它 有价值的产品提供了新的思路，另外，本发明使用了蛋白合成的能量促进剂，因此，也适用 于其它基因在工程菌中的快速、高效表达。
【具体实施方式】
[0021] 根据下述实施例，可W更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0022] 1、利用摇床进行谷氨酷转肤酶的诱导表达：
[0023] 将含有表达质粒的大肠杆菌克隆菌冻存液按1:100的比例转接入含有4ml与表达 质粒所带抗性对应的LB液体培养基的试管中；220rpm，37°C振荡培养1化后转接到80mlM9 液体培养基中，当0D600达到0. 7后将摇床溫度降低到20°C并加入IPTG或乳糖进行振荡培 养，当0D600达到2. 5W后加入k谷氨酷胺及NAD的复配，3小时后离屯、收菌，经超声破壁 后进行酶活测定，结果表明，如果利用W上方法进行酶的诱导，GGT酶的活性达到24000U/ 升，同样条件培养而不加k谷氨酷胺及NAD的复配的GGT酶活仅为6500U/升，两者的酶活 差距明显。
[0024] 2、谷氨酷转肤酶在5升发酵罐体系中的表达： 阳0巧]将含有表达质粒的大肠杆菌克隆菌冻存液按1:100的比例转接入含有5ml与 表达质粒所带抗性对应的LB液体培养基的试管中；220rpm，37°C振荡培养1化后转接到 100mlM9液体培养基中，经1化后转接到含3升M9培养基的5升发酵罐中，当0D600达到 0. 7后将发酵罐溫度降低到20°C并加入IPTG或乳糖进行发酵培养，0D600达到5后，加入 k谷氨酷胺及NAD的复配，3小时后离屯、收菌，经超声破壁后进行酶活测定，结果表明，如果 利用W上方法进行酶的诱导，GGT酶的活性达到55000U/升，同样条件培养而不加k谷氨 酷胺及NAD的复配的GGT酶活仅为12000U/升，两者的酶活差距明显。
[00%] 3、谷氨酷转肤酶在5升发酵罐体系中经高密度培养后的表达
[0027] 将含有表达质粒的大肠杆菌克隆菌冻存液按1:100的比例转接入含有5ml与 表达质粒所带抗性对应的LB液体培养基的试管中；220rpm，37°C振荡培养1化后转接到 100mlM9液体培养基中，经1化后转接到含3升M9培养基的5升发酵罐中，当0D600达到3 后加入甘油培养基，当0D600达到10后将发酵罐溫度降低到20°C并加入IPTG或乳糖进行 发酵培养，0D600达到30后，加入k谷氨酷胺及NAD的复配，3小时后离屯、收菌，经超声破 壁后进行酶活测定，结果表明（表1)，如果利用W上方法进行酶的诱导，GGT酶的活性达到 350000U/升，同样条件培养而不加k谷氨酷胺及NAD的复配的GGT酶活仅为70000U/升， 两者的酶活差距明显。
[0028] 表1k谷氨酷胺及NAD的复配使用后表达的谷氨酷转肤酶的酶活性结果比较
[0029]EnzymeActivity(U)
[0031] 4、利用高密度培养结合加入k谷氨酷胺及NAD的复配诱导的GGT高效合成茶氨 酸：
[0032] 将0. 2mol的谷氨酷胺溶于500ml纯水中；将3mol的乙胺盐酸溶于上述反应液 中，调节反应液的抑至10. 0 ;测定高效表达后化21菌发酵液的谷氨酷转肤酶酶活，取含有 3000U的发酵液加入到上述反应液中；用纯乙胺调节pH至10. 0 ;将此反应液至37°C的摇床 中，150rpm/min条件下进行酶促反应；在反应进行的过程中，每隔半小时检测反应液的抑 情况，并用纯乙胺调节抑至10. 0 ;在反应的化，2h，地，6h，化，Ilh分别取200y1反应液样 品；将取于不同时间的反应液样品至于沸水中煮样5min;将煮过的样品125(H)巧m/min的条 件下离屯、5min;取0. 5y1各阶段的样品在滤纸上点样，进行纸层析检测；纸层析结束后对 结果进行巧S酬显色反应。最终，将高效表达后的化21完整细胞作为谷氨酷转肤酶酶源， 在保持乙胺与茶氨酸摩尔比始终大于15比1条件下，0. 2M的谷氨酷胺被转化为0. 17M的茶 氨酸，反应转化率达到85%。
【主权项】
1. 一种Y-谷氨酰转肽酶的制备方法，包括将谷氨酰转肽酶表达质粒转化到大肠杆菌 构建基因工程菌、对基因工程菌进行发酵、并利用IPTG或乳糖进行诱导表达的步骤，其特 征在于：诱导表达结束前3小时，加入含L-谷氨酰胺及NAD的复配促进表达。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在对基因工程菌进行发酵时，采用高密度 发酵方法。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述高密度发酵，是在M9培养基的基础上 通过不断补充含甘油的新鲜培养基，使发酵0D600达到10以上后进行蛋白诱导表达。4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，对基因工程菌进行发酵的具体操作 是：将基因工程菌接种于含氨苄青霉素抗性的M9液体培养基，37°C，220rpm/min振荡培养 12h;将活化好的菌按1 :50比例接入含有100mL氨苄青霉素抗性的M9液体培养基中，37°C 振荡培养至适当的OD600值后，按5%的接种量加入5升发酵罐；不断补充含甘油的新鲜培 养基进行高密度发酵，当发酵液的OD600达到10以上后，加入适量的IPTG或乳糖，20°C下 培养。5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在0D600达到30后，加入含L-谷氨 酰胺及NAD的复配。
【专利摘要】本发明提供了一种γ-谷氨酰转肽酶的制备方法。该方法将谷氨酰转肽酶表达质粒转化到大肠杆菌构建基因工程菌、对基因工程菌进行发酵、并利用IPTG或乳糖进行诱导表达的步骤，诱导表达结束前3小时，加入含L-谷氨酰胺及NAD的复配促进表达。本发明通过高密度培养含谷氨酰转肽酶的大肠杆菌工程菌，结合蛋白高效表达激活剂，表达后最佳酶活达到350000U/L。使用本发明方法可以明显的提高酶的表达量及酶活，促进底物谷氨酰胺转化为L-茶氨酸的效率，进而提高茶氨酸的生产量。同时，缩短了工艺周期，降低了生产成本，易操作，易放大，稳定性好，适于大规模工业化生产。
【IPC分类】C12R1/19, C12N9/10
【公开号】CN105219747
【申请号】CN201510765816
【发明人】殷志敏, 朱岩岩, 黄正才
【申请人】南京师范大学
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年11月11日