专利名称：利用集成膜技术从谷氨酰胺酶或谷氨酰转肽酶转化液中分离、浓缩l-茶氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及分离、提取L-茶氨酸的方法，具体涉及应用集成膜技术从微生物发酵酶转化L-茶氨酸的酶转化液分离、浓缩L-茶氨酸的方法。
背景技术：
L-茶氨酸(N-乙基-Y-谷氨酰胺，theanine)是一种天然的氨基酸，是茶叶中的特征氨基酸，也是茶叶中有效的呈味物质。L-茶氨酸主要用于(1)作为一种新兴的食品添加剂，可用作为茶饮料的品质改良剂、改善食品风味的添加剂、功能食品的添加剂、 “情绪食品”的添加剂等。已在欧美、日本、中国台湾等国家、地区广泛使用。如日本已开发出添加茶氨酸的巧克力、果冻、布丁、口香糖、保健茶和各种清凉饮料。(2)作为医药中间体领域，茶氨酸可以用作抗肿瘤、降血压、安神镇静、抗疲劳等药物中。此外L-茶氨酸现已作为镇静剂中的有效成分，对帕金森氏症、老年性痴呆、传导神经功能紊乱等疾病起预防效果。L-茶氨酸的生产方法主要有茶叶提取法、化学合成法、微生物发酵酶转化法。(1) 茶叶提取法由于茶叶中茶氨酸的含量不高，从茶叶提取茶氨酸无法实际生产价值。所以植物提取法实际上是从提取茶多酚后的残留液中用离子交换树脂法提取茶氨酸。缺点是生产工序复杂、产品纯度低、产量小、价格高。(2)化学合成L-茶氨酸需要高温、高压及化学催化剂等条件，反应条件要求比较高，副产物多，且产生的都是DL-型消旋体，还需要进行拆分才能得到L-型产品。因此，消旋体的拆分是制约茶氨酸的化学合成法的主要因素。由于化学合成方法在解决手性方面有一定难度，因此会使成本提高以及质量难以控制，且易混杂有毒物质，产品不宜用于食品行业应用，同时生产工艺复杂，且易造成环境污染。(3)微生物发酵酶转化法生产的L-茶氨酸都是L型的，且生产成本低，可大量生产，由于生物酶法合成具有高度的专一性，所以在产品质量方面更接近天然的L-茶氨酸，其发展前景非常广阔。 此外酶转化法生产L-茶氨酸还具有纯度高、副产物少、纯化步骤少、生产能力强等优点，， 因此微生物发酵法是目前国内外研究人员公认的最直接、最经济的L-茶氨酸生产方法。在微生物发酵酶转化L-茶氨酸酶转化液中，除有底物L-谷氨酰胺、乙胺目标产物 L-茶氨酸等成分外，还有微生物菌体、细胞碎片、杂蛋白、小肽和色素等杂质，故L-茶氨酸的分离浓缩工艺难度大，目前国际上报道的分离浓缩L-茶氨酸方法是离子交换树脂分离法，在某一 PH情况下，用离子交换树脂吸附酶转化液中L-茶氨酸，然后再在另一 PH溶液下洗脱被吸附的L-茶氨酸，经浓缩得到L-茶氨酸。但是，从操作工艺、分离浓缩、产品纯度、 经济效益上分析，离子交换树脂的平衡活化，洗杂洗脱、再生清洗都需要消耗大量的酸碱和水，需要的设备和树脂成本较高，同时还产生大量难处理废水，另外L-茶氨酸收率不高(一般低于70%)和产品纯度低，因此开发一种高收率、低成本的L-茶氨酸分离、浓缩方法对促进L-茶氨酸的工业化生产显得十分迫切。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高收率、低成本、产品纯度高的从酶转化液中分离、浓缩L-茶氨酸的方法。本发明的技术方案如下
利用集成膜技术从谷氨酰胺酶或谷氨酰转肽酶转化液中分离、浓缩L-茶氨酸的方法， 包括如下步骤
(a)将酶转化液利用孔径为0.001-0. 01 μ m的超滤膜进行过滤，过滤后得到超滤膜透过液；
(b)将超滤膜透过液用纳滤膜进行过滤，截留分子量为200-1000的物质，过滤后得到纳滤膜透过液；
(c)将纳滤膜透过液通过反渗透膜进行浓缩提取，得到浓缩液；
(d)将浓缩液真空浓缩，结晶得到L-茶氨酸晶体。步骤(a)中的操作压力为0. 15-0. 45MPa，操作温度为20_40°C、pH为8-12 ；步骤 (b)中的操作压力为1. 5-2. OMpa，操作温度为20_35°C，pH为8_11 ；步骤(c)中的操作压力为 15-25Mpa、操作温度为 25-35°C、pH 为 7-10。步骤(a)中酶转化液利用超滤膜进行过滤后，加水稀释过滤得到超滤膜透过液； 步骤(b)中超滤膜透过液用纳滤膜进行过滤后，加水稀释过滤得到纳滤膜透过液。所述水选自纯化水、去离子水、蒸馏水中的一种或几种。所述超滤膜的材质选自陶瓷、聚碳酸酯、聚偏氟乙烯、聚砜、聚砜酰胺中的一种。所述纳滤膜的材质为聚酰胺。所述反渗透膜的材质为醋酸纤维素或芳香聚酰胺。本发明所用的超滤膜只需满足孔径为0. 001-0. 01 μ m即可，优选膜的材质选自陶瓷、聚碳酸酯、聚偏氟乙烯、聚砜、聚砜酰胺
本发明所用的纳滤膜能截留分子量为200-1000并具有类似于聚酰胺纳滤膜结构的膜。由于谷氨酰胺酶或谷氨酰转肽酶合成L-茶氨酸的酶转化液中，除有底物L-谷氨酰胺、乙胺、L-茶氨酸等成分外，还有少量微生物菌体、细胞碎片、杂蛋白、小肽和色素等杂质，采用孔径为0. 001-0. 01 μ m的超滤膜对酶转化液进行过滤，因超滤膜的截留分子量范围是1000 - 200000，酶转化液中的少量微生物菌体、细胞碎片、大分子的色素和杂蛋白的分子量都大于1000，所以超滤膜可有效截留这些杂质，而对分子量小于200的L-茶氨酸产品没有截留作用；然后用孔径截留分子量为200-1000的纳滤膜对透过液进行过滤，一些小分子色素和小肽的分子量正好在200 1000之间，可被纳滤膜截留，另外由于纳滤膜的电荷效应能有效截留少量离子；最后通过反渗透膜对目标产物进行浓缩提取，是最精细的一种膜分离产品，其能有效截留分子量大于100的有机物，同时允许水分子通过，故能达到浓缩L-茶氨酸的目的。本发明具有如下优点
1提取工艺全部采用膜技术分离工艺，操作简单且易实现自动化，收率高，产品纯度高， 耗能少，污染物少；
2整个分离、浓缩过程全部采用物理分离法，分离浓缩过程中不消耗酸碱和蒸汽，水的使用量也大量减少，提取浓缩成本也大大减低。3采取集成膜分离技术，膜及其配套设备使用寿命长，操作容易，装置维护方便，投资成本低。
具体实施例方式本发明所用的酶转化液为谷氨酰胺酶或谷氨酰转肽酶合成L-茶氨酸的酶转化液 (简称L-茶氨酸酶转化液)。实施例1
(a)取100升L-茶氨酸酶转化液，L-茶氨酸的浓度为15.4克/升，选用0. 5m2的管式陶瓷超滤膜在0. 2Mpa，温度为32pH为10. 5时进行过滤，膜孔径为0. 001-0. Olum，截留液体积为15L时，加IOL纯化水稀释后再过滤，重复3次后，得到超滤膜透过液113升，超滤膜透过液中L-茶氨酸浓度为13. 5克/升；
(b)将超滤膜透过液113升，用孔径截留分子量为300的聚酰胺纳滤膜在压强为
1.5MPa,温度为30°C，pH为9. O的条件下进行过滤，截留液体积约20L时，加20L去离子水稀释后再过滤，重复3次后，得到纳滤膜透过液143. 2L，纳滤膜透过液中L-茶氨酸的浓度为 10. 3克/升;
(c)将纳滤膜透过液143.2升，经膜材料为醋酸纤维素的反渗透膜在压强为18MPii，温度为34°C，pH为8. O的条件下浓缩，最终得到浓度为90. 6克/升的L-茶氨酸浓缩液16. 1 升；
(d)将浓缩液真空浓缩、结晶得到纯度为99.4%得L-茶氨酸晶体1436克，整个分离、浓缩工艺L-茶氨酸的收率为93.实施例2
(a)取100升L-茶氨酸酶转化液，L-茶氨酸的浓度为15.4克/升，选用0. 5m2的管式聚偏氟乙烯超滤膜在0. 3Mpa，温度为25°C, pH为10. 5时进行过滤，膜孔径为0. 001-0. Olum, 截留液体积为15L时，加IOL蒸馏水水稀释后再过滤，重复3次后，得到超滤膜透过液118 升，超滤膜透过液中L-茶氨酸浓度为13. O克/升；
(b)将超滤膜透过液118升，用孔径截留分子量为400的聚酰胺纳滤膜在压强为
2.OMPa,温度为25°C，pH为9. 5的条件下进行过滤，截留液体积为20L时，加20L纯化水稀释后在过滤，重复3次后，得到纳滤膜透过液150 L，纳滤膜透过液中L-茶氨酸的浓度为 10. 1克/升;
(c)将纳滤膜透过液150升，经膜材料为醋酸纤维素的反渗透膜在压强为20.OMPa,温度为30°C，pH为8. 5的条件下浓缩，最终得到浓度为97. 6克/升的L-茶氨酸浓缩液15 升；
(d)将浓缩液真空浓缩、结晶得到纯度为99.7%的L-茶氨酸晶体1393克，整个分离、浓缩工艺L-茶氨酸的收率为90. 5%。实施例3
(a)取100升L-茶氨酸酶转化液，L-茶氨酸的浓度为15.4克/升，选用0. 5m2的管式聚砜超滤膜在0. 35MPa，温度为30°C，pH为11. 5时进行过滤，膜孔径为0. 001-0. Olum，截留液体积为15L时，加IOL纯化水稀释后再过滤，重复3次后，得到超滤膜透过液122升，超滤膜透过液中L-茶氨酸浓度为12. 5克/升；
(b)将超滤膜透过液122升，用孔径截留分子量为500的聚酰胺纳滤膜在压强为1. 8MPa,温度为35°C，pH为9. 0的条件下进行过滤，截留液体积为15L时，加15L纯化水稀释后过滤，重复3次后，得到纳滤膜透过液155 L，纳滤膜透过液中L-茶氨酸的浓度为9. 6
克/升；
(c)将纳滤膜透过液155升，经膜材料为芳香聚酰胺的反渗透膜在压强为22MPii，温度为35°C，pH为8. 0的条件下浓缩，最终得到浓度为80. 4克/升的L-茶氨酸浓缩液17升；
(d)将浓缩液真空浓缩、结晶得到纯度为99.7%的L-茶氨酸晶体1355. 9克，整个分离、 浓缩工艺L-茶氨酸的收率为88. 0%。实施例4
(a)取100升L-茶氨酸酶转化液，L-茶氨酸的浓度为15.4克/升，选用0. 5m2的管式聚氨酯超滤膜在0. 45MPa，温度为40°C，pH为12. 0时进行过滤，膜孔径为0. 001-0. Olum，截留液体积为15L时，加IOL去离子水稀释后再过滤，重复3次后，得到超滤膜透过液120升， 超滤膜透过液中L-茶氨酸浓度为12. 6克/升；
(b)将超滤膜透过液122升，用孔径截留分子量为800的聚酰胺纳滤膜在压强为 1. 6MPa,温度为25°C，pH为11. O的条件下进行过滤，截留液体积约15L时，加15L去离子水稀释后再过滤，重复3次后，得到纳滤膜透过液150 L，纳滤膜透过液中L-茶氨酸的浓度为9.8克/升；
(c)将纳滤膜透过液150升，经膜材料为醋酸纤维素的反渗透膜在压强为20MPii，温度为^°C，pH为9. 5的条件下浓缩，最终得到浓度为94. 8克/升的L-茶氨酸浓缩液15升；
(d)将浓缩液真空浓缩、结晶得到纯度为99.7%的L-茶氨酸晶体1385. 8克，整个分离、 浓缩工艺L-茶氨酸的收率为90. 0%。实施例5
(a)取100升L-茶氨酸酶转化液，L-茶氨酸的浓度为15.4克/升，选用0. 5m2的管式聚砜酰胺超滤膜在0. 4MPa，温度为20°C，pH为10. O时进行过滤，膜孔径为0. 001-0. Olum, 截留液体积为15L时，加IOL蒸馏水稀释后再过滤，重复3次后，得到超滤膜透过液115升， 超滤膜透过液中L-茶氨酸浓度为13. O克/升；
(b)将超滤膜透过液122升，用孔径截留分子量为600的聚酰胺纳滤膜在压强为 1. 9MPa,温度为^°C，pH为9. 8的条件下进行过滤，截留液体积为15L时，加15L蒸馏水稀释后再过滤，重复3次后，得到纳滤膜透过液145 L，纳滤膜透过液中L-茶氨酸的浓度为 10. 1克/升;
(c)将纳滤膜透过液145升，经膜材料为芳香聚酰胺的反渗透膜在压强为15MPii，温度为25°C，pH为7. 5的条件下浓缩，最终得到浓度为105克/升的L-茶氨酸浓缩液13升；
(d)将浓缩液真空浓缩、结晶得到纯度为99.9%的L-茶氨酸晶体1360. 6克，整个分离、 浓缩工艺L-茶氨酸的收率为88. 4%。对比实验
732型阳离子交换树脂从酶转化液中分离、浓缩L-茶氨酸
取100升L-茶氨酸酶转化液，L-茶氨酸的浓度为15. 4克/升。用盐酸将酶转化液调 pH到2. 5 3. 5之间，加人絮凝剂后离心去掉微生物菌体、细胞碎片、杂蛋白等杂质，离心液用DlOl大孔吸附树脂除去色素及大分子物质后得到清澈液体；用732型强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂交换吸附L-茶氨酸，再用纯水将吸附后的离子交换树脂洗至中性，换用pH为9-11的氨水溶液洗脱，收集洗脱液；洗脱液经浓缩塔真空浓缩得到浓缩液，对浓缩液进行乙醇沉降，然后离心分离后得到离心清液；离心清液减压浓缩至干后，加人无水乙醇溶解，冷却，重结晶，干燥后得到白色L-茶氨酸晶体。L-茶氨酸纯度低于80%，收率一般在60%左右。
权利要求
1.利用集成膜技术从谷氨酰胺酶或谷氨酰转肽酶转化液中分离、浓缩L-茶氨酸的方法，其特征在于包括如下步骤(a)将酶转化液利用孔径为0.001-0. 01 μ m的超滤膜进行过滤，过滤后得到超滤膜透过液；(b)将超滤膜透过液用纳滤膜进行过滤，截留分子量为200-1000的物质，过滤后得到纳滤膜透过液；(c)将纳滤膜透过液通过反渗透膜进行浓缩提取，得到浓缩液；(d)将浓缩液真空浓缩，结晶得到L-茶氨酸晶体。
2.根据权利要求1所述的利用集成膜技术从谷氨酰胺酶或谷氨酰转肽酶转化液中分离、浓缩L-茶氨酸的方法，其特征在于步骤(a)中的操作压力为0. 15-0. 45MPa，操作温度为20-40°C、pH为8-12 ；步骤(b)中的操作压力为1. 5-2. OMpa，操作温度为20-35°C, pH为 8-11 ；步骤(c)中的操作压力为15-25Mpa、操作温度为25_35°C、pH为7-10。
3.根据权利要求1或2所述的利用集成膜技术从谷氨酰胺酶或谷氨酰转肽酶转化液中分离、浓缩L-茶氨酸的方法，其特征在于步骤(a)中酶转化液利用超滤膜进行过滤后，加水稀释过滤得到超滤膜透过液；步骤(b)中超滤膜透过液用纳滤膜进行过滤后，加水稀释过滤得到纳滤膜透过液。
4.根据权利要求3所述的利用集成膜技术从谷氨酰胺酶或谷氨酰转肽酶转化液中分离、浓缩L-茶氨酸的方法，其特征在于所述水选自纯化水、去离子水、蒸馏水中的一种或几种。
5.根据权利要求1或2所述的利用集成膜技术从谷氨酰胺酶或谷氨酰转肽酶转化液中分离、浓缩L-茶氨酸的方法，其特征在于所述超滤膜的材质选自陶瓷、聚碳酸酯、聚偏氟乙烯、聚砜、聚砜酰胺中的一种。
6.根据权利要求1或2所述的利用集成膜技术从谷氨酰胺酶或谷氨酰转肽酶转化液中分离、浓缩L-茶氨酸的方法，其特征在于所述纳滤膜的材质为聚酰胺。
7.根据权利要求1或2所述的利用集成膜技术从谷氨酰胺酶或谷氨酰转肽酶转化液中分离、浓缩L-茶氨酸的方法，其特征在于所述反渗透膜的材质为醋酸纤维素或芳香聚酰胺。
全文摘要
本发明涉及一种利用集成膜技术从谷氨酰胺酶或谷氨酰转肽酶的转化液中分离、浓缩L-茶氨酸的方法，包括如下步骤(a)将酶转化液利用孔径为0.001-0.01μｍ的超滤膜进行过滤，将酶转化液中的菌体、细胞碎片、大分子杂蛋白截留去掉，过滤后得到超滤膜透过液；(b)将超滤膜透过液用聚酰胺纳滤膜进行过滤，对超滤膜透过液进行脱盐、脱色和截留小分子杂蛋白，截留分子量为200-1000的物质，过滤后得到纳滤膜透过液；c)将纳滤膜透过液通过反渗透膜进行浓缩提取，得到浓缩液；(d)将浓缩液真空浓缩，结晶得到L-茶氨酸晶体。提取工艺全部采用膜技术分离工艺，操作简单且易实现自动化，收率高，产品纯度高，耗能少，污染物少。
文档编号C07C231/24GK102432495SQ20111034332
公开日2012年5月2日 申请日期2011年11月3日 优先权日2011年11月3日
发明者万红贵, 吕志祥, 徐大春, 殷志敏, 沈青红, 王汉领 申请人:江苏阿格罗生物科技有限公司