抗ceacam1抗体以及使用该抗体的方法

专利名称：抗ceacam1抗体以及使用该抗体的方法
技术领域：
本发明在其一些实施方式中涉及抗CEACAM1抗体、生产该抗体的杂交瘤细胞，和使用该抗体的方法。
背景技术：
跨膜蛋白CEACAM1 [也称为胆汁糖蛋白(BGP)、⑶66a和C-CAM1]是癌胚抗原家族 (CEA)的成员，也属于免疫球蛋白超家族。CEACAM1与包括CD66a、CD66c和CD66e蛋白在内的其它已知CD66蛋白相互作用。它表达于从上皮细胞到造血来源的那些细胞(例如，免疫细胞)的各种各样的细胞上。许多不同功能归因于CEACAM1蛋白。已证明，CEACAM1蛋白对结肠癌、前列腺癌以及其它类型的癌症表现出抗增殖特性。另外的数据证实CEACAM1主要参与血管生成和转移。CEACAM1也在先天性和适应性免疫应答的调节中发挥作用。例如，CEACAM1被证明是包含在人肠上皮内的活化T细胞的抑制性受体[参见，W099/52552和Morales等人， J. Immunol. 163 (1999)，1363-1370]。另外的报道已表明，CEACAM1通过与mAb交联的TCR或通过淋病奈瑟氏菌Opa蛋白抑制T细胞活化和增殖。黑素瘤是色素产生细胞(黑素细胞)的恶性肿瘤，全球皮肤癌相关的发病率的 75%由黑素瘤引起，其主要是由广泛转移引起。转移性黑素瘤(MM)对大多数抗癌方案的反应都很微弱，MM患者的平均总存活时间为8. 5个月。正常黑素细胞很少表达CEACAM1，而在黑素瘤细胞上经常发现CEACAM1。原发性皮肤黑色素瘤病变中的CEACAM1表达强烈地预示着不良预后的转移性疾病的发展。而且观察到，来源于一些转移性黑素瘤患者的NK细胞上的CEACAM1表达相比健康供体有所增大。W02007/063424和美国专利申请20070110668公开了调节免疫系统的方法，特别是调节特异性免疫应答，包括调节淋巴细胞活性的方法。这些方法包括CEACAM1蛋白功能的正向调节和负向调节两者。美国专利申请20070071758公开了治疗和诊断癌症的方法和组合物。具体地，美国专利申请20070071758教导了用于通过例如使用对CEACAM1具有特异性的免疫球蛋白负向调节CEACAM1蛋白的活性，增强肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)疗法对治疗癌症的功效的方法和组合物。美国专利申请20080108140公开了在治疗自身免疫性疾病和需要组织移植的疾病的过程中调节特异性免疫应答从而创建保护性免疫的方法。特别地，美国专利申请 20080108140涉及通过增加靶组织中CEACAM1蛋白的功能浓度而以靶向方式(靶定方式， targeted fashion)抑制免疫应答的方法。美国专利申请20040047858公开了能够经由CEACAM1调节T细胞活性的特异性抗体(即，34B1J6H7和5F4)，及其在诸如治疗免疫应答相关性疾病(例如，移植物抗宿主病、 自身免疫性疾病、癌症等)中的用途。美国专利申请20020028203、20050169922和20080102071公开了结合T细胞抑制性受体分子和调节(即，增强或抑制)T细胞活性(例如，细胞毒性和增殖)的组合物，如胆汁糖蛋白结合剂，以及使用此种组合物例如治疗疾病(例如，自身免疫性疾病、免疫缺陷、 癌症等)的方法。其它相关技术5F4 mAb-Regulation of human intestinal intraepithelial lymphocyte cytolytic function by biliary glycoprotein (CD66a) [Morales VM 等人，J Immunol. (1999)163(3) :1363-70].。GM8G5 和 29H2-都可从 Abeam Inc. abeam, com 门户网站购得。

发明内容
根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了以ATCC登录号PTA-9974保藏的杂交瘤细胞。根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了分离的抗体或抗体片段，其包含具有从杂交瘤细胞生产的抗体的CDR序列和方向(orientation)的抗原识别结构域。根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了免疫调节的方法，该方法包括使表达CEACAM1的淋巴细胞与该抗体或抗体片段接触。根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了抑制表达CEACAM1的肿瘤细胞迁移或增殖的方法，该方法包括使表达CEACAM1的肿瘤细胞与该抗体或抗体片段接触，从而抑制表达CEACAM1的肿瘤细胞迁移或增殖。根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了诊断需要其的受验者中的癌症的方法，该方法包括使源自受验者的生物样品与该抗体或抗体片段接触，其中，超出预定阈值的复合物形成指示该受验者患有癌症。根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了治疗癌症的方法，该方法包括向需要其的受验者给予治疗有效量的该抗体或抗体片段，从而治疗受验者的癌症。根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了抑制CEACAM1同型或异型的蛋白质-蛋白质相互作用的方法，该方法包括使表达CEACAM1的淋巴细胞与该抗体或抗体片段接触，从而抑制CEACAM1同型或异型的蛋白质-蛋白质相互作用。根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了包含该抗体或抗体片段作为活性成分的药物组合物。根据本发明的一些实施方式，该分离的抗体或抗体片段附接(attach to)在细胞毒性部分(moiety)上。根据本发明的一些实施方式，该细胞毒性部分包含细胞毒素、趋化因子、化疗药 (化疗，chemotherapy)、促凋亡剂(促凋亡药，pro-apoptotic)、干扰素、放射性部分、或它们的组合。根据本发明的一些实施方式，该分离的抗体或抗体片段附接在可鉴定部分上。根据本发明的一些实施方式，该癌症细胞的特征是与未感染细胞相比CEACAM1过表达。根据本发明的一些实施方式，治疗癌症的方法进一步包括向受验者给予淋巴细胞。
根据本发明的一些实施方式，该淋巴细胞包含T细胞或NK细胞。根据本发明的一些实施方式，该表达CEACAM1的淋巴细胞是肿瘤浸润淋巴细胞或 NK细胞。根据本发明的一些实施方式，该表达CEACAM1的淋巴细胞是细胞毒性T细胞。根据本发明的一些实施方式，该肿瘤细胞包含黑素瘤肿瘤细胞。根据本发明的一些实施方式，该癌症是黑素瘤。除非另有限定，否则本文使用的所有技术和/或科学术语的含义都与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同。虽然下面描述了示例性方法和/或材料，但本发明实施方式的实施或试验中可使用与本文所描述的那些相似或者等效的方法和材料。如有冲突，以专利说明书为准，包括定义。另外，材料、方法和实施例仅为了说明，而未必是限制。


本文仅参考附图通过实施例说明本发明的一些实施方式。关于下面详细讨论的附图，要强调的是，所示细节仅为了举例和示意性地讨论本发明的实施方式的目的。就此而言，参考附图所作的描述将使本领域普通技术人员明了本发明的实施方式如何实施。在附图中图1A-1B描绘了 MRGl mAb的特异性。使用不同的抗人CEACAM抗体MRG1 mAb (图 1A)和 Kat4c mAb (图 IB)，对用 CEACAM1 (绿色)、CEACAM5 (红色)、CEACAM6 (紫色)、 CEACAM8 (蓝色)或空白对照(mock)(黑色)稳定转染的721. 221亲代B细胞进行FACS分析。图 2 描绘了抗 CEACAM1 mAb MRGl 对 CEACAM1 嗜同性相互作用(homophilic interaction)的剂量依赖性抑制。将各种浓度的抗CEACAM1 mAb添加到BW/CEACAM1 (效应细胞)或221/CEACAM1 (靶细胞)中。在冰上温育1小时后，加入易位细胞(倒易细胞， reciprocal cell) (221/CEACAM1 或 BW/CEACAM1)并通过 ELISA 法测量小鼠 IL-2 的分泌。 100%被定义为在不存在任何抗体的情况下的活性。示出了四个实验中的一个代表实验的结果，每个实验重复三次。图3描绘了 CEACAM1抑制功能的消除。将MRGl mAb与靶细胞(灰色表示)或与效应细胞(白色表示)预温育。在未添加mAb的情况下温育的细胞用黑色表示。所指示的黑素瘤株(5^mel、62^iel或09mel)用作靶细胞。TIL014细胞用作效应细胞，E T之比为10 1。在冰上温育1小时后，加入易位细胞并在37°C下共温育5小时。将靶细胞用绿色荧光染料(CFSE)预先标记，并通过流式细胞术中的碘化丙啶(PI)共染色测定特异性溶解(specific lysis)。扣除自然死亡(自主死亡、自发死亡，spontaneous death)。该分析重复三次。图4描绘了 MRGl mAb对黑素瘤侵袭的阻断。将黑素瘤细胞(OSmel或09mel)在不存在或存在lyg/ml MRGl mAb的情况下预温育，然后通过基质胶侵袭试验测试。使侵袭进行M小时，利用标准化XTT量化侵袭细胞的量。图5描述了 MRGl mAb对黑素瘤细胞净增殖的阻断。将526mel黑素瘤细胞与指示剂量(0. 5 μ g、1 μ g或3 μ g)的MRGl mAb 一起温育，并在处理后2天或5天监测增殖。图6A-6B描绘了全身注射MRGl相比于PBS对SCID小鼠体内人肿瘤生长的抑制。实验按两种方案如下进行图6A 抗体注射(0. 5mg/小鼠，腹膜内注射)和癌症细胞接种 (皮下接种5，000, 000个细胞)同时进行；图6B 通过注射MRGl抗体(如上指示的)治疗在SCID小鼠中产生的肿瘤(肿瘤体积为75mm3)。图7描绘了相比于单独静脉给予TIL，MRGl与静脉给予人反应性TIL联合对肿瘤生长的抑制功效增强。图8描绘了 MRGl mAb的作用优于前面描述的抗CEACAM1单克隆抗体以及市售的靶向人CEACAM1的家兔多克隆抗体(DAKO，Glostrup Denmark)，如通过功能阻断试验测定的。测试了各种抗CEACAM1抗体对CEACAM1活性的阻断，如由mIL_2分泌所报道的。100% 被定义为在不存在任何抗体的情况下的活性。示出了三个实验中的一个代表实验的结果，
每个实验重复三次。
具体实施例方式本发明在其一些实施方式中涉及抗CEACAM1单克隆抗体、和生产该抗体的杂交瘤细胞，以及使用该抗体进行免疫调节和癌症治疗的方法。在详细解释本发明的至少一个实施方式之前，应理解本发明的应用不必局限于以下描述中所陈述或通过实施例所列举的细节。本发明能够有其他实施方式，或能够以多种方式实施或实现。本发明人经过艰苦的实验和筛选生产出对CEACAM1具有选择性的单克隆抗体。这种抗体已被证明优于其它抗CEACAM1单克隆抗体，如通过功能阻断试验所表明的。如本文下面说明的，根据本教导生产的MRGl抗体对CEACAM1具有选择性，而且不与CEACAM家族其它成员(S卩，CEACAM5、6和8，参见实施例2)交叉反应。该抗体抑制CEACAM1 嗜同性相互作用，如通过将免疫效应细胞和靶黑素瘤细胞共同温育，分析IL-2分泌和细胞溶解所确定的(参见实施例幻。另外，该抗体被证明对抑制黑素瘤细胞侵袭和增殖有效。 最后，该抗体单独，或联合反应性淋巴细胞的体内给予被证明对抑制黑素瘤肿瘤生长有效。 总而言之，本教导内容揭示了，MRGl抗体、片段和衍生物可以用作免疫调节和癌症治疗的有效工具。因而，根据本发明的一个方面，提供了以ATCC登录号PTA-9974保藏的杂交瘤细胞。根据本发明的又一方面，提供了分离的抗体或抗体片段，其包含具有由上述杂交瘤细胞生产的抗体的CDR节段(segments)和方向(orientation)的抗原识别结构域。本教导内容的抗体能够以10_6、10_7、10_8、10_9M的最低亲和力结合CEACAM1。如本文使用的术语“CEACAM1”是指CEACAM1基因的蛋白产物，例如， NP_001020083. 1、NP_001703. 2。如本发明中使用的术语“抗体”包括完整分子以及其功能片段，如能够结合到巨噬细胞上的Fab、F(ab' )2、和Fv。根据示例性实施方式，该抗体是单克隆抗体，如本文称作为MRGl的抗体。功能性抗体片段定义如下(l)Fab，该片段含有抗体分子的单价抗原结合片段，可通过用木瓜蛋白酶消化完整抗体(whole antibody)从而产生完整的轻链和一条重链的一部分而制得；O)Fab'，该抗体分子片段可通过用胃蛋白酶处理完整抗体，接着进行还原从而产生完整的轻链和一条重链的一部分而获得；每个抗体分子均获得两个Fab'片段；C3)F(ab' )2，该抗体片段可通过用胃蛋白酶处理完整抗体，随后不进行还原而获得； F(ab' ) 2为通过两个二硫键保持在一起的两个Fab'片段的二聚体；(4) Fv，定义为含有表示为两条链的轻链可变区和重链可变区的基因工程片段；和( 单链抗体(“SCA”)，该单链抗体为基因工程分子，其含有由合适多肽接头连接成基因融合单链分子的轻链可变区和重链可变区。如上所指出的，本发明抗体的互补决定区(OTR)方向与通过具有上述保藏细节的杂交瘤细胞生产的抗体的相同。就是说，⑶R1、⑶R2、⑶R3以相同的方向布置在Vh和八链上。根据本发明的抗体片段可通过该抗体的蛋白水解，或通过大肠杆菌(E. coli)或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞培养物或其它蛋白表达系统)中编码该片段的DNA 表达来制备。抗体片段可以通过用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶经常规方法消化完整抗体获得。例如，抗体片段可通过用胃蛋白酶酶切抗体从而提供表示F(ab' )2的5S片段而制得。这个片段可利用硫醇还原剂和可选地利用二硫连键断裂所形成的巯基的封闭基团进行进一步的切割，从而产生3. 5S Fab'单价片段。可替换地，利用胃蛋白酶酶切直接产生两个单价Fab'片段和Fc片段。这些方法描述在例如Goldenberg的美国专利4，036，945 和4，331，647以及其中包含的引用文献中，该专利通过引用完整地合并在此。还可参见 Porter, R. R. [Biochem. J. 73 =119-126 (1959) ] 也可利用切割抗体的其它方法，如将重链分离从而形成单价轻-重链片段，并进一步对片段进行切割，或其它酶、化学或基因技术，只要该片段能结合到可被完整抗体识别的抗原上。Fv片段包含VH和VL链的缔合体(结合体，association)。这种缔合可以是非共价的，如 hbar 等人所描述的[Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA 69 :2659-62 (19720) ] 可替换地，该可变链可通过分子间二硫键连接或通过化学物如戊二醛交联。优选地，该Fv片段包含通过肽接头连接的VH和VL链。这些单链抗原结合蛋白(sFv)是通过构建包含通过寡核苷酸连接的编码VH和VL结构域的DNA序列的结构基因而制备的。将结构基因插入到表达载体中，随后将该载体引入到宿主细胞如大肠杆菌中。该重组宿主细胞合成以接头肽桥连该两个V结构域的单一多肽链。制造sFv的方法描述在如[Whitlow and Filpula,Methods 2 :97-105(1991) ；Bird 等人，Science 242 :423-426(1988) ；Pack 等人，Bio/Technology 11 :1271-77(1993)；和美国专利No. 4，946，778中，该文献通过引用完整地合并在此。另一形式的抗体片段是对单一互补决定区(OTR)编码的肽。⑶R肽(“最小识别单位”)可通过构建编码感兴趣抗体的CDR的基因获得。此类基因例如通过利用聚合酶链反应制备，从而从产生抗体的细胞的RNA合成该可变区。参见，如Larrick和Fry [Methods， 2 :106-10(1991)]。根据本发明的一些实施方式，该⑶R可以任何形式的抗体实现，例如通过使用重组DNA技术实现。非人(如鼠类)抗体的人源化形式(人化形式，humanized form)为免疫球蛋白、 免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab' ) 2或其它抗体的抗原结合序列)的嵌合分子，其包含极小的源于非人免疫球蛋白的序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中形成受体互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或家兔的CDR、具有期望特异性、亲和性和接受力(能力、容量，capacity)的残基所替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基替代。人源化抗体还可包含既不能在受体抗体中找到又不能在所输入的CDR或框架序列中找到的残基。一般而言，该人源化抗体包含基本所有的至少一个，典型地为两个可变结构域，其中对应于非人免疫球蛋白CDR区的所有或基本所有的CDR区，以及所有或基本所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。该人源化抗体还最佳地包含免疫球蛋白恒定区(Fe)，典型地为人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分[Jones 等人，Nature，321 :522-525(1986) ；Riechmann 等人，Nature， 332 :323-329(1988)；和 Presta, Curr. Op. Struct. Biol.，2 :593-596(1992)]。用于人源化非人抗体的方法是本领域熟知的。一般地，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入其中的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为输入残基(import residues)，其典型地取自输入可变结构域。基本可按Winter和同事[Jones等人，Nature， 321 :522-525(1986) ；Riechmann 等人，Nature 332:323-327(1988) ；Verhoeyen 等人， Science, 239 1534-1536 (1988)]的方法，通过将啮齿动物CDR或CDR序列替换为人抗体的相应序列进行人源化。因此，此种人源化抗体为嵌合抗体(美国专利4，816，567)，其中不足一个完整的人可变结构域基本上已被来自于非人物种的相应序列所替代。实际上，人源化抗体典型地为这样的人抗体，其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被来自于啮齿动物抗体相似位点的残基所替代。人抗体还可利用多种本领域已知的技术生产，包括噬菌体展示文库(phage display libraries)[Hoogenboom and Winter, J. Mol.Biol. ,227 :381 (1991) ；Marks 等人，J. Mol.Biol.，222 :581 (1991)]。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体[(Cole 等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77(1985)和 Boerner 等人，J. Immunol. ,147(1) :86-95 (1991)]。类似地，人抗体可通过将人免疫球蛋白基因座引入到转基因动物中，如内源免疫球蛋白基因被部分或全部灭活的小鼠来生产。激发(挑战，challenge)后，观察到人抗体的产生在各个方面都非常类似于在人中看到的抗体，包括基因重排、组装、和抗体组库(antibody r印ertoire)。该方法描述在如美国专利 5，545，807,5, 545，806,5, 569，825,5, 625，126,5, 633，425,5, 661，016，和下列科学出版物中Marks 等人，Bio/technology 10，779-783 (1992) ；Lonberg 等人，Nature 368 :856-859(1994) ；Morrison, Nature 368 :812-13(1994) ；Fishwild 等人，Nature Biotechnology 14,845-51 (1996) ；Neuberger, Nature Biotechnology 14 :826(1996)；禾口 Lonberg and Huszar, Intern.Rev. Immunol. 13,65-93(1995)。根据本发明的一些实施方式，该抗体附接在细胞毒性部分上。根据本发明的一些实施方式，该抗体附接在可鉴定部分上。该可鉴定部分可以是结合对成员，其可经由其与该结合对另一成员的相互作用和直接可视化的标记而鉴定。在一个实施例中，该结合对成员为抗原，其可通过相应标记的抗体鉴定。在一个实施例中，该标记为荧光蛋白或产生比色反应(色度反应，colorimetric reaction)的酶。下表1给出可鉴定部分的序列实例。表 权利要求
1.一种以ATCC登录号PTA-9974保藏的杂交瘤细胞。
2.一种分离的抗体或抗体片段，其包含具有由根据权利要求1所述的杂交瘤细胞生产的抗体的CDR序列和方向的抗原识别结构域。
3.根据权利要求2所述的分离的抗体或抗体片段，其附接在细胞毒性部分上。
4.根据权利要求3所述的分离的抗体或抗体片段，其中，所述细胞毒性部分包括细胞毒素、趋化因子、化疗药、促凋亡剂、干扰素、放射性部分、或它们的组合。
5.根据权利要求2所述的分离的抗体或抗体片段，其附接在可鉴定部分上。
6.一种免疫调节方法，所述方法包括使表达CEACAM1的淋巴细胞与根据权利要求2所述的抗体或抗体片段接触。
7.一种抑制表达CEACAM1的肿瘤细胞的迁移或增殖的方法，所述方法包括使表达 CEACAM1的肿瘤细胞与根据权利要求2所述的抗体或抗体片段接触，从而抑制表达CEACAM1 的肿瘤细胞的迁移或增殖。
8.一种用于诊断需要其的受验者中的癌症的方法，所述方法包括使源自所述受验者的生物样品与根据权利要求2或5所述的抗体或抗体片段接触，其中，超出预定阈值的复合物形成表示所述受验者患有癌症。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述癌症的细胞的特征为与未感染的细胞相比 CEACAM1过表达。
10.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向需要其的受验者给予治疗有效量的根据权利要求2所述的抗体或抗体片段，从而治疗所述受验者中的癌症。
11.根据权利要求10所述的方法，进一步包括向所述受验者给予淋巴细胞。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述淋巴细胞包括T细胞或NK细胞。
13.—种抑制CEACAM1同型或异型的蛋白质-蛋白质相互作用的方法，所述方法包括使表达CEACAM1的淋巴细胞与根据权利要求2所述的抗体或抗体片段接触，从而抑制CEACAM1 同型或异型的蛋白质-蛋白质相互作用。
14.根据权利要求6或13所述的方法，其中，所述表达CEACAM1的淋巴细胞是肿瘤浸润淋巴细胞或NK细胞。
15.根据权利要求6或13所述的方法，其中，所述表达CEACAM1的淋巴细胞是细胞毒性 T细胞。
16.根据权利要求7所述的方法，其中，所述肿瘤细胞包括黑素瘤肿瘤细胞。
17.根据权利要求8或10所述的方法，其中，所述癌症是黑素瘤。
18.—种药物组合物，包含作为活性成分的根据权利要求2或3所述的抗体或抗体片段。
全文摘要
本发明公开了以ATCC登录号PTA-9974保藏的杂交瘤细胞。本发明还提供了抗体以及使用该抗体的方法。
文档编号C07K16/28GK102482354SQ201080029465
公开日2012年5月30日 申请日期2010年4月29日 优先权日2009年4月30日
发明者加尔·马克尔, 罗纳·奥尔藤贝格 申请人:特尔汗什莫尔医学基础设施研究和服务公司, 雷蒙特亚特特拉维夫大学有限公司