专利名称：一种酶解金枪鱼碎肉蛋白制备降压肽的方法
技术领域：
本发明涉及功能性食品加工技术或生物制药技术，具体涉及一种酶解金枪鱼碎肉蛋白制备降压肽的方法。
背景技术：
血管紧张素转换酶(ACE)是一种膜结合糖蛋白，分子量为150000，当人体循环或者局部组织中ACE活性过高，会促使血管紧张素I (十肽，由肾素转化而来)的肽链C末端的组氨酸和亮氨酸残基水解形成具有增压作用的血管紧张素II (八肽)，同时促进具有促血管舒张作用的缓激肽P物质的水解，导致血压升高。因此，寻找合适物质，抑制体内ACE的活性，即可达到降低血压的目的。目前，血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)是一类发展迅速的抗高血压药物，如含巯基(-SH)或硫基(-SR)类的卡托普利(Captopril)和阿拉普利(Alacepril);含羧基(-C00H)类的依那普利(Enalapril)、赖诺普利(Lisinopril)、培跺·普利(Perindopril)、雷米普利(Ramipril)和喹那普利(Quinapril)等，以及含次膦酸基(-P00-)类的福辛普利(Fosinopril)等。此类化学合成药物在临床应用过程中常引起患者咳嗽、味觉异常、粒细胞减少、皮疹、发热、等不良反应，给患者带来更大的不适感。与化学合成的ACEI相比较，通过酶解食源性蛋白质获得的ACE抑制活性肽(ACEP)具有显著优点，主要体现在(I)安全性高，无毒副作用=ACEP均以食源性蛋白为原料，采用食用级蛋白酶水解制备获得，多种ACEP动物实验及临床检验结果，均为观察到毒副作用；
(2)原料来源广，制备条件温和，易于产业化与化学降解相比较，酶解反应条件温和，生产过程中不会破坏氨基酸，形成Lys-Ala等有毒物质，对环境影响较小。同时，生活中存在大量食源性蛋白，特别是水产加工过程中产生的副产物蛋白，成本极低，且减少环境污染。(3)降压效果专一，易于消化吸收ACEP只对高血压患者具有降压作用，而对正常患者无影响；同时ACEP分子量低，极易吸收。因此，选择合适的蛋白酶在体外降解蛋白资源，研究和开发出具有降血压作用的活性肽食品或药物，成为研究的热点。有研究表明，人们已经成功地从牡蛎蛋白、贻贝蛋白、河蛘蛋白、鱼皮蛋白等获得了 ACEP。如徐怀德等(徐怀德，殷金莲，冯丽丹等的《甲鱼蛋白酶解产物体外ACE抑制和抗氧化活性研究》[J]。中国食品学报，2008,8(2) 58-64)利用木瓜蛋白酶水解甲鱼蛋白获得具有ACE抑制作用的酶解物。戴志远等(戴志远，朱凤仙，张燕平等的《河蛘酶解降血压肽的初步分离及性质研究》[J]。中国食品学报，2009,9(4) 76-81)利用酶解和S^hadexG-50柱层析，从河蛘酶解物中得到2个组分MPPl和MPP2，其分子质量分别为14 125 Da和I 271 Da,其对ACE抑制作用的IC5tl分别为O. 88mg/mL和O. 32mg/mL。于婭等(于婭，杨瑞金，王璋的《牡蛎短肽的制备及ACE抑制活性》[J]。无锡轻工大学学报，2004，23 (2) :49 53)以无壳牡蛎为原料，测定一定分子质量范围内的短肽具有较好的ACE抑制率，其中质量浓度为O. 4mg/mL的牡蛎功能短肽ACE抑制率为51.4%。金枪鱼是世界远洋渔业的重要作业鱼种之一，据联合国粮农组织统计，世界金枪鱼年产量超过600万吨，占公海渔业总产量70%以上。在金枪鱼加工过程中产生约占总重量50% 70%的下脚料，这些下脚料主要是金枪鱼内脏，鳃，碎肉，鱼头和鱼皮等。研究发现金枪鱼碎肉中粗蛋白含量也比较高，是良好的蛋白质来源。然而，我国金枪鱼下脚料的加工应用情况不尽如人意，90%以上仍然作为饲料原料或初级饲料利用，造成了金枪鱼资源的极大浪费，也给生态环境带来了较大压力。因此综合、高效利用金枪鱼下脚料具有重要的意义。我国对于金枪鱼碎肉ACEP的研究尚处于空白阶段，对于实际可行的酶解工艺及分离纯化过程目前未见报道。而工业化制备金枪鱼碎肉ACE抑制肽既要考虑到降血压活性，还要考虑产品的得率，生产成本等方面。而目前已经报道的甲鱼、河蛘、贻贝等为原料制备ACEP的方法并不适用于以金枪鱼碎肉为原料制备降压肽
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用碱性蛋白酶(Alcalase)种酶解金枪鱼碎肉蛋白制备降压肽的方法，该方法条件温和、操作简单、原料来源丰富、价格低廉，制备的降血压肽活性较强，可用于高血压的治疗。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种酶解金枪鱼碎肉蛋白制备降压肽的方法，其特征在于包括以下步骤I)以金枪鱼碎肉作为原料，与缓冲液按照Ig 3 5ml的重量体积比混合、匀浆，然后调节PH值至9. 5 10，得混合液；2)将混合液温度升至55 60°C预热，以金枪鱼碎肉质量的I. 0% I. 5%加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解温度为55 60°C，酶解时间4-6h ；3)将步骤2)所得的酶解产物经灭酶处理得酶解液，将酶解液依次经超滤、脱盐、冷冻干燥和层析，得到降血压肽。作为改进，所述步骤I)中的金枪鱼为大目金枪鱼、黄鳍金枪鱼或鲣鱼。优选，所述骤I)中的缓冲液是pH为9. 5 10. 5的甘氨酸-NaOH缓冲液。作为改进，所述步骤2)中的预热是在搅拌状态下进行，预热时间为15 20分钟。再改进，所述步骤2)中的碱性蛋白酶的酶活力彡I. 9X104U/g。进一步改进，所述步骤3)中的灭酶处理为将步骤2)所得的酶解产物升温至95 100°C，并于此温度保持10 15min，再冷却至O 15°C以终止酶反应，然后离心，取上清液作为酶解液。再进一步改进，所述步骤3)的超滤、脱盐、冷冻干燥和层析的具体过程为将所述酶解液于O. I O. 15MPa的工作压力和20 30°C的工作温度下采用超滤膜进行超滤处理，得超滤酶解液；将得到的超滤酶解液制成浓度为5mg/ml 15mg/ml,加入到DlOl大孔树脂层析柱进行脱盐，然后用70%乙醇进行解析，除去乙醇，浓缩液进行冷冻干燥，得超滤脱盐酶解物干粉。最后将超滤脱盐酶解物干粉溶解后上S印hadex G_15或G_25凝胶层析柱，收集所得的高活性的小分子肽组分经冷冻干燥，得降血压肽。最后，所述超滤膜的截留分子量为IOK道尔顿。与现有技术相比，本发明的优点在于本发明以金枪鱼碎肉为原料，采用生物酶法进行制备，原料来源丰富，可以从金枪鱼加工下脚料中获得，成本低；且易通过对酶解过程的监控，使ACE抑制肽最大程度地释放出来，提高原料的利用率，与现有的制备方法相比较，本发明制备工艺科学合理，操作简单，同时融合了酶解、超滤、大孔树脂脱盐以及凝胶层析四种手段，方法更加完善，而且得到的降血压肽具有较高的活性；与化学合成的血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂相比较，本发明制得的降血压肽具有安全无毒副作用、降压效果专一和易于消化吸收等优点，可以作为药品、保健食品、食品、食品添加剂等，具有较强的工业实施性。本发明同时也有效提高了金枪鱼的附加值，对金枪鱼产业的可持续发展具有重要的意义。
图I是本发明实施例降血压肽S印hadexG_15凝胶层析谱图，其中横轴为接收管数，纵向轴是吸光度值(A220nm)，曲线为洗脱曲线；图2是本发明实施例用ZORBAX 300SB-C18 HPLC柱进行层析时所获得的分离峰 图，其中横轴为洗脱时间t(min)，纵向轴是吸光度值(mAU)，曲线为洗脱曲线。
具体实施例方式以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。一种酶解金枪鱼碎肉蛋白制备降压肽的方法，制备流程如下金枪鱼碎肉一组织破碎一酶解一超滤一大孔树脂脱盐一凝胶渗透色谱纯化一冷冻干燥一降血压肽。I、称取金枪鱼碎肉100g，加入pH为10的甘氨酸-NaOH缓冲液500mL，于组织捣碎机内均质5min，用lmol/L HCl将该混和物调pH值为9. 5，得混和液。2、将混合液温度升至60°C搅拌预热，并于搅拌状态下保温20min ;然后加入I. 5g碱性蛋白酶(Alcalase，酶活力彡1.9X104U/g)启动酶解反应，酶解温度为55 60°C，连续搅拌，保持反应体系的温度及PH恒定(温度为55 60°C，pH为9. 5)，酶解时间为5h。得酶解产物；3、将步骤2)所得的酶解产物先经灭酶处理，得酶解液，所述酶解液依次经超滤、大孔树脂脱盐、凝胶柱层析和和冷冻干燥，得降血压肽，具体过程为①灭酶将酶解产物于95°C水浴中灭酶lOmin，然后冷却至10°C ;从而终止酶反应，接着在5000r/min下离心15min。取上清液作为酶解液。②超滤将酶解液先用O. 45μπι的中空纤维膜进行微滤，微滤后的酶解液在O. 13Mpa的工作压力和20°C的工作温度下，通过截留分子量为IOKDa超滤膜进行超滤，除去大分子蛋白质及多糖等，所收集的透过液为超滤酶解液。③DlOl大孔树脂脱盐将超滤酶解液制成质量浓度为10mg/ml溶液，加入到DlOl大孔树脂层析柱，以水洗除酶解液中的盐，然后用70%乙醇以1.5BV/h的流速将酶解物从DlOl大孔树脂上解吸下来，低温((40°C )真空浓缩除去乙醇，浓缩液进行冷冻干燥(-50°C,48小时)，得超滤脱盐酶解物干粉。④凝胶柱层析超滤脱盐酶解物干粉用去离子水配制成浓度为10mg/ml溶液，将5ml的该溶液上Sephadex G-15凝胶层析柱，以0. 5ml/min的流速用超纯水进行洗脱,收集(IOmin —管,每管5mL)得到五个组分。其中，收集的第四个组分具有最高的ACE抑制活性(见图I);将其收集、冷冻干燥(_50°C，48小时)；得降血压肽805mg。得到的降血压肽色泽微黄，利用体外检测ACE抑制活性的高效液相色谱法，测得其IC5tl为O. 085mg/mL。最后进行纯度检测用ZORBAX 300SB-C18HPLC进行检测(高效液相色谱条件为流动相40 %乙腈-水(O. 05% TFA)，流速O. 8ml/min,上样量为10 μ 1，样品浓度为O. 5mg/ml)，仅发现I个主峰(见图2)。
尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.一种酶解金枪鱼碎肉蛋白制备降压肽的方法，其特征在于包括以下步骤 1)以金枪鱼碎肉作为原料，与缓冲液按照Ig 3 5ml的重量体积比混合、匀浆，然后调节PH值至9. 5 10，得混合液； 2)将混合液温度升至55 60°C预热，以金枪鱼碎肉质量的I.0% I. 5%加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解温度为55 60°C，酶解时间4-6h ； 3)将步骤2)所得的酶解产物经灭酶处理得酶解液，将酶解液依次经超滤、脱盐、冷冻干燥和层析，得到降血压肽。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤I)中的金枪鱼为大目金枪鱼、黄鳍金枪鱼或鲣鱼。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述骤I)中的缓冲液是PH为9.5 10. 5的甘氨酸-NaOH缓冲液。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤2)中的预热是在搅拌状态下进行，预热时间为15 20分钟。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤2)中的碱性蛋白酶的酶活力彡 I. 9X104U/g。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤3)中的灭酶处理为将步骤2)所得的酶解产物升温至95 100°C，并于此温度保持10 15min，再冷却至O 15°C以终止酶反应，然后离心，取上清液作为酶解液。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤3)的超滤的具体过程为 将所述酶解液于O. I O. 15MPa的工作压力和20 30°C的工作温度下采用超滤膜进行超滤处理，得超滤酶解液。
8.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤3)的脱盐、冷冻干燥的具体过程为 将得到的超滤酶解液制成浓度为5mg/ml 15mg/ml，加入到DlOl大孔树脂层析柱进行脱盐，然后用70%乙醇进行解析，除去乙醇，浓缩液进行冷冻干燥，得超滤脱盐酶解物干粉。
9.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤3)的层析的具体过程为 将超滤脱盐酶解物干粉溶解后上S^hadex G-15或G-25凝胶层析柱，收集所得的高活性的小分子肽组分经冷冻干燥，得降血压肽。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述超滤膜的截留分子量为IOK道尔顿。
全文摘要
本发明公开了一种酶解金枪鱼碎肉蛋白制备降压肽的方法，包括以下步骤1)以金枪鱼碎肉作为原料，将原料与缓冲液按照1g∶3～5ml的重量体积比混合、匀浆，然后调节pH值至9.5～10，得混合液；2)将混合液温度升至55～60℃预热，按照原料的1.0％～1.5％加入碱性蛋白酶(Alcalase)，酶解温度为55～60℃，酶解时间4-6h；3)将所得的酶解产物先经灭酶处理，得酶解液，再将酶解液依次经超滤、脱盐、冷冻干燥和层析，得降血压肽。本发明具有原料来源丰富、价格便宜、制备工艺简单，制得的降血压肽活性较强的特点，与化学合成的血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂相比较，通过酶解金枪鱼碎肉所得的ACE抑制活性肽(ACEP)具有安全无毒、降压效果专一和易于消化吸收等优点。
文档编号C07K1/16GK102808010SQ20111014665
公开日2012年12月5日 申请日期2011年5月30日 优先权日2011年5月30日
发明者王斌, 罗红宇, 马佳卉, 栗丽 申请人:浙江海洋学院