施用抗TNFα抗体的方法
【专利说明】施用抗TNFa抗体的方法
[0001] 本申请是2002年6月5日提交的02815654. 4号发明专利申请（名称为"施用抗 TNFa抗体的方法"的分案申请。
【背景技术】
[0002] 肿瘤坏死因子（TNFa)是一种由多种细胞（包括单核细胞和巨隧细胞）产生 的细胞因子，最初是根据其诱导某些鼠肿瘤坏死的能力而鉴定出的（参见Old,L. (1985) Science230:630-632)。随后，确定了一种与恶病相关的，命名为恶液质素（cachectin) 的细胞因子和TNFa是同一分子。TNFa参与介导休克（参见Beutler，B.和Cerami，A. (1998)Annu.Rev.Biochem.57: 505-518 ;Beutle;r,B.和Cerami,A. (1998)Annu.Rev. Immunol.7:625-655)。此外，TNFa与其它多种人类疾病和失调的病理生理学有关，包括 脈血症、感染、自身免疫病、移植排斥和移植物抗宿主疾病（参见Vasilli，P. (1992)Annu. Rev.Immunol. 10:411-452 ;Tracey,Κ.J.和Cerami,A. (1994)Annu.Rev.Med. 45:491-503)。
[0003] 鉴于人TNFa化TNFa)在多种人类失调中所扮演的有害角色，治疗策略被设计为 抑制或中和hTNFa的活性。尤其是，能够结合并中和hTNFa的抗体已被作为一种抑制 hTNFa活性的手段（means)。某些最早的运类抗体是鼠的单克隆抗体（mAbs)，由用hTNFa 免疫的鼠淋己细胞制备的杂交瘤分泌（参见Η址ηT.等，（1985)Pro化tlAcadSciUSA 82:3814-3818 ;Liang,C-M等（1986)Biochem.Biophys.Res.Commun. 137:847-854 ;Hirai,Μ 等（1987)J.Immunol.Methods96:57-62 ;Fendly，B.M.等（1987)Hybridoma6:359-370; M61ler，A.等（1990)切tokine2:162-169;Moeller等的美国专利No. 5231024; wallach,D.的欧洲专利出版物No. 186833B1 ;01d等的欧洲专利申请No. 218868A1 ;由 MoellerA.等的欧洲专利出版物No. 260610B1)。运些鼠抗hTNFa抗体通常显示较高的与 hTNFa的亲和力（如：Kd《10 9M)并能中和hTNFa活性，但体内应用运些抗体可能受制于 施用运些鼠抗人抗体相关的问题，如：血清半衰期短、不能触发某些人体效应器功能W及人 体内诱发不期望的对鼠抗体的免疫应答（"人抗鼠抗体"（HAM)的反应）。
[0004] 为了解决人体内使用完全的（化11)鼠抗体所带来的问题，用基因工程的方法将 鼠抗hTNFa抗体改造得更为"人化"。比如，已经制备了嵌合抗体，其中抗体链的可变区是 鼠源性的，而恒定区则是人源性的（Kni曲t，D.M.等（1993)Mol.Immunol. 30 :1443-1453 ; 化ddona，P.E.等的PCT出版物NO.W092/16553)。此外，也制备了人源化抗体，其中抗体可 变区的超变区是鼠源性的，但可变区的其余部分和抗体恒定区是人源性（Adair,J.R.等的 PCT出版物No.W092/11383)。然而，因为运些嵌合和人源化抗体仍保留一些鼠序列，它们仍 可能诱发不期望的免疫反应，即人抗嵌合抗体（HACA)反应，尤其是长期施用时，如治疗类 风湿性关节炎（rheumatoidart虹itis)等慢性适应症时（参见Elliott,M.J.等（1994) Lancet344 :1125-1127 ;Elliot，M.J.等（1994)Lancet344:1105-1110)。
[000引一种针对鼠单抗或其衍生物（如嵌合或人源化抗体）的优选的hTNFα抑制剂应 当是完全的人抗hTNFa抗体，因为运类药剂即使是长期使用也不会诱发HAM反应。应 用人杂交瘤技术已经制备了人抗hTNFa的单克隆自身抗体度wle，P等（1993)Cell. Immunol. 152 :556-568 ;B0}de，P.等（1993)Cell.Immunol. 152 :569-581;Boyle等的欧洲 专利申请出版物No. 614984A2)。然而，据报道运些杂交瘤来源的单克隆自身抗体对hTNFα 有亲和力，但亲和力太低W至于用常规方法测不出来，也不能够结合可溶性的hTNFa，也不 能够中和hTNFα诱导的细胞毒性（参见Boyle等；同上）。而且，人杂交瘤技术的成功依 赖于人周血中天然存在的产生特异性抗hTNFα自身抗体的淋己细胞。某些研究检测了人 体中的抗hTNFα的血清自身抗体（Fomsgaard，A等（1989)Scand.J.Immunol. 30 :219-223 ; Ben化zen，K等（1990)P;rog.Leuko巧teBiollOB:447-452),而其它的研究没有进行检测 化eusch，H-G等（1991)J.Immunol.Methods139 :145-147)。
[0006] 除天然存在的人抗hTNFα外可选择重组hTNFα抗体。与hTNFαW相对低的亲 和力（如Kd约10 7M)和快的解离速率（如Kw约10 ^秒）结合的重组人抗体已有报道 (Griffiths,A.D.等（1993化MB0J. 12:725-734)。然而，由于它们的相对快速的解离动力 学，运些抗体不适于治疗用。此外，已报道一种重组人抗hTNFα不能中和hTNFα活性，反 而强化hTNFa与细胞表面的结合，加速其内吞化idbury，A等（1994)Biotechnol.Ther. 5: 27-45 ;Aston，R等的PCT出版物No.W092/03145)。
[0007] 也有报道描述了重组人抗体，能够W高的亲和力W及慢的解离速率结合可溶的 hTNFα，运种抗体能够中和hTNFα活性，包括hTNFα诱导的细胞毒性（体内和体外）和 hTNFα诱导的细胞活化（参见美国专利No. 6090382)。施用抗体的典型方案为每周静脉用 药。每周施用抗体和/或任何药物是昂贵的、繁琐的，而且由于频繁施用而导致副反应次数 的增加。另外，静脉施用通常需要受过医学训练的人来操作，运也是一种限制。
[000引发明概述
[0009] 本发明提供一种治疗TNFa相关失调的每两周进行一次的用药方法，优选地通过 皮下用药。每两周用药一次与每周用药一次相比有许多优点，包括但不限于，较少的注射 总数，较少的注射部位反应（如局部疼痛与肿胀），患者接受程度提高（归因于注射频率降 低），对患者和卫生保健机构化ealthcareprovider)而言较低的花费。皮下用药本身也 有优点，即患者可自己施用治疗剂，如人TNFα抗体，运方便了患者和卫生保健机构。
[0010] 本发明提供了治疗其中TNFα活性有害的失调的方法。该方法包括给受试者每两 周皮下注射抗体一次。优选的抗体是能够特异性结合人TNFa的重组人抗体。本发明进一 步提供了治疗其中TNFa活性有害的失调的方法。运些方法包括利用联合治疗方法，其中 人抗体与其它治疗药剂一同给受试者施用，所述其它治疗药剂如一种或多种可与其它祀物 质结合的抗体（如结合其它细胞因子或细胞表面分子的抗体），一种或多种细胞因子，可溶 性TNFα受体（见例如PCT出版物No.W094/06476)和/或一种或多种能够抑制TNFα产生 或抑制其活性的化学药剂（诸如PCT出版物No.W093/19751中所述的cyclohexaneylidene 衍生物），优选药剂是氨甲蝶岭。抗体优选能够特异性结合人TNFa的重组人抗体。本发 明抗体的特征是W高亲和力和低解离动力学与hTNFα结合，而且能够中和hTNFα活性，包 括hTNFα诱导的细胞毒性（体内和体外）和hTNFα诱导的细胞活化。运些抗体可W是全 长的（如IgGl或IgG4抗体），也可仅包含抗原结合部分（如F油，F(油'）2,scFv片段或单 结构域）。本发明最优选的重组抗体命名为D2E7,其轻链CDR3结构域包含SEQIDN0:3的 氨基酸序列，重链CDR3结构域包含SEQIDN0:4的氨基酸序列（在附录B中列出）。优选 地，D2E7抗体轻链可变区化CVR)包含SEQIDN0:1的氨基酸序列，重链可变区（HCVR)包 含SEQIDNO:2的氨基酸序列。运些抗体在美国专利No. 6090382中有描述，其全文在此引 入作为参考。
[0011] 在一个实施方案中，本发明提供了治疗其中TNFa活性有害的失调的方法。运些 方法包括每两周皮下施用一次抗TNFa抗体，抑制人TNFa活性而治疗失调。失调可W是 例如脈血症、自身免疫性疾病（如类风湿性关节炎、变态反应、多发性硬化、自身免疫性糖 尿病、自身免疫性色素层炎W及肾病综合征）、感染性疾病、恶性肿瘤、移植排斥或移植物抗 宿主疾病、肺失调、骨失调、肠道失调或屯、脏失调。
[0012] 在另一实施方案中，本发明提供了治疗其中TNFa活性有害的失调的方法。运些 方法包括通过皮下施用抗TNFa抗体和氨甲蝶岭，抑制人TNFa活性，从而治疗失调。在一 方面中，氨甲蝶岭与抗TNFa抗体一同施用。在另一方面中，在施用抗TNFa抗体之前施用 氨甲蝶岭。在另一方面中，在施用抗TNFa抗体之后施用氨甲蝶岭。
[0013] 在一优选实施方案中，用于治疗其中TNFa活性有害的失调的抗TNFa抗体是人 抗TNFa抗体。更优选的是，通过每两周皮下施用分离的人抗体或抗体的抗原结合部分来 进行治疗。优选地，抗体或其抗原结合部分WKd为1X108Μ或更小，Kwf速率常数为1X10 ^ 秒或更小从人TNFa解离，运两者都是由表面等离子共振（surfaceplasmonresonance) 测定；而且按照标准的体外L929检测方法WICg。为1X10 7M或更低中和人TNFα细胞毒 性。更优选地，分离的人抗体或其抗原结合部分WKwf为5X10 ^秒或更小，更优选地WKwf 为1X10 ^秒或更小，从人TNFa解离。更优选地，分离的人抗体或其抗原结合部分，按照 标准的体外L929检测方法检测，WICs。为1X10 %或更低，进一步优选WICs。为1X10 9m 或更低，更进一步优选WICe。为1X10 或更低，中和人TNFα细胞毒性。
[0014] 再另一实施方案中，本发明提供了通过给受试者每两周皮下施用人抗体或其抗原 结合部分来治疗其中TNFa活性有害的失调的方法。所述抗体或其抗原结合部分优选具有 下列特征：
[001引a)由表面等离子共振测定，WK。》为1X10 ^秒或更小从人TNFα解离；
[0016]b)具有轻链CDR3结构域，其包含SEQIDNO:3的氨基酸序列，或通过在1，4,5,7 或8位进行单一丙氨酸替代，或在1，3,4,6, 7,8和/或9位进行1至5个保守氨基酸替代 由SEQIDNO:3修饰的氨基酸序列；
[0017](：)具有重链〔01?3结构域，其包含569 10^:4的氨基酸序列，或通过在2,3,4,5， 6,8,9,10或11位进行单一丙氨酸替代，或在2, 3,4, 5,6,8,9,10,11和/或12位进行1至 5个保守氨基酸替代由SEQIDNO:4修饰的氨基酸序列；
[0018] 更优选地，抗体或其抗原结合部分WKwf值为5X10^秒或更小从人TNFa解离。 进一步优选地，抗体或抗体的抗原结合部分WKwf值为1X10^秒或更小从人TNFa解离。
[0019] 在另一实施方案中，本发明提供了治疗其中TNFa活性有害的失调的方法。运些 方法包括每两周给受试者皮下施用人抗体或其抗原结合部分。抗体或其抗原结合部分优选 包含LCVR区和HCVR区，所述LCVR区具有CDR3结构域，其包含SEQIDN0:3的氨基酸序 列，或通过在1，4,5,7或8位进行单一丙氨酸替代由SEQIDN0:3修饰的氨基酸序列；所述 版：￥1?区具有〔01?3结构域，其包含569 10^:4的氨基酸序列，或通过在2,3,4,5,6,8,9，10 或11位进行单一丙氨酸替代由SEQIDNO:4修饰的氨基酸序列。进一步优选地，LCVR区 还具有CD2结构域，该结构域包含SEQIDNO:5的氨基酸序列，而HCVR还具有CD2结构域， 该结构域包含SEQIDNO:6的氨基酸序列。再进一步优选地，LCVR区还具有CDRl结构域， 该结构域包含SEQIDNO:7的氨基酸序列，而HCVR具有CDR1结构域，该结构域包含SEQID NO:8的氨基酸序列。
[0020] 在另一实施方案中，本发明提供了通过每两周给受试者皮下施用分离的人抗体或 其抗原结合部分来治疗其中TNFa活性有害的失调的方法。所述抗体或抗体的抗原结合部 分优选包含LCVR区和HCVR区，所述LCVR区包含SEQIDNO:1的氨基酸序列；而所述HCVR 区包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体具有IgGl重链的恒定区或 IgG4重链的恒定区。在另一实施方案中，抗体是F油片段、F(油'）2片段或单链Fv片段。
[0021] 在另一实施方案中，本发明提供了用于治疗失调的方法，该方法通过每两周给受 试者皮下施用一种或多种抗TNFa抗体或其抗原结合部分而使受试者获益。所述抗体或其 抗原结合部分优选包含LCVR区或连同HCVR区，所述LCVR区具有CDR3结构域，其包含选自 沈QIDNO:3,沈QIDNO:11，沈QIDNO:12,沈QIDNO:13,沈QIDNO:14,沈QIDNO: 15,沈QIDNO:16,沈QIDNO:17,沈QIDNO:18,沈QIDNO:19,沈QIDNO:20,沈QID NO:21，沈QIDNO:22,沈QIDNO:23,沈QIDNO:24,沈QIDNO:25,沈QIDNO:26 的氨 基酸序列；而所述HCVR区具有CDR3结构域，其包含选自SEQIDNO:4,SEQIDNO:27,SEQ IDNO:28,沈QIDNO:29,沈QIDNO:30,沈QIDNO:31，沈QIDNO:32,沈QIDNO:33， 沈QIDNO:34和沈QIDNO:35的氨基酸序列。
[0022] 本发明的另一个方面设及包含药物制剂的试剂盒，所述药物制剂包含药物组合 物。该试剂盒包含抗TNFa抗体和药学上可接受的载体。试剂盒内附有每两周皮下施用治 疗失调的药物组合物的说明，其中施用抗TNFa可使患者获益。在另一个方面中，本发明设 及包含药物制剂的试剂盒，所述药物制剂包含药物组合物，所述试剂盒进一步包含抗TNFα 抗体、氨甲蝶岭W及药学上可接受的载体。试剂盒内附有皮下施用治疗失调的药物组合物 的说明，其中施用抗TNFa抗体可使患者获益。
[0023] 本发明的另一方面提供了一种含有药物组合物的预装的注射器，所述药物组合物 包含抗TNFa抗体和药学上可接受的载体。在另一方面中，本发明提供了一种含有药物组 合物的预装的注射器，所述药物组合物包含抗TNFa抗体、氨甲蝶岭和药学上可接受的载 体。
[0024] 因此，本发明具体地设及W下方面：
[0025] 1. 一种治疗人类受试者中的失调的方法，其中疾病可用TNFa抗体治疗，所述方 法包括给人类受试者每两周施用一种组合物来治疗失调，其中所述组合物包含抗TNFα抗 体或其抗原结合部分。
[002引 2.如第1项中的方法，其中施用是通过皮下注射进行的。
[0027] 3.如第1项中的方法，其中所述抗TNFa抗体或其抗原结合部分是人抗TNFa抗 体。
[0028] 4.如第3项中的方法，其中由表面等离子共振测定，人抗体或其抗原结合部分W Kd为1X10%或更低，Kwf速率常数为1X10^秒或更低从人TNFa上解离，而且在标准的 体外L929检测方法中WICw为1 X 107m或更低中和人TNFα细胞毒性。
[0029] 5.如第3项中的方法，其中人抗体或其抗原结合部分WKwf速率常数为5X10 ^ 秒或更低从人TNFa上解离。
[0030] 6.如第3项中的方法，其中人抗体或其抗原结合部分WKwf速率常数为1X10 ^ 秒或更低从人TNFa上解离。
[003。 7.如第3项中的方法，其中人抗体或其抗原结合部分，在标准体外L929检测方法 中，WiCs。为1X108M或更低中和人TNFa细胞毒性。
[003引 8.如第3项中的方法，其中人抗体或其抗原结合部分，在标准体外L929检测方法 中，WiCs。为1X109M或更低中和人TNFa细胞毒性。
[003引9.如第3项中的方法，其中人抗体或其抗原结合部分，在标准体外L929检测方法 中，WiCs。为1X10 或更低中和人TNFa细胞毒性。
[0034] 10.如第3项中的方法，其中人抗体或其抗原结合部分是一种重组抗体或其重组 的抗原结合部分。
[003引11. 一种在人受试者中抑制人TNFa活性的方法，所述人受试者患有其中TNFa活 性有害的失调，所述方法包括每两周施用一种组合物，所述组合物包含人抗TNFα抗体，其 中人抗体或其抗原结合部分具有下列特征：
[0036]a)由表面等离子共振测定，WKw速率常数为1X10 ^秒或更低从人TNFα上解 离；
[0037]b)具有轻链CDR3结构域，其包含SEQIDΝ0:3的氨基酸序列，或通过在1、4、5、7 或8位进行单一丙氨酸替代，或在1、3、4、6、7、8和/或9位进行1至5个保守氨基酸替代 由SEQIDNO:3修饰的氨基酸序列；
[0038] C)具有重链CDR3结构域，其包含SEQIDNO: 4的氨基酸序列，或通过在2、3、4、5、 6、8、9、10或11位进行单一丙氨酸替代，或在2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12位进行1至 5个保守氨基酸替代由SEQIDN0:4修饰的氨基酸序列。
[0039] 12.如第11项中的方法，其中施用是通过皮下施用。
[0040] 13.如第11项中的方法，其中人抗体或其抗原结合部分WKw谜率常数为5X10 ^ 秒或更低从人TNFa上解离。
[0041] 14. 一种在人受试者中抑制人TNFa活性的方法，所述人受试者患有其中TNFa活 性有害的失调，所述方法包括每两周皮下施用一种组合物，所述组合物包含人抗TNFα抗 体，其中人抗体或其抗原结合部分具有轻链可变区化CVR)和重链可变区（HCVR)，轻链可变 区具有CDR3结构域，该结构域包含SEQIDΝ0:3的氨基酸序列，或通过在1、4、5、7或8位 进行单一丙氨酸替代由SEQIDNO:3修饰的氨基酸序列；重链可变区具有CDR3结构域，该 结构域包含SEQIDN0:4的氨基酸序列，或通过在2、3、4、5、6、8、9、10或11位进行单一丙 氨酸替代由SEQIDNO:4修饰的氨基酸序列。
[0042] 15.如第14项中的方法，其中人抗体或其抗原结合部分的LCVR进一步具有包含 569 10^:5的氨基酸序列的〔032结构域，版：￥1?进一步具有包含569 10^:6的氨基酸序 列的CDR2结构域。
[0043] 16.如第14项中的方法，其中人抗体或其抗原结合部分的LCVR进一步具有包含 569 10^:7的氨基酸序列的〔031结构域，版：￥1?进一步具有包含569 10^:8的氨基酸序 列的CDR1结构域。
[0044] 17. -种在人受试者中抑制人TNFa活性的方法，所述人受试者患有其中TNFa活 性有害的失调，所述方法包括每两周皮下施用一种组合物，所述组合物包含人抗TNFα抗 体，其中所述人抗体或其抗原结合部分具