一种γ-谷氨酰转肽酶的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程技术领域，具体地说，是利用高密度发酵结合k谷氨酷胺及 MD的复配极大地提高了谷氨酷转肤酶转移酶的表达及可溶性表达，使GGT酶活提供了 3-5 倍，获得了一种丫-谷氨酷转肤酶（gamma-GGT酶）的高效制备技术，明显降低了酶法合成 k茶氨酸的生产成本。
【背景技术】
[0002]k茶氨酸（N-乙基-丫谷氨酷胺，theanine)是一种天然的氨基酸，是茶叶中的特 征氨基酸，也是茶叶中有效的呈味物质。心茶氨酸主要用于：（1)作为一种新兴的食品添 加剂，可用作为茶饮料的品质改良剂、改善食品风味的添加剂、功能食品的添加剂、"情绪食 品"的添加剂等；已在欧美、日本、中国台湾等国家、地区广泛使用。如日本已开发出添加茶 氨酸的巧克力、果冻、布下、口香糖、保健茶和各种清凉饮料。（2)作为医药中间体领域，茶氨 酸可W用作抗肿瘤、降血压、安神镇静、抗疲劳等药物中。此外k茶氨酸现已作为镇静剂中 的有效成分，对帕金森氏症、老年性痴呆、传导神经功能素乱等疾病起预防效果。
[0003]k茶氨酸的生产方法主要有茶叶提取法、化学合成法、微生物发酵酶转化法。（1) 茶叶提取法由于茶叶中茶氨酸的含量不高，从茶叶提取茶氨酸无法实际生产价值。所W植 物提取法实际上是从提取茶多酪后的残留液中用离子交换树脂法提取茶氨酸。缺点是生产 工序复杂、产品纯度低、产量小、价格高。（2)化学合成心茶氨酸需要高溫、高压及化学催 化剂等条件，反应条件要求比较高，副产物多，且产生的都是Dk型消旋体，还需要进行拆 分才能得到k型产品。因此会使成本提高W及质量难W控制，且易混杂有毒物质，产品不 宜用于食品行业应用，同时生产工艺复杂，且易造成环境污染。（3)微生物发酵酶转化法生 产的k茶氨酸都是L型的，且生产成本低，可大量生产，由于生物酶法合成具有高度的专一 性，所W在产品质量方面更接近天然的k茶氨酸，其发展前景非常广阔。此外酶转化法生 产k茶氨酸还具有纯度高、副产物少、纯化步骤少、生产能力强等优点，因此微生物发酵酶 转化法是目前国内外研究人员公认的最直接、最经济的k茶氨酸生产方法。
[0004] 利用微生物发酵酶转化法生产k茶氨酸的酶主要有谷氨酷胺酶和丫-谷氨酷转 肤酶（丫-GGT)，本实验是研究利用大肠杆菌发酵产丫-谷氨酷转肤酶，该大肠杆菌高产高 酶活的丫-谷氨酷转肤酶，能高效转化谷氨酷胺和乙胺为心茶氨酸；近些年来，尽管有研究 把大肠杆菌K-12来源的丫-ggt基因（全长序列或突变缺失序列）导入到大肠杆菌中表达， 通过采用不同的融合标签的载体或大小亚基的共表达，但重组谷氨酷转肤酶常常W没有活 性的包涵体或没有活性的酶原形式被表达出来。究其原因，主要是谷氨酷转肤酶复杂的翻 译后加工过程，造成表达和转运后的大小亚基不能正确折叠并且不能有效地相互作用，因 此不能形成天然的成熟酶。运样的事实使得高效过表达具有生物活性的谷氨酷转肤酶成为 一个难题。因而，寻求新的方法改进基因工程菌的高效表达W从根本上提高茶氨酸的合成 量显得尤为重要。
【发明内容】
阳〇化]本发明所要解决的是提供一种高密度发酵结合酶表达促进剂，用于高效表达可溶 性谷氨酷转肤酶方法，W便于酶转化合成茶氨酸。
[0006] 本发明提供的一种gamma-GGT酶的制备方法，该方法是：将谷氨酷转肤酶表达质 粒转化到大肠杆菌构建基因工程菌、对基因工程菌进行发酵、并利用IPTG或乳糖进行诱导 表达，在诱导表达结束前3小时，加入含k谷氨酷胺及MD的复配促进表达。
[0007] 进一步地，对工程菌的发酵采用高密度发酵方法：在M9培养基的基础上通过不断 补充含甘油的新鲜培养基，使发酵0D600达到10 W上后进行蛋白诱导表达。
[0008] 技术用于生产茶氨酸主要包括W下步骤：
[0009] 谷氨酷转肤酶高效可溶性表达及茶氨酸的生产，包括如下步骤：
[0010] (1)将谷氨酷转肤酶表达质粒转化到大肠杆菌化21 0E3)中；
[0011] (2)对工程菌进行高密度发酵；
[0012] (3)利用IPTG或乳糖进行诱导表达；
[0013] (4)诱导表达结束前3小时，加入含心谷氨酷胺（2克/升）及氧化型烟酷胺腺嚷 岭二核巧酸NAD+ (0. 5克/升）的复配；
[0014] 巧)3小时后收菌，经细胞破碎后进行gamma-GGT酶活测定。
[0015] 步骤（1)中，所选择的谷氨酷胺转肤酶表达质粒为Pgex-4t-l-ggt，该质粒来源于 GE公司，带有氨节青霉素抗性。
[0016] 步骤（3)中，诱导表达的方法为：将步骤（2)得到的工程菌接种于含氨节青霉素抗 性的M9液体培养基，37°C，220巧m/min振荡培养12h;将活化好的菌按1 :50比例接入含有 100mL氨节青霉素抗性的M9液体培养基中，37°C振荡培养至适当的0D600值后，按5%的接 种量加入5升发酵罐；不断补充含甘油的新鲜培养基进行高密度发酵，当发酵液的0D600达 到10W上后，加入适量的IPTG或乳糖，20°C下培养。
[0017] 步骤（4)中，在0D600达到30后，加入含k谷氨酷胺及NAD的复配。
[0018] 步骤巧），3小时后离屯、收集菌体，经过细胞破碎后，谷氨酷转肤酶表达量测定方 法为WesternBlot,其酶活测定按照上海生物工程有限公司的GGT试剂盒方法进行。
[0019] 所采用的酶促合成茶氨酸的基因工程菌化21/C4是经过步骤（4)优化的具有极高 谷氨酷转肤酶酶活，且其发酶液直接作为谷氨酷转肤酶的来源。该方法的要点在于，经高密 度培养后，菌体浓度达到0D600，但由于GGT蛋白本身的溶解性较差，诱导的GGT酶主要W包 涵体形式存在，因此酶活性仍然不高，通过加入含k谷氨酷胺及MD的复配后，由于k谷 氨酷胺为GGT底物，利用诱导契合原理极大地促进了GGT的可溶性表达，且NAD能够通过快 速提供合成蛋白的能量，因此通过两者的有机的结合，使GGT酶活提供了 3-5倍。
[0020] 有益效果：本发明应用工程菌高密度发酵结合酶活表达促进剂，通过高效表达酶 法生产茶氨酸，使用本发明方法可W明显的提高酶的表达量及酶活，促进底物的转化，进而 提高茶氨酸的生产量。同时，缩短了工艺周期（酶活性好），降低了生产成本（降低酶促反 应中酶耗成本），易操作，易放大，稳定性好，适于大规模工业化生产，为生物酶法生产其