专利名称：：抑制转谷氨酰胺酶的肽的制作方法
技术领域：
：本发明涉及转谷氨酰胺酶肽抑制剂。更具体而言，本发明涉io及转谷氨酰胺酶特异性肽抑制剂，其抑制转谷氨酰胺酶介导的I-KBa聚合，因此有效地预防和治疗由转谷氨酰胺酶活化引起的疾病。本发明也涉及包含一种或多种转谷氨酰胺酶肽抑制剂作为活性成分的药学组合物，以及涉及使用该组合物预防和治疗由于转谷氨酰胺酶活化所引起的疾病的方法。1
背景技术：
：转谷氨酰胺酶是保护性酶，其在正常条件下是造成对组织受损应答的血凝固的原因。然而，这些酶也被报道在缺乏其表达水平20调控的多种疾病的病理机制中，起关键作用(Soo-YoulKim:NewTargetAgainstInflammatoryDiseases:Transglutaminase2.Ac/n'v羅/wmwwo/og/aecfeT7era//ae52，332-337,2004.Soo-YoulKim.Transglutaminase2ininflammation,i^owf5/os"'.11,3026-3035，2006)。特别地，当多种炎性疾病发生时，转谷氨酰胺酶的表达增加，25所述炎性疾病包括类风湿性关节炎、糖尿病、炎性肌炎、动脉粥样坏死、中风、肝硬化、乳腺癌、阿尔茨海默氏病、帕金森病、杭廷顿舞蹈病、脑炎、腹部疾病等。当癌症开始转移或改变成化学抗性或抗辐射性时，也观察到转谷氨酰胺酶和NF-kB表达水平的增加(Soo-YoulKim.Transglutaminase2ininflammation.FrawfB/cwc/.11，3026-3035,302006)。癌症中转谷氨酰胺酶和化学抗性的关系，至今仍保持不清楚。然而，当转谷氨酰胺酶表达在化学抗性的乳腺癌细胞中被抑制时，癌细胞变得高度容易受到化学药品影响，并最后死亡(Antonyaketal.,Augmentationoftissuetransglutaminaseexpressionandactivationbyepidermalgrowthfactorinhibitdoxorubicin-inducedapoptosisinhuman5breastcancercells.JBiolChem.2004Octl;279(40):41461-7.;Dae-SeokKimetal.ReversalofDrugResistanceinBreastCancerCellsbyTransglutaminase2InhibitionandNF-BInactivation.CancerRes.2006.66，10936-10943)。也因为负责活化转谷氨酰胺酶的病原机制被在分子水平阐述10清楚，所以存在令人信服的抑制转谷氨酰胺酶活性的原因(KeyChungPark,KyungCheonChung，Yoon-SeongKim,JongminLee,TongH.Joh，andSoo-YoulKim.Transglutaminase2inducesnitricoxidesynthesisinBV-2microglia._Sz'oc/zem.5z'op/zj^.C"owmww.323，1055-1062,2004;JongminLee，Yoon-SeongKim，Dong画HeeGhoi,MoonS.Bang,TTay15R.Han,TongH.Joh，andSoo-YoulKim.Transglutaminase2inducesNF-kBactivationviaanovelpathwayinBV-2microglia./5/o/.CT^m.279，53725-53735,2004;Dae-SeokKimetal.ReversalofDrugResistanceinBreastCancerCellsbyTransglutaminase2InhibitionandNuclearFactor画KBInactivation.CancerRes.2006.CancerRes.2006.66,2010936-10943)。发炎很大程度上归因于NF-kB的活化。己知NF-kB通过信号转导途径中的激酶而活化。然而，也发现NF-kB可独立于激酶而被活化，从而使激酶抑制剂的功能无效(Tergaonkaretal.，I-kappaBkinase-independentI-Bdegradationpathway:functionalNF-kappaB25activityandimplicationsforcancertherapy.MolCellBiol.2003Nov;23(22):8070画83.)。在本发明人进行的先前的研究中，报导了转谷氨酰胺酶独立于激酶(IKK、NAK)的活化，通过诱导I-KB的交联而活化NF-KB(JongminLee，etal.Transglutaminase2inducesNF-kBactivationviaa30novelpathwayinBV-2microglia.J.Biol.Chem.279,53725-53735,2004)。转谷氨酰胺酶是钙依赖性酶，其仅在细胞内钙水平升高的情况下可以活化NF-kB。—旦发炎，转录因子NF-kB的活化不但导致了包括转谷氨酰胺酶的炎性因子的表达水平升高，而且导致了其抑制剂I-KB的表达水平升高。持续NF-KB活化在正常条件下被I-KB抑制，但是在慢性炎性疾病中NF-kB继续活化。有趣地，TNF-a或LPS(脂多糖)诱导的NF-kB活化引起了转谷氨酰胺酶表达。因此，在炎性细胞中异常活化的转谷5氨酰胺酶预期直接活化NF-KB或进一步保持活化的NF-KB，从而在炎症持续中起重要作用(图1)。此外，这种恶性循环可以是癌症转移和化学抗性的主要原因(JongminLee,etal.Transglutaminase2inducesNF-kBactivationviaanovelpathwayinBV-2microglia.J.Biol.Chem.279，53725-53735,2004)。io因此，转谷氨酰胺酶抑制剂可以在中断KF-KB持续循环中起关键作用，本发明人提出的类固醇取代效应(steroid-substitutingeffect)正是基于此点(Sohn，J"Kim，T,I.,Yoon，Y,H.，andKim,S,Y.:TransglutaminaseInhibitor:ANewAnti-InflammatoryApproachinAllergicConjunctivitis.J.Clin.Invest.Ill,121-8，2003)。15己知胺化合物抑制转谷氨酰胺酶活性。代表性的TGase抑制剂是胱胺(NatureGenetics18，111-117,1998;NatureMedicine8,143-149,2002)和腐胺。除了胺化合物，其它化学抑制剂，例如单丹酰尸胺(J.Med.Chem.15，674-675，1972)、w-二节基氨基烷基胺(J.Med.Chem,18，278-284，1975)、3-卣素-4，5-二氢异"恶唑(Mol.Pharmacol.35，20701-706，1989)和2-[(2-氧丙基)硫]咪唑镄盐衍生物(Blood,75,1455-1459，1990)也被发展，但是报道其有毒性以致于在体内非特异性抑制其它酶。因此，需要安全并且有效的转谷氨酰胺酶特异性抑制剂。近来，Sohn等己经成功地从重组肽中，得到与用于豚鼠模型中豚草过敏25性结膜炎炎症的类固醇药物相同的效果(Sohn,J.，Kim,T,I.,Yoon，Y,H.,andKim，S.-Y.:TransglutaminaseInhibitor:ANewAnti-InflammatoryApproachinAllergicConjunctivitis.J.Clin.Invest.Ill,121-8，2003)。考虑到这点，使用抗炎蛋白(PLA2抑制剂)或抑弹性蛋白酶蛋白(非常强的转谷氨酰胺酶底物，Nara，K.，etal.1994.Elastaseinhibitorelafinisa30newtypeofproteinaseinhibitorwhichhasatransglutaminase-mediatedanchoringsequencetermed"cementoin".JBiochem(Tokyo).6115:441-448)-衍生的合成肽，该合成肽模拟转谷氨酰胺酶催化位点。基于前述，本发明人进行了精深而完整的研究，导致了本发明，其允许本发明人鉴定涉及转谷氨酰胺酶诱导的I-KBa聚合的谷氨酰胺和赖氨酸残基的位置，并且使得本发明人发现，含有这些残基的5I-KBa-来源的肽或其同系物，抑制转谷氨酰胺酶诱导的I-KBa的聚合，因此可作为转谷氨酰胺酶抑制剂。
发明内容io[12]因此，本发明的一个目标是提供抑制转谷氨酰胺酶的肽，其包括I-KBa源片段或其突变体。本发明的另一个目标是提供抑制转谷氨酰胺酶的组合物，其包括所述肽作为活性成分。本发明的进一步的目标是提供抑制转谷氨酰胺酶的方法，其15包括施用所述肽。本发明的更进一步的目标是提供制备所述肽的突变体的方法，所述突变体对转谷氨酰胺酶介导的I-KBa聚合具有抑制活性，所述方法包括在所述肽氨基酸序列中取代、缺失或插入至少一个氨基酸残基。20附图简述通过下面结合附图进行的详细描述，本发明的上面的和其它的目标、特征和优势将被更清楚地理解，其中25[17]图1是如此示意图，其阐明了在免疫细胞(NTHi,非典型流感嗜血杆菌；TLR，toll样受体；TNFR,肿瘤坏死因子-a受体；IKK，I-kB激醇；CKII,酪蛋白激酶II;TK，酪氨酸激酶；C0X-2,环加氧酶-2;PLA2,可溶性磷酯酶A2;NO,—氧化氮)的活化过程中的转谷氨酰胺酉每(transglutaminase)的作用；30[18]图2是转谷氨酰胺酶的酶反应的顺序，其中底物2提供了赖氨酸残基(酰基受体、胺供体)，用于和谷氨酰胺残基异形成异肽共价键[N、(Y-谷氨酰基)-L-赖氨酸(GGEL)]，并且GQCWVFA是位于转谷氨酰胺酶活化位点处的氨基酸序列。硫酯共价酶中间产物在反应中间被看到。基于"乒乓"动力学机制的这种酶反应，可以使用胺化合物(胺、二胺、多胺)代替赖氨酸残基作为酰基受体。5[19]图3示出了分离的I-KBa通过转谷氨酰胺酶的聚合，其在4-12%NuPAGE(Invitrogen)上进行鉴定；图4和图5示出了在转谷氨酰胺酶诱导的I-KBa交联后，水解消化I-KBa释放出的肽的MS分析，其中使用MALDI-TOF确定肽质io[21]图6示出了I-KBa的氨基酸序列，其中红色字符表示转谷氨酰胺酶的结合位点；图7和8示出了转谷氨酰胺酶介导的I-kB(x的聚合，其通过使用合成肽处理而被拯救(rescue);和图9是代表了I-KBa中的多种功能结构域和氨基酸残基的示15意图。在I-KBa的N-末端区域，发现两个遍在蛋白化位点、两个丝氨酸磷酸化位点和一个酪氨酸磷酸化位点。C-末端区域包括PEST序列和富含QL(谷氨酰胺和亮氨酸)的区域。五个锚蛋白重复序列用带阴影的方框所表示，并且交联位点被用黑体字符在上面的图中指出。20本发明的最佳实施方式依照一个方面，本发明涉及抑制转谷氨酰胺酶活性的I-KBa来源的肽。转谷氨酰胺酶(Transglutaminase(TGase))属于0&2+-依赖型25酶家族，其催化在肽结合赖氨酸和谷氨酰胺残基之间形成N、(Y-L-谷氨酰基)-L-赖氨酸异肽键(图2)。已知N、(？L-谷氨酰基)-L-赖氨酸的交联，稳定了在上皮、凋亡和细胞外基质形成中起屏障功能的细胞内和细胞外蛋白。TGase通常在许多不同的组织中以低水平进行表达，并且TGase不适合在多种病理条件下活化。特别地，炎性疾病和癌症引起30TGase表达的增加。在本发明人先前进行的研究中，已经证明TGase诱导的免疫应答机制是基于转谷氨酰胺酶诱导I-kB(x聚合并因而活化NF-kB的能力(JongminLee，etal.Transglutaminase2inducesNF-kBactivationviaanovelpathwayinBV-2microglia.CTzem.279，53725-53735,2004)。根据本发明，提供了转谷氨酰胺酶特异性肽抑制齐U，用来抑制转谷氨酰胺酶活化机制中的I-KBa的聚合(ParkS.-S.，etal.5Transglutaminase2mediatespolymerformationofI-kappaBalphathroughC-terminalglutaminecluster.JBiolChem.2006Sep20;[Epubaheadofprint].)。如本文使用的，术语"肽"指经酰胺键(或肽键)连接在一起的氨基酸的聚合物。根据本发明的肽，是抑制转谷氨酰胺酶诱导的ioI-KBa的聚合的转谷氨酰胺酶特异性抑制剂。在更多的细节中，作为转谷氨酰胺酶抑制剂的本发明的肽，源自I-kBoi的SEQIDNO.:l的氨基酸序列，其具体为(i)由氨基酸位置11到30的5个或更多连续氨基酸构成的肽片段，其中包含赖氨酸21和赖氨酸22，(ii)由氨基酸位置81至U100的5个或更多连续氨15基酸构成的肽片段，其中包含赖氨酸87，(iii)由氨基酸位置151到200的5个或更多连续氨基酸构成的肽片段，其中包含赖氨酸177，(iv)由氨基酸位置261到290的5个或更多连续氨基酸构成的肽片段，其中包含谷氨酰胺266到268或谷氨酰胺271,或(v)由氨基酸位置301到317的5个或更多连续氨基酸构成的肽片段，其中包含谷氨酰胺31320(ParkS.-S.，etal.Transglutaminase2mediatespolymerformationofI-BthroughC-terminalglutaminecluster.JBiolChem.2006,281，34965-72)。在本发明的实施方式中，分离的I-KBa在存在转谷氨酰胺酶的情况下被诱导聚合，以便确定转谷氨酰胺酶诱导的聚合发生的I-KBa25位点。使用蛋白酶将I-KBa聚合物消化完全，并且使用MALDI-TOF质谱仪(4700ProteomicsAnalyzer,AppliedBiosystems)分析该肽消化物。MALDI-TOF质谱仪上的数据揭示，在位置21、22、87和177的赖氨酸残基和在位置266-268、271和313的谷氨酰胺残基，在转谷氨酰胺酶介导的I-kBcx的交联被优选使用。30[28]从在转谷氨酰胺酶介导的I-kBcx聚合中涉及的氨基酸残基上的信息，本领域技术人员可很容易合成包含聚合诱导残基的多种肽，以致其表现出对转谷氨酰胺酶的抑制活性(ParkS.-S.，etal.Transglutaminase2mediatespolymerformationofI-kappaBalphathroughC-terminalglutaminecluster.(JBiolChem.2006，281，34965-72》。在本发明的另一个实施方式中，在赖氨酸和谷氨酰胺残基基5础上合成肽，以便具有下列氨基酸序列SEQIDNO.:2的RDGUCKERIX、SEQIDNO.:3的IHEEKALTM、SEQIDNO.:4的HSILKATNY、SEQIDNO.:5的IL^AT、SEQIDNO.:6的GVLTQSCTT、SEQIDNO.:7的ENLQMLP、SEQIDNO.:8的VFGGQRLTL、SEQIDNO.:9的TRIQOOLGOLTL、10的RIQQQLGio和SEQIDNO.:11的LGQLT，并且发现该肽抑制转谷氨酰胺酶介导的I-kBcx的聚合。进一步，根据本发明的肽的突变体处于本发明的范围内。如本文使用的术语"突变体"指具有如此氨基酸序列的肽，其通过至少一个氨基酸残基的缺失、插入或非保守或保守的取代或它们的组合，15使其不同于源自I-KBot氨基酸序列的天然氨基酸序列。在本发明的进一步的实施方式中，具有SEQIDNO.:12的RIQEELG、SEQIDNO.:13的RIEQELG和SEQIDNO.:14的RIEEQLG氨基酸序列的突变体被发现抑制了转谷氨酰胺酶介导的I-kB(x的聚合(transglutaminase-mediatedI-kBcxpolymerization)。20[32]本发明的肽可以具有L-构型或D-构型，或者可以是它们的消旋体。进一步，本发明的肽可以根据目的进行修饰，例如在特定的原子或原子团上具有羟基和/或甲基取代基的衍生物、用酰胺或酯基取代C-末端羧基的衍生物、或用氢取代N-末端氨基的衍生物。另外，本发明的肽可以包含靶向信号、标志、标记的残基或25适于增加其稳定性的附加氨基酸序列。也可以加入促进将肽引入细胞的细胞可渗透肽。本发明的肽也可根据本领域众所周知的多种技术进行制备，这些技术包括化学合成、无细胞蛋白质合成或基因重组。盐是本发明的肽的可能形式。本发明的肽可与酸形成盐，所30述酸例如无机酸(盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸或硫酸)、有机羧酸(乙酸、卤代乙酸例如三氟乙酸、丙酸、马来酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸或水杨酸)和有机磺酸(甲磺酸或对甲苯磺酸)，其包括糖酸(糖醛酸、半乳糖醛酸、葡糖酸或抗坏血酸)、酸性多糖(透明质酸、硫酸软骨素或arginicacid)或者磺酸酯(硫酸软骨素)。依照本发明，转谷氨酰胺酶肽抑制剂有效地预防和治疗由转s谷氨酰胺酶不恰当活化引起的所有疾病。优选地，本发明的肽可用于预防或治疗不恰当的转谷氨酰胺酶活化引起的炎性疾病或癌症。依照另一个方面，本发明涉及包含至少一种本发明的肽的转谷氨酰胺酶抑制组合物。术语"炎性疾病(inflammatorydisease)"指通过对抗机体状io态(物理、化学和生物状态)的有害影响而产生的机体的防御应答或炎性应答引起的任何疾病或紊乱，其伴随着红斑、水肿、触痛、发热和/或机能障碍综合症。本发明的组合物可用于预防和治疗转谷氨酰胺酶过量表达诱导的所有炎性疾病。转谷氨酰胺酶活化引起的炎性疾病的实例包括变性关节炎(类风湿性关节炎)、糖尿病、自身免疫性肌炎15(炎性肌炎)、动脉粥样硬化、中风、肝硬化、乳腺癌、阿尔茨海默氏病、帕金森病、杭廷顿舞蹈病、脑炎和腹部疾病。至于癌症，一旦转移或开始化学抗性或抗辐射性，可发现转谷氨酰胺酶的表达水平的明显增加。因此，抑制转谷氨酰胺酶成为预防和治疗癌症以及炎性疾病的关键。可施用本发明的转谷氨酰胺酶肽20抑制剂进行治疗和预防的癌症的具体实例，包括但不限于大肠癌、小肠癌、直肠癌、肛门癌、食道癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、子宫癌、乳腺癌、肺癌、淋巴瘤、甲状腺癌、前列腺癌、白血病、皮肤癌、结肠癌、脑瘤、膀胱癌、卵巢癌、胆囊癌等。如本文使用的术语"预防(prevention)"或"预防(prophylaxis)"25指所有这样的行为通过施用本发明的组合物抑制或延缓(restrainorretard)转谷氨酰胺酶活化引起的任何疾病的发生。如本文使用的术语"治疗"指所有这样的行为通过施用本发明的组合物，转谷氨酰胺酶活化引起的任何疾病己有所好转或者己有利地减轻。本发明的组合物可被运用到，由于转谷氨酰胺酶的活化而遭30受炎性疾病或癌症的哺乳动物，这些哺乳动物包括牛、马、绵羊、猪、山羊、骆驼、羚羊、狗、和猫，以及人。包含至少一种本发明肽的组合物可被单独使用，或者与其它化合物联合使用，所述化合物例如糖链、脂类、核酸、其它肽或蛋白质。例如，可以与本发明的肽一起使用的脂类的实例如下二棕榈酸磷脂酰胆碱(dipalmitoylphosphatidykholine(DPPC))、棕榈酰油基磷脂5酰甘油酯(palmitoyloleyphosphatidylglycerol(POPG))、磷脂酰甘油酯(phosphatidylglycerol(PG))、C18饱和脂肪酸、C16不饱和脂肪酸和C18不饱和脂肪酸。依照给药途径，本发明的组合物可配制成包含药学上可接受载体的多种剂型。适当的剂型在本领域是众所周知的，其可以包括帮io助肽渗透入或运动入细胞的典型的添加剂。包含依照本发明作为活性成分的肽的组合物可被用于普通的医药制剂中。非口服剂型可以是无菌水溶液、非水溶液、悬浮液、乳剂或冻干制剂。适合本发明的组合物的口服剂型的实例包括片剂、含片、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆或糯米纸囊剂。注射剂可被制备成例15如单剂针剂型或多剂针剂型。本发明的药学上的组合物也可包括药学上可接受的赋型剂。例如适合用于口服给药的赋形剂，其包括结合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、染料和/或香料。注射剂可包含添加剂，例如缓冲剂、防腐剂、疼痛缓解剂、增溶剂、等渗剂20(isotonics)和稳定剂的组合。对于局部给药，可以使用基质、赋形剂、润滑剂和防腐剂。任选地，本发明的组合物可包含编码本发明肽的核酸序列，其可作为模板用来在细胞内表达肽。依照进一步的方面，本发明涉及抑制转谷氨酰胺酶的方法，25其包括施用一种或多种所述肽或所述组合物。优选地，提供了预防和治疗免疫疾病的方法，该方法的特征是施用本发明的一种或多种肽的组合物，以便抑制转谷氨酰胺酶介导的I-kBcx的聚合。在本发明的实施方式中，用于抑制转谷氨酰胺酶的方法通过30将本发明的一种或多种肽或组合物经过适当的途径投药给患者而实现。投药可使用但不限于腹腔内的、静脉内的、肌肉内的、皮下的、皮内的、口服的、局部的、鼻内的、肺内的或直肠的途径。对于口服给药，肽可优选地使用适当的物质进行包衣，或者肽可配制到制剂中，以便不会在胃被消化或溶解。本发明的药学上的组合物也可借助于将活性成分输送进入靶细胞的方法进行投药。优选地是静脉内注射、皮5下注射、皮内注射或滴注。注射剂制剂可基于水溶液，例如生理盐水或格林氏溶液(Ringer'ssolution)，或基于非水溶液，例如植物油、高级脂肪酸酯(例如油酸乙酯等)和醇(例如乙醇、苯甲醇、丙二醇或丙三醇)，并且注射剂制剂可包括药学上可接受的载体，例如抗菌稳定剂(例如抗坏血酸、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、BHA、维生素E、EDTAio等)、乳化剂、pH调节缓冲液、和/或抗菌防腐剂(例如硝酸苯汞、乙基汞硫代水杨酸钠、苯扎氯铵、苯酚、甲酚、苯甲醇等)。在本发明优选的实施方式中，用于抑制转谷氨酰胺酶的方法通过以治疗有效量施用本发明的肽或组合物得以实现。对患者的治疗有效量可依照本领域众所周知的多种因素进行改变，这些因素包括疾15病种类、患者的生理状况——例如年龄、体重、健康状态、性别、药物敏感性等——、给药途径、给药频率和给药时间、治疗时间周期、剂型、一起使用的其它药物等。依照更进一步的方面，本发明涉及制备所述肽突变体衍生物的方法，所述突变体衍生物仍抑制转谷氨酰胺酶介导的I-KB(x聚合，所20述方法包括在所述肽的氨基酸序列中取代、缺失或插入一个或多个氨基酸残基。在本发明的实施方式中，己经发现I-KBa源的转谷氨酰胺酶突变体具有对转谷氨酰胺酶的抑制活性。根据下面的实施例，可以更好的理解本发明，提出这些实施25例是为了进行说明，而不能理解为对本发明的限制。实施例1:转谷氨酰胺酶作用于I-KB(X的交联位点通过转谷氨酰胺酶的I-KBa聚合30[54]人I-KBa在大肠杆菌(￡.co/OBL21(DE3)中大量表达，并且在使用前进行纯化。将人I-KBa基因亚克隆到pET-30EK/LIC载体，携带该载体的五.co/ZBL21，在37'C下，在存在100ppm卡那霉素的LB培养基中培养。当培养基达到0.2-0.3的OD时，加入IPTG(异丙基-P-D-硫代吡喃半乳糖苷)0.2-1.0mM，然后诱导I-KBa表达3-12小时。在离心后，超声处理细胞沉淀，由于N-末端的组氨酸标记，使用Ni-NTA5树脂初步分离出I-KBa。通过使用肠激酶进行消化和通过与Ni-NTA树脂再次结合，N-末端的组氨酸标记被完全分离，以便提供完整的I-kBou对于在体外聚合，将10微克纯化的I-KBa和lmU的转谷氨酰胺酶(豚鼠肝，Sigma)—起温育在包含pH7.5的50mMTris-HCl和10mMCaCl2的反应混合物中。使用4-12%的NuPAGE凝胶电泳10(Invirtrogen)分析聚合作用(图3)。因此，使用离心过滤设备(Centricon,分子量截留值(M.W.cut-off)100kDa,Millipore)分离I-KBa聚合物。如图3中所见，磷酸化位点都被修饰的完整I-KBa和突变体I-KBa，通过转谷氨酰胺酶被聚合成高分子量的聚合物。作为钙-依赖性酶，转谷氨酰胺酶在存在EDTA的情况下被抑制。15I-KBa聚合体的水解为了变性，纯化的I-KBa聚合体(10微克)，在55。C下，温育在4M含有10mM的二硫酚苏糖醇的尿素中过夜，使用100mM的NH4HC03将尿素的浓度稀释到1M。使用胰蛋白酶(Promega)或内切蛋白酶Glu-C(V8，Roche)，在37'C下过夜消化该聚合体。20MALDI-TOFMS分析使用MALDI-TOF质谱仪(4700ProteomicsAnalyzer,AppliedBiosystems)确定消化的肽的质量(图4和图5)。使用Zip-TipsC18(Millipore)将样品脱盐，在正好位于质量分析靶(massanalysistarget)上的基质溶液(CHCA的1:1v/v0.1%TFA/CAN溶液)中洗脱样品，25并且干燥样品。在阳离子反射模式中施行分析，使用得自4700CalMix(AppliedBiosystems)的标准样品在50ppm容许下，校准测量的质谱。使用的标准样品如下脱-精氨酸、缓激肽(Mr卯4.46S1)、血管紧张素1(Mr1296.6853)、谷氨酸L血纤肽B(Mr1570.6774)、ACTH1-17中间叶促皮质样肽(clip)(Mr2093.0867)、ACTH18-39中间叶促皮质30样肽(Mr2465.1989)和ACTH7-38中间叶促皮质样肽(Mr3657.9294)。DataExplorer软件(AppliedBiosystem)被用于处理数据。在除去了对应于角蛋白和蛋白酶本身的峰之后，测量的峰与理论上可能的肽的峰相符合。对于这点，在100ppm容许，使用Paw程序(GenomicSolutions)。实施例2:使用I-kBoi聚合体的Gki-C消化液进行蛋白分析5竞争测定I-KBa(2微克)与0.5mU的TGase—起温育在包含pH7.5的50mMTris和10mMCaCl2的反应缓冲液中，并且该缓冲液中含有或不含有表1中的肽(2nmol)，以便观察到I-KBa交联。表1中的肽在PeptronInc合成。在37。C下温育10分钟后，通过SDS-PAGE分离反应io物，并且通过Coomassie染色使其可视化。使用AdobePhotoshop软件测量带的强度(图7和图8)。如图7和图8所见，特别包含N-末端谷氨酰胺簇(Q255-Q268)、赖氨酸177或谷氨酰胺313的肽是优秀的竞争剂，赖氨酸残基21和22竞争性抑制酶。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>工业实用性作为迄今描述的转谷氨酰胺酶抑制剂，根据本发明的肽或包含所述肽之一的药学组合物，在预防和治疗转谷氨酰胺酶异常活化引起的疾病中是非常有用的，特别在预防和治疗炎性疾病和癌症中是非常有用的。本发明已经以说明性的方式进行了描述，应该理解，使用的术语拟为描述的类型，而不是限制的类型。按照上面的教导，本发明的许多修改和变化是可行的。因此，应该理解，除了具体描述的本发明，在所附权利要求范围内本发明也是可行的。权利要求1.转谷氨酰胺酶肽抑制剂，其对转谷氨酰胺酶具有抑制活性，并且其源自I-κBα的SEQIDNO.1的氨基酸序列，其包括(i)由氨基酸位置11到30的5个或更多连续氨基酸构成的肽片段，其中包含赖氨酸21和赖氨酸22；(ii)由氨基酸位置81到100的5个或更多连续氨基酸构成的肽片段，其中包含赖氨酸87；(iii)由氨基酸位置151到200的5个或更多连续氨基酸构成的肽片段，其中包含赖氨酸177；(iv)由氨基酸位置261到290的5个或更多连续氨基酸构成的肽片段，其中包含谷氨酰胺266到268或谷氨酰胺271；或(v)由氨基酸位置301到317的5个或更多连续氨基酸构成的肽片段，其中包含谷氨酰胺313。2.根据权利要求l所述的转谷氨酰胺酶肽抑制剂，其中所述抑制剂包括至少一种选自SEQIDNO.:2到14的氨基酸序列。3.用于抑制转谷氨酰胺酶的药学组合物，其包括权利要求l所述的转谷氨酰胺酶肽抑制剂作为活性成分。204.根据权利要求3所述的药学组合物，其中所述药学组合物对转谷氨酰胺酶具有抑制活性，并且所述药学组合物有效地预防和治疗炎性疾病或癌症。5.用于抑制转谷氨酰胺酶的方法，其包括使用至少一种权利要求1所述的转谷氨酰胺酶肽抑制剂。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述方法被用于预防和治疗炎性疾病或癌症。7.用于制备对转谷氨酰胺酶介导的I-KBa的聚合具有抑制活性的突变体肽的方法，其包括在权利要求1所述的转谷氨酰胺酶肽抑制剂的氨基酸序列中取代、缺失或插入至少一个氨基酸残基。全文摘要本文公开的是对转谷氨酰胺酶具有抑制活性的转谷氨酰胺酶肽抑制剂，和包含一种转谷氨酰胺酶肽抑制剂作为活性成分的药学组合物。抑制剂或组合物可用于预防和治疗由异常转谷氨酰胺酶活化所引起的多种疾病，所述疾病包括炎性疾病和癌症。本文也公开了治疗各种炎性疾病和癌症的方法，和制备能抑制转谷氨酰胺酶的突变体肽的方法。文档编号C07K14/00GK101180311SQ200680011298公开日2008年5月14日申请日期2006年10月11日优先权日2005年12月16日发明者朴成洙,金仁厚,金铢烈申请人:国立癌中心