端附加c-myctag。为了使其分泌到周质和培养上清中，将pe旧序列信号(Lei等人、J.Bacteriol.,169，4379-4383页(1987))插入到两条链的编码区前方(图l)。(3)低聚DNA《实施例2:抗体克隆》(1)抗SEB抗体SEB3-2-7以来自20名健康人的末梢血的淋巴细胞作为起始材料，构建scFv噬菌体展示文库，通过使用重组SEB蛋白质的淘选法，由该文库分离SEB,所述抗SEB抗体SEB3-2-7是特异性识别SEB的人抗体。VH具有来自属于VHl家族的DP-75片段的序列，VL具有来自属于Vk1家族的DPK9(GenBank检索号No.X59315)片段的序列。VL结构域的FR1的氨基酸序列如SEQIDNo.l所示。(2)抗FasL抗体RNOK203是文献(Nakashima等人、J.Immunol.,167,3266-3275(2001))中报导的、特异性识别Fas配体、具有中和能力的人源化抗体。VL具有来自属于Vk2家族的DPK18(GenBank检索号No.X63403)的片段的序列。VL结构域的FR1的氨基酸的序列如SEQIDNo.8所示。(3)抗CTLA-4抗体CTLA4-3-l以来自20名健康人的末梢血的淋巴细胞作为起始材料，构建scFv噬菌体展示文库，通过使用重组CTLA-4蛋白质的淘选法，由该文库分离CTLA-4，所述抗CTLA-4抗体CTLA4-3-1是特异性识别CTLA-4的人抗体。VH具有来自属于VH1家族的DP-25片段的序列，VL具有来自属于Vk3家族的DPK22(GenBank检索号No.X59315)的片段的序列。VL结构域的FR1氨基酸序列如SEQIDNo.26所示。《实施例3:野生型Fab表达质粒的构建》在上述现有技术和报导例中，几乎都是使用单独的VL结构域或scFv,而本发明是使用Fab进行修饰的研究。如果是IgG,则必须是通过动物细胞表达，分析需要时间和劳力，而如果是片段，则可以通过细菌生成，因此研究可以迅速地进行。如果是单独的结构域或scFv,在将其VH和VL序列重组，变换成IgG分子型时，常常发生可能是由于结构的变化导致的抗原亲和性降低等性状的变化，如果采用Fab,则已知变换成IgG分子型时上述变化比较难以发生。因此，通过Fab分子型确认修饰时，在变换成IgG分子型时其效果仍保持的可能性也高。现有的抗体药物几乎都是IgG分子型，因此本发明的改良技术与以往的技术相比，有望对抗体药物领域的贡献度更大。SEB3-2-7和CTLA4-3-l是以scFv表达质粒(载体pCANTAB5E)、RNOK203是以IgG表达质粒(载体；pCAG:Gene108,193-200页，1991)作为起始材料，通过使用PyrobestDNA聚合酶(TAKARA制备)的PCR法扩增VH基因和VL基因，将VH基因区用SfiI、VL基因区用XhoI和NotI切断，依次插入到pTrc99A-Fab-myc载体中。《实施例4:转化》转化是使用GenePulser(BIO-RAD),通过电穿孔法进行。4吏JM83菌林为感受态进行转化，涂布在含有50)ag/ml氨千青霉素的LB琼脂培养基上，在30。C下培养过夜。将所得克隆进行分离、培养，通过常规方法制备质粒，分析DNA碱基序列。《实施例5:DNA碱基序列分析》使用CEQDTCSQuickStartKit(BECKMANCOULTER)确定经修饰的VL基因的DNA碱基序列。对所构建的表达抹进行DNA碱基序列分析，确认其为所设计的序列。《实施例6:修饰型Fab表达质粒的构建》以野生型Fab表达质粒为模板，使用将突变导入位点的密码子作为NNK(N为A或C或G或T,K为G或T)的低聚DNA,与上述同样，通过PCR法扩增VL基因，与野生型Fab表达质粒的VL区置换。转化JM83，将所得克隆在96孔微量滴定板上诱导其表达。《实施例7:通过培养板培养诱导Fab的表达》在加入到96孔板(COSTAR)的含有50^g/ml氨千青霉素的2xYT培养基上接种上述得到的克隆和作为对照的野生型Fab表达菌株，在30。C下培养5-6小时，添加IPTG,使终浓度为lmM,再培养过夜，资导Fab的表达。培养结束后离心回收菌体，悬浮于含有lmMEDTA的PBS中，将菌体放置在冰中30分钟。接着以2,000rpm离心15分钟，回收上清，制成周质组分。《实施例8:斑点印迹法》表达量的分析通过斑点印迹法进行。在0.45pm硝基纤维素滤膜(Millipore)上点样上面所得到的周质组分，用含有2。/。脱脂乳的PBS-0.05吐温20进行封闭，然后用过氧化物酶(HRP)标记抗-FabAb(CAPPEL)检测。对与野生型相比表达量可能高的克隆与上述同样地进行DNA碱基序列分析，对于可以确认为一个氨基酸置换体的克隆进行以下评价。《实施例9:通过摇瓶培养诱导Fab的表达》将大肠杆菌悬浮液涂布在含有50昭/ml氨千青霉素的LB琼脂培养基上，在3(TC下培养过夜，然后将单一集落接种在含有50jiig/ml氨千青霉素的2xYT培养基上，在30。C下培养至O.D.600nm=0.5-1.0,添加IPTG,使终浓度为lmM，进一步培养过夜，诱导Fab的表达。培养结束后离心菌液，将上清作为培养上清组分。将沉淀的菌体悬浮于含有lmMEDTA的PBS中，在冰中将菌体放置30分钟。接着用8,900xg离心l5分钟，回收上清，制成周质组分。《实施例10:通过ELISA进行SEB反应性的评1^介》在4。C下，将表达并纯化的重组SEB以200ng/100jil/孔在ELISA板(Nunc)上固定过夜，洗涤，在4。C下，用P/。BSA-PBS封闭过夜。使用SEB3-2-7的野生型/突变体的周质组分或培养上清组分，用1%BSA-PBS稀释，以IOO)al/孔在"。C下反应l小时。检测是将生物素化抗-KappaAb(SouthernBiotechnology)和过氧化物酶(HRP)标记链霉亲和素(VectorLab.)组合进行。用读板仪Vmax(MolecularDevices)测定650nm/450nm下的吸光度。《实施例11:使用SEB3-2-7进行的L链8位突变体的表达量的评价》对SEB3-2-7野生型/突变体的周质组分进行分步稀释，进行ELISA,对具有功能的Fab蛋白质表达量进行比较评价。结果可以确认，SEB3-2-7的P8G突变体表达量提高(图2)。《实施例12:使用SEB-2-7进行的L链8位突变体的热稳定性的评将SEB3-2-7的野生型/突变体的培养上清组分用P/oBSA-PBS稀释，制成50pl/管，在42。C的水浴中处理2小时。然后恢复至室温，进行ELISA,以所得吸光度相对于未处理样品的吸光度的比例作为残留活性，表示在图表中。结果可以确认，SEB3-2-7的P8T、P8G、P8R和P8S突变体的热稳定性提高(图3)《实施例13:使用SEB3-2-7进行的L链8位突变体的酸耐性评价》将SEB3-2-7野生型/突变体的培养上清组分用P/。BSA-PBS稀释，制成50pl/管。使用lNHCl和pH计(HORIBA)调节至pH4.5,在25。C下处理2小时。然后用lMTns-HCl(pH9.5)调节至pH7，进行ELISA,以所得吸光度相对于未处理样品的吸光度的比例作为残留活性，表示在图表中。结果可以确认，SEB3-2-7的P8T、P8G、P8R和P8S突变体对酸的耐性提高(图4)。《实施例14:通过ELISA进行的FasL反应性的评价》对于FasL，以500ng/100pl/孔将附加了His-tag的市售的重组Fas配体(R&D系统)在NI螯合板(Nunc)上、在室温下固定2小时。使用RNOK203的野生型/突变体的培养上清组分，用BlockAce(大日本制药)稀释，以IOOpl/孔在37。C下反应l小时。检测是将生物素化抗-KappaAb(SouthernBiotechnology)和过氧化物酶(HRP)标记链霉亲和素(VectorLab.)组合进《实施例15:使用RNOK203进行的L链12位突变体的表达量的评价》对RNOK203野生型/突变体的培养上清组分进行分步稀释，进行ELISA,对具有功能的Fab蛋白质表达量进行比较评价。结果可以确认，RNOKM3突变体表达量提高(图5)。《实施例16:使用RNOK203进行的L链12位突变体的热稳定性的评价》将RNOK203的野生型/突变体的培养上清组分用BlockAce稀释，制成50)il/管，在4(TC的水浴中处理2小时。然后恢复至室温，进行ELISA,以所得吸光度相对于未处理样品的吸光度的比例作为残留活性，在突变体之间进行比4支。结果可以确i人，RNOK203的P12S、P12H、P12V、P12G、P12L、P12R、P12F、P12M和P12E突变体的热稳定性提高。代表性的例子如图表所示(图6),其余的突变体的各残留活性与野生型的残留活性的比率汇总于表l中。[表l]<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>《实施例17:使用RNOK203进行的L链12位突变体的酸耐性评价》成50(!l/管。用1NHCl和pH计(HORIBA)调节至pH4.0,在25。C下处理2小时。然后用lMTris-HCl(pH9.5)调节至pH7，进行ELISA，以所得吸光度相对于未处理样品的吸光度的比例作为残留活性，表示在图表中。结果可以确认，RNOK203的P12V突变体对酸的耐性提高(图7)。《实施例18:使用RNOK203进行的L链12位突变体的冻融耐性评到的样品和只进行l次得到的样品，进行ELISA,以冻融6次的样品的吸光度相对于冻融l次的样品的吸光度的比例作为残留活性，表示在图表中。结果可以确认，RNOK203的P12S、P12V、P12G、P12L、P12R和P12F突变体对冻融的耐性提高(图8)。《实施例19:通过ELISA进行的CTLA-4反应性的评价》对于CTLA-4，是将市售的重组CTLA-4(R&Dsystems制备)以100ng/100jal/孔在ELISA板(Nunc)上、在室温下固定l小时，洗涤后用BlockAce在室温下封闭1小时。使用CTLA-4-3-1的野生型/突变体的周质组分，用BlockAce稀释，以100fil/孔在37。C下反应1小时。才企测是将生物素化抗-KappaAb(SouthernBiotechnology)和过氧化物酶(HRP)标记链霉亲和素(VectorLab.)组合进行。用读板仪Vmax(MolecularDevices)测定650nm/450nm下的吸光度。《实施例20:使用CTLA4-3-1进行的L链15位突变体表达量的评价》对CTLA4-3-l的野生型/突变体的周质组分进行分步稀释，进行ELISA,对具有功能的Fab蛋白质表达量进行比4交评〗介。结果可以确认，CTLA4-3-l的P15R、P15S和P15G突变体表达量提高(图9)。特别是P15R突变体，可见升高约100倍的剧烈效果，仅通过一个氨基酸的置换就使具有功能的Fab蛋白的表达量升高到如此程度，这样的例子目前尚未有报导。《实施例21:CTLA4-3-lFab-E野生型/P15R突变体表达质粒的构建》为了进一步确认在实施例20中确认的P15R突变导致的表达量的提高，进行Fab表达质粒的修饰。向Fd链(是指H链中由VH至CHl的区)的C末端插入编码Etag的合成低聚DNA,构建CTLA4-3-lFab的野生型/P15R突变体的表达质粒(图10)。以下，将含有附加了Etag的Fd链的Fab称为Fab-E。使JM83菌林为感受态，进行转化，通过DNA碱基序列分析确认是设计的序列。由此，对于构成Fab的Fd链和L链，Fd链可利用Etag、L链可利用c-myctag进行检测。对于构建的CTLA4-3-lFab-E野生型/P15R突变体，与实施例9同样地通过摇瓶培养诱导其表达，回收培养上清组分和周质组分。《实施例22:通过蛋白质印迹法进行CTLA4-3-lFab-E野生型/P15R突变体的表达量的评价》对于实施例21所得的培养上清组分和周质组分，通过蛋白质印迹法进行Fd链和L链的检测。Fd链通过HRP标记抗画EtagAb(AmershamBiosciences),L链通过HRP标记抗-c-myctagAb(Roche)检测，在野生型中均未检测出Fd链和L链，而在P15R突变体中则几乎在设计的分子量(Fd链、L链分别约为27kDa和约26kDa)的位置上检测出条带(图ll)。由该结果可以确认，通过P15R突变，Fd链和L链的表达量均提高。《实施例23:通过夹层ELISA进行的CTLA4-3-lFab-E野生型/P15R突变体表达量的评价》将Fd链和L链装配，为了了解是否正确地形成了Fab的分子形态，通过以下的夹层ELISA系统进行研究。以200ng/100pl/孔将抗-c-myctagAb9ElO在ELISA板(Nunc)上、在室温下固定1小时，洗涤后用1%BSA-PBS在室温下封闭l小时。对各回收组分用1。/。BSA-PBS稀释，以100pl/孔在37t:下反应l小时。4全测是通过HRP标记抗-EtagAb进行，通过读板4义测定650nm/450nm下的吸光度。结果可以确认，在野生型中未检测出，但在P15R突变体中可见浓度相关性的反应，特別是在周质组分中，可确认P15R突变体有数十倍高的反应(图12)。由该结果可以确认，通过P15R突变，Fd链和L链复合体形式的表达量大幅提高。《实施例24:使用CTLA4-3-l进行的L链15位突变体的热稳定性的评价》将CTLA4-3-l的野生型/突变体的周质组分用BlockAce稀释，制成50pl/管，在28。C的水浴中处理2小时。然后恢复至室温，进行ELISA，以所得吸光度相对于未处理样品的吸光度的比例作为残留活性，表示在图表中。结果可以确^人，CTLA4-3-l的P15R、P15S、P15G和P15F突变体的热稳定性提高(图13)。《实施例25:使用CTLA4-3-1进行的L链15位突变体的酸耐性评价》将CTLA4-3-l的野生型/突变体的周质组分用BlockAce稀释，制成50ILil/管。用lNHCl和pH计(HORIBA)调节至pH4.0或pH3.5,在冰上处理2小时。然后用lMTris-HCl(pH9.5)调节至pH7，进行ELISA,以所得吸光度相对于未处理样品的吸光度的比例作为残留活性，表示在图表中。结果可以确认，CTLA4-3-l的P15R、P15S、P15G、P15S突变体对酸的耐性提高(图14)。《实施例26:RNOK203的L链15位突变体的构建》探讨实施例20至实施例25所示的将L链15位改为Arg或Ser的效果是否可在RNOK203(L链15位为Leu)中出现。以野生型Fab表达质粒作为模板，使用L链15位的密码子为CGT(Arg)和TCT(Ser)的低聚DNA,与上述同样，通过PCR法扩增VL基因，与野生型Fab表达质粒的VL区置换。转化JM83，对于所得克隆进行DNA碱基序列分析，确认得到了设计的序列。《实施例27:使用RNOK203进行的L链15位突变体表达量的评价》ELISA，对具有功能的Fab蛋白质表达量进行比较评价。结果可以确认，RN0K^3的L1SR突变体表达量提高(图1》。《实施例28:使用RNOK203进行的L链15位突变体的酸耐性评价》将RNOK203的野生型/突变体的培养上清组分用BlockAce稀释，制成50pl/管。用1NHCl和pH计(HORIBA)调节至pH5.0,在25。C处理2小时。然后用lMTns-HCl(pH9.5)调节至pH7，进行ELISA,以所得吸光度相对于未处理样品的吸光度的比例作为残留活性，表示在图表中。结果可以确认，RNOK203的L15R突变体对酸的耐性提高(图16)。《实施例29:SEB3-2-7的L链的15位突变体的构建》探讨实施例20至实施例28所示的将L链15位改为Arg或Ser的效果是否可在SEB3-2-7(L链15位为Val)中出现。以野生型Fab表达质粒作为模板，使用L链15位的密码子为CGT(Arg)和TCT(Ser)的低聚DNA,与上述同样，通过PCR法扩增VL基因，与野生型Fab表达质粒的VL区置换。转化JM83,对于所得克隆进行DNA碱基序列分析，确认得到了设计的序列。《实施例30:使用SEB3-2-7进行的L链15位突变体的热稳定性的评价》将SEB3-2-7的野生型/突变体的培养上清组分用ly。BSA-PBS稀释，制成50pl/管，在42。C的水浴中处理2小时。然后恢复至室温，进行ELISA,以所得吸光度相对于未处理样品的吸光度的比例作为残留活性，表示在图表中。结果可以确认，SEB3-2-7的V15R和V15S突变体的热稳定性提高(图17)。《实施例31:使用SEB3-2-7进行的L链15位突变体的酸耐性评价》将SEB3-2-7的野生型/突变体的培养上清组分用P/。BSA-PBS稀释，制成50)li1/管。用1NHCl和pH计(HORIBA)调节至pH4.5或pH4.0,在25。C处理2小时。然后用lMTris-HCl(pH9.5)调节至pH7，进行ELISA,以所得吸光度相对于未处理样品的吸光度的比例作为残留活性，表示在图表中。结果可以确认，SEB3-2-7的V15R和V15S突变体对酸的耐性提高(图1S)。《实施例32:使用RNOK203进行的L链18位突变体的热稳定性的评价》将RNOK203的野生型/突变体的培养上清组分用BlockAce稀释，制成50pl/管，在45。C的水浴中处理2小时。然后恢复至室温，进行ELISA,以所得吸光度相对于未处理样品的吸光度的比例作为残留活性，表示在图表中。结果可以确认，RNOK203的P18R、P18S和P15F突变体的热稳定性提高(图19)。《实施例33:使用RNOK203进行的L链18位突变体的酸耐性评价》成50pl/管。用1NHCl和pH计(HORIBA)调节至pH4.0,在25。C处理2小时。然后用lMTns-HCl(pH9.5)调节至pH7，进行ELISA,以所得吸光度相对于未处理样品的吸光度的比例作为残留活性，在突变体之间进行比较。结果可以确认，RNOK203的P18F、P18A、P18R、P18Q和P18S突变体对酸的耐性提高。代表例子如图表所示(图20),其余的突变体的各残留活性相对与野生型残留活性的比率汇总于表2中。[表2]<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>《实施例34:使用RNOK203进行的L链18位突变体的冻融耐性评价》到的样品和只进行l次得到的样品，进行ELISA,以冻融6次的样品的吸光度相对于冻融1次的样品的吸光度的比例作为残留活性，表示在图表中。结果可以确认，RNOK203的P18R、P18S、P18F和P18L突变体对冻融的耐性提高(图21)。产业实用性照^CabatnumbLing)的至少^个氨基酸置换为除脯氨酸或半胱^氨酸之外的其它氨基酸，通过对所述抗体的特征部位的仅一个氨基酸的置换，即可以得到表达量和/或稳定性提高的抗体。因此，由本发明的方法得到的表达量和/或稳定性提高的人抗体或人源化抗体同时具有高抗原特异性、低免疫原性、高产率和稳定性高等优异特征，作为以疾病相关抗原作为靶的特异性抗体，在人的诊断或治疗等临床中非常有用。权利要求1.改良人抗体或人源化抗体以得到表达量和/或稳定性提高的抗体的方法，其特征在于将人抗体或人源化抗体的可变区轻链，即VL链的、按照Kabat记数的第8位、12位、15位或18位的至少其中一个氨基酸置换为除脯氨酸或半胱氨酸之外的其它氨基酸。2.权利要求l的方法，其特征在于将位于VL链的8位、12位、15位或18位的至少一个脯氨酸、或15位的氨基酸置换为除脯氨酸或半胱氨酸之外的其它氨基酸。3.权利要求1或2的方法，其中，置换后的各位置的氨基酸分别选自下述的任意一种氨基酸8位:Gly、Thr、Arg或Ser12位:Ser、His、Val、Gly、Leu、Arg、Phe、Met或Glu15位Arg、Ser、Gly或Phe18位:Arg、Ser、Phe、Ala、Trp、Leu或Gln4.权利要求l-3中任一项的方法，其中，该VL链属于人Vid家族、人Vk2家族或人Vk3家族的其中之一。5.权利要求l-4中任一项的方法，其中，属于人VKl家族的VL链在置换后的各位置的氨基酸分别选自下述任意一种氨基酸8位Gly、Thr、Arg或Ser15位Arg或Ser6.权利要求5的方法，其中，该属于人VKl家族的VL链在置才奂前的FR1具有来自GenBank检索号No.X59315的DPK9的序列。7.权利要求5或6中任一项的方法，其中，置換后的属于人Vk1家族的VL链的FR1是选自SEQIDNo.2-7中的氨基酸序列的氨基酸序列。8.权利要求l-4中任一项的方法，其中，属于人VK2家族的VL链在置换后的各位氨基酸分别选自下述任意一种氨基酸12位:Ser、His、Val、Gly、Leu、Arg、Phe、Met或Glu15位Arg1M立Arg、Ser、Phe、Ala、Trp、Leu或Gln9.权利要求8的方法，其中，属于该人VK2家族的VL链在置换前的FR1具有来自GenBank检索号No.X63403的DPK18的序列。10.权利要求8或9中任一项的方法，其中，置換后的属于人Vk2家族的VL链的FR1是选自SEQIDNo.9-25的氨基酸序列的氨基酸序列。11.权利要求l-4中任一项的方法，其中，属于人VK3家族的VL链在置换后的各位氨基酸选自下述任意一种氨基酸15位Arg、Ser、Gly或Phe12.权利要求ll的方法，其中，属于该人VK3家族的VL链在置换前的FR1具有来自GenBank检索号No.X59315的DPK22的序列。13.权利要求11或12中任一项的方法，其中，置換后的属于人Vk3家族的VL链的FR1是选自SEQIDNo.27-30的氨基酸序列的氨基酸序列。14.权利要求1-13中任一项的方法，其中，该抗体是完全抗体、或者Fab、Fab，、F(ab，)2、scAb、scFv、双抗体或scFv-Fc的抗体片段、或者它们与其它蛋白的融合抗体或融合抗体片段、结合有低分子标记物的抗体或抗体片段、被高分子修饰物修饰的抗体或抗体片段。15.权利要求1-14中任一项的方法，该方法是通过基因重组技术进行氨基酸置换。16.人抗体或人源化抗体、或者人抗体片段或人源化抗体片段，它们由权利要求1-14中任一项的方法得到，表达量和/或稳定性提高。17.人抗体或人源化抗体、或者人抗体片段或人源化抗体片段的制备方法，该方法是将人抗体或人源化抗体、或者人抗体片段或人源化抗体片段的可变区轻链，即VL链的、按照Kabat记数的第8位、12位、15位或18位的至少一个氨基酸用除脯氨酸或半胱氨酸之外的其它氨基酸置换，得到表达量和/或稳定性提高的抗体的方法，该方法包含以下步骤制备编码含有置换后的VL链的氨基酸序列的该人抗体或人源化抗体、或者人抗体片段或人源化抗体片段的氨基酸序列的基因，将该基因转化真核系统或原核系统生物的宿主，使该人抗体或人源化抗体、或者人抗体片段或人源化抗体片段在该宿主中表达，接着回收该人抗体或人源化抗体、或者人抗体片段或人源化抗体片段。18.人抗体或人源化抗体、或者人抗体片段或人源化抗体片段，它们是由权利要求17的方法制备的，表达量和/或稳定性提高。全文摘要本发明提供改善抗体的表达量或稳定性等性状的方法。其特征在于将人抗体或人源化抗体的可变区轻链，即VL链的、按照Kabat记数的第的8位、12位、15位或18位的至少其中一个氨基酸置换为脯氨酸或半胱氨酸之外的其它氨基酸。本发明还提供改善人抗体或人源化抗体、获得表达量和/或稳定性的抗体的方法；以及由该方法得到的表达量和/或稳定性提高的人抗体或人源化抗体、或者人抗体或人源化抗体的片段。文档编号C07K16/46GK101155832SQ20068001135公开日2008年4月2日申请日期2006年2月7日优先权日2005年2月8日发明者中岛敏博,鸟饲正治申请人:财团法人化学及血清疗法研究所