抗flt3抗体及其使用方法

专利名称：抗flt3抗体及其使用方法
技术领域：
本发明属于抗体领域，并涉及FLT3特异性抗体以及使用此类抗体的方法，所述FLT3特异性抗体具有修饰的Fe区以产生或增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
背景技术：
表达于造血祖细胞的细胞表面上的酪氨酸激酶受体FLT3在早期造血过程中起重要作用。由于其在调节造血细胞(B细胞和T细胞)的存活、增殖和分化中的关键作用，异常的FLT3活性涉及于造血系统癌症的发展和进程中。例如，FLT3内部串联重复是与急性骨髓性白细胞(AML)相关的最常见突变。因此本领域需要能够特异地靶向和破坏FLT3表达细胞的抗体。因此，本发明的发明人的一个目的是提供能够体内结合和杀灭FLT3表达细胞的 抗FLT3抗体。

发明内容
本发明涉及抗人受体酪氨酸激酶FLT3的抗体和使用所述抗体的方法。在某些方面，所述抗体包括变异Fe区。在其它实施方式中，所述抗体为嵌合的或人源化的抗体。本发明还涉及包含这些抗体的药物组合物和在多种疾病适应症中使用所述抗体的方法。在第一方面，本发明涉及结合人受体酪氨酸激酶FLT3的抗体，其中所述抗体包含重链和/或轻链且相对于亲本(parent)抗FLT3抗体,所述抗体在恒定区中包含至少一个氨基酸置换，其中所述至少一个氨基酸置换包括氨基酸置换239D和332E，其中位置编号根据EU索引(Kabat等人，1983)。在一个具体实施方式
中，所述置换为S239D和I332E。在本发明的一个实施方式中，所述抗FLT3抗体具有细胞杀灭活性,例如,抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应物的功能。这意味着，经与FLT3表达细胞接触，所述抗体能够促进细胞死亡，例如通过触发补体系统的激活、吞噬或细胞凋亡。在一个实施方式中，所述抗体包含重链和轻链。所述重链可包括VhCDRU Vh⑶R2和Vh CDR3区，和/或所述轻链可包括Vl CDR1、VlCDR2和/或Vl CDR3区。在一个具体实施方式
中，所述' CDRl包含选自下述的氨基酸序列、基本上由选自下述的氨基酸序列组成或由选自下述的氨基酸序列组成氨基酸序列SEQ ID NO: I和SEQID N0:7;所述八CDR2包含选自下述的氨基酸序列、基本上由选自下述的氨基酸序列组成或由选自下述的氨基酸序列组成氨基酸序列SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:8;所述' CDR3包含选自下述的氨基酸序列、基本上由选自下述的氨基酸序列组成或由选自下述的氨基酸序列组成氨基酸序列SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:9 ;所述VhCDRI包含选自下述的氨基酸序列、基本上由选自下述的氨基酸序列组成或由选自下述的氨基酸序列组成氨基酸序列SEQID N0:4和SEQ IDN0:10 ;所述Vh⑶R2包含选自下述的氨基酸序列、基本上由选自下述的氨基酸序列组成或由选自下述的氨基酸序列组成氨基酸序列SEQ IDN0:5和SEQ ID NO: 11;所述Vh CDR3包含选自下述的氨基酸序列、基本上由选自下述的氨基酸序列组成或由选自下述的氨基酸序列组成氨基酸序列SEQ ID N0:6和SEQ ID NO: 12。在另一个具体实施方式
中，所述\⑶Rl包含SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列组成或由SEQ IDN0:1所示的氨基酸序列组成；所述Vl CDR2包含SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列组成或由SEQ IDN0:2所示的氨基酸序列组成；所述' CDR3包含SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列组成或由SEQ IDN0:3所示的氨基酸序列组成；所述Vh CDRl包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列、基本上由SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列组成或由SEQ IDN0:4所示的氨基酸序列组成；所述Vh CDR2包含SEQ ID N0:5所示的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列组成或由SEQ IDN0:5所示的氨基酸序列组成；所述Vh CDR3包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列、基本 上由SEQ ID N0:6所示的氨基酸序列组成或由SEQ IDN0:6所示的氨基酸序列组成。在又一个具体实施方式
中，所述' ⑶Rl包含SEQ ID N0:7所示的氨基酸序列、基本上由SEQ ID N0:7所示的氨基酸序列组成或由SEQ IDN0:7所示的氨基酸序列组成；所述Vl CDR2包含SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列组成或由SEQ IDN0:8所示的氨基酸序列组成；所述' CDR3包含SEQ ID N0:9所示的氨基酸序列、基本上由SEQ ID N0:9所示的氨基酸序列组成或由SEQ IDN0:9所示的氨基酸序列组成；所述Vh CDRl包含SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列组成或由SEQ IDNO: 10所示的氨基酸序列组成；所述Vh CDR2包含SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列组成或由SEQ IDN0:11所示的氨基酸序列组成；所述Vh⑶R3包含SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列、基本上由SEQ IDNO: 12所示的氨基酸序列组成或由SEQ IDNO: 12所示的氨基酸序列组成。在本发明的一个实施方式中，本发明的抗体的重链包含Vh结构域，所述Vh结构域包含SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列、基本上由SEQ IDN0:14所示的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列组成，和/或本发明的抗体的轻链包含\结构域，所述\结构域包含SEQ IDN0:13所示的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列组成。在本发明的另一个实施方式中，本发明的抗体的重链包含Vh结构域，所述Vh结构域包含SEQ ID NO: 30所示的氨基酸序列、基本上由SEQ IDN0:30所示的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO: 30所示的氨基酸序列组成，和/或本发明的抗体的轻链包含\结构域，所述'结构域包含SEQ IDN0:29所示的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO: 29所示的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列组成。在本发明的另一个实施方式中，要求保护的抗体为嵌合抗体，并且包含具有SEQID N0:27所示的氨基酸序列的重链和/或具有SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的轻链。在本发明的另一个实施方式中，要求保护的抗体为嵌合抗体，并且包含具有SEQID N0:43所示的氨基酸序列的重链和/或具有SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列的轻链。在本发明的某些实施方式中，与不具有氨基酸置换S239D/I332E的亲本抗体相t匕，包含氨基酸置换S239D/I332E的本发明的抗体以增强的亲和力结合Fe Y RIIIa受体或具有增强的ADCC效应物功能。就此而言，术语“增强的”包括下述情况所述亲本抗体不显示出任何能够以实验方式验证的ADCC效应物功能，因此新产生的经Fe最优化的抗体首次且与其可能源于的亲本抗体相当不同地显示出ADCC效应物功能。在其它实施方式中，所述抗体在选自下述的位置处包含一个或多个其它氨基酸修饰:221、222、223、224、225、227、228、230、231、232、233、234、235、236、237、238、240、241、243、244、245、246、247、249、255、258、260、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、278、280、281、282、283、284、285、286、288、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、313、317、318、320、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、333、334、335、336 和 337，其中位置编号根据 EU 索引。这些一个或多个其它氨基酸修饰可以选自下述氨基酸置换221K、221Y、222E、222Y、223E、223K、224E、224Y、225E、225K、225W、227E、227G、227K、227Y、228E、228G、228K、228Y、230A、230E、230G、230Y、231E、231G、231K、231P、231Y、232E、232G、232K、232Y、233A、233D、233F、233G、233H、233I、233K、233L、233M、233N、233Q、233R、233S、233T、233V、233W、233Y、234A、234D、234E、234F、234G、234H、2341、234K、234M、234N、234P、234Q、234R、234S、234T、234V、234W、234Y、235A、235D、235E、235F、235G、235H、2351、235K、235M、235N、235P、235Q、235R、235S、235T、235V、235W、235Y、236A、236D、236E、236F、236H、236I、236K、236L、236M、236N、236P、236Q、236R、236S、236T、236V、236W、236Y、237D、237E、237F、237H、237I、237K、237L、237M、237N、237P、237Q、237R、237S、237T、237V、237W、237Y、238D、238E、238F、238G、238H、238I、238K、238L、238M、238N、238Q、238R、238S、238T、238V、238W、238Y、240A、2401、240M、240T、 241D、241E、241L、241R、241S、241W、241Y、243E、243H、243L、243Q、243R、243W、243Y、244H、245A、246D、246E、246H、246Y、247G、247V、249H、249Q、249Y、255E、255Y、258H、258S、258Y、260D、260E、260H、260Y、262A、262E、262F、262I、262T、263A、263I、263M、263T、264A、264D、264E、264F、264G、264H、264I、264K、264L、264M、264N、264P、264Q、264R、264S、264T、264W、264Y、265F、265G、265H、265I、265K、265L、265M、265N、265P、265Q、265R、265S、265T、265V、265W、265Y、266A、266I、266M、266T、267D、267E、267F、267H、267I、267K、267L、267M、267N、267P、267Q、267R、267T、267V、267W、267Y、268D、268E、268F、268G、268I、268K、268L、268M、268P、268Q、268R、268T、268V、268W、269F、269G、269H、269I、269K、269L、269M、269N、269P、269R、269S、269T、269V、269W、269Y、270F、270G、270H、270I、270L、270M、270P、270Q、270R、270S、270T、270W、270Y、271A、271D、271E、271F、271G、271H、2711、271K、271L、271M、271N、271Q、271R、271S、271T、271V、271W、271Y、272D、272F、272G、272H、272I、272K、272L、272M、272P、272R、272S、272T、272V、272W、272Y、273I、274D、274E、274F、274G、274H、2741、274L、274M、274N、274P、274R、274T、274V、274W、274Y、275L、275W、276D、276E、276F、276G、276H、2761、276L、276M、276P、276R、276S、276T、276V、276W、276Y、278D、278E、278G、278H、2781、278K、278L、278M、278N、278P、278Q、278R、278S、278T、278V、278W、280G、280K、280L、280P、280W、281D、281E、281K、281N、281P、281Q、281Y、282E、282G、282K、282P、282Y、283G、283H、283K、283L、283P、283R、283Y、284D、284E、284L、284N、284Q、284T、284Y、285D、285E、285K、285Q、285W、285Y、286E、286G、286P、286Y、288D、288E、288Y、290D、290H、290L、290N、290W、291D、291E、291G、291H、2911、291Q、291T、292D、292E、292T、292Y、293F、293G、293H、293I、293L、293M、293N、293P、293R、293S、293T、293V、293W、293Y、294F、294G、294H、294I、294K、294L、294M、294P、294R、294S、294T、294V、294W、294Y、295D、295E、295F、295G、295H、2951、295M、295N、295P、295R、295S、295T、295V、295W、295Y、296A、296D、296E、296G、296H、2961、296K、296L、296M、296N、296Q、296R、296S、296T、296V、297D、297E、297F、297G、297H、2971、297K、297L、297M、297P、297Q、297R、297S、297T、297V、297W、297Y、298A、298D、298E、298F、298H、2981、298K、298M、298N、298Q、298R、298T、298W、298Y、299A、299D、299E、299F、299G、299H、2991、299K、299L、299M、299N、299P、299Q、299R、299S、299V、299W、299Y、300A、300D、300E、300G、300H、300K、300M、300N、300P、300Q、300R、300S、300T、300V、300W、301D、301E、301H、301Y、3021、303D、303E、303Y、304D、304H、304L、304N、304T、305E、305T、305Y、313F、317E、317Q、318H、318L、318Q、318R、318Y、320D、320F、320G、320H、320I、320L、320N、320P、320S、320T、320V、320W、320Y、322D、322F、322G、322H、322I、322P、322S、322T、322V、322W、322Y、323I、324D、324F、324G、324H、3241、324L、324M、324P、324R、324T、324V、324W、324Y、325A、325D、325E、325F、325G、325H、3251、325K、325L、325M、325P、325Q、325R、325S、325T、325V、325W、325Y、326E、3261、326L、326P、326T、327D、327E、327F、327H、3271、327K、327L、327M、327N、327P、327R、327S、327T、327V、327W、327Y、328A、328D、328E、328F、328G、328H、3281、328K、328M、328N、328P、328Q、328R、328S、328T、328V、328W、328Y、329 D、329E、329F、329G、329H、3291、329K、329L、329M、329N、329Q、329R、329S、329T、329V、329W、329Y、330E、330F、330G、330H、3301、330L、330M、330N、330P、330R、330S、330T、330V、330W、330Y、331D、331F、331H、3311、331L、331M、331Q、331R、331T、331V、331W、331Y、333A、333F、333H、333I、333L、333M、333P、333T、333Y、334A、334F、334I、334L、334P、334T、335D、335F、335G、335H、335I、335L、335M、335N、335P、335R、335S、335V、335W、335Y、336E、336K、336Y、337E、337H 和337N，其中位置编号根据EU索引。在另一个实施方式中，所述一个或多个其它氨基酸修饰处在选自下述的位置221、222、223、224、225、228、230、231、232、240、244、245、247、262、263、266、271、273、275、281、284、291、299、302、304、313、323、325、328 和 336，其中位置编号根据 EU索引。在这样的实施方式中，所述一个或多个其它氨基酸修饰可以选自下述氨基酸置换221K、221Y、222E、222Y、223E、223K、224E、224Y、225E、225K、225W、228E、228G、228K、228Y、230A、230E、230G、230Y、231E、231G、231K、231P、231Y、232E、232G、232K、232Y、240A、240I、240M、240T、244H、245A、247G、247V、262A、262E、262F、2621、262T、263A、2631、263M、263T、266A、2661、266M、266T、271A、271D、271E、271F、271G、271H、2711、271K、271L、271M、271N、271Q、271R、271S、271T、271V、271W、271Y、273I、275L、275W、281D、281E、281K、281N、281P、281Q、281Y、284D、284E、284L、284N、284Q、284T、284Y、291D、291E、291G、291H、2911、291Q、291T、299A、299D、299E、299F、299G、299H、299I、299K、299L、299M、299N、299P、299Q、299R、299S、299V、299W、299Y、304D、304H、304L、304N、304T、313F、323I、325A、325D、325E、325F、325G、325H、3251、325K、325L、325M、325P、325Q、325R、325S、325T、325V、325W、325Y、328A、328D、328E、328F、328G、328H、3281、328K、328M、328N、328P、328Q、328R、328S、328T、328V、328W、328Y、336E、336K 和 336Y。在具体实施方式
中，所述抗体包含选自下述的一个或多个其它氨基酸修饰236A、268D、268E、330Y 和 330L。在另一方面，本发明的特征在于核酸分子，所述核酸分子编码本发明的抗体的重链和/或轻链。这些核酸分子可包含编码所述轻链的可变结构域的核苷酸序列，例如SEQID N0:17或SEQ ID NO: 33所示的核苷酸序列；或所述重链的可变结构域的核苷酸序列，例如SEQ ID NO: 18或SEQID NO:34所示的核苷酸序列。在一个具体实施方式
中，编码本发明的抗体的轻链的核酸具有选自SEQ ID No. 24和SEQ ID No. 40的核苷酸序列。在另一个具体实施方式
中，编码本发明的抗体的重链的核酸具有选自SEQ IDNo. 28和SEQ ID No. 44的核苷酸序列。在其它方面，本发明涉及治疗人受体酪氨酸激酶FLT3相关的疾病或障碍的方法，其中所述方法包括给有此需要的受试者施用本发明的抗体。所述受试者可以为，例如，动物或人，优选哺乳动物，例如人。在一个实施方式中，所述疾病或障碍为细胞增殖性疾病或障碍。在另一个实施方式中，所述疾病或障碍为造血系统出现的肿瘤，例如淋巴瘤或白血病。所述淋巴瘤或白血病可以选自非霍金奇淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴细胞性白血病 (CLL)、B-细胞急性淋巴细胞性白血病/淋巴瘤(B-ALL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、毛细胞白血病(HCL)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓性白血病和多发性骨髓瘤(MM)。在优选实施方式中，所述淋巴瘤为急性骨髓性白血病(AML)。在另一个实施方式中，所述疾病或障碍为骨髓增生异常综合征(MDS)。在多个实施方式中，所述淋巴瘤或白血病处于微小残留病(MRD)的阶段，例如在具有或不具有干细胞移植的常规化疗之后达到的。在本发明的方法的某些实施方式中，所述抗体可以与至少一种选自下述的药剂组合给药细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、激酶抑制剂、抗血管生成剂、保心剂、免疫刺激剂、免疫抑制剂、血管生成抑制剂、蛋白酪氨酸激酶抑制剂和第二抗体。在又一方面，本发明还包括药物组合物，其包含根据本发明的抗体和药学上可接受的载体。在另一方面，本发明涉及抑制表达FLT3的细胞增殖的方法，其中所述方法包括使所述细胞与根据本发明的抗体接触。该方法可以为体外方法。在其它方面，本发明涉及增强对于表达FLT3的细胞的抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性的方法，其中所述方法包括使所述细胞与根据本发明的抗体接触。本发明的又一方面为耗竭哺乳动物的至少一种表达FLT3的细胞的方法，其中所述方法包括给所述哺乳动物施用根据本发明的抗体。本发明还涉及根据本发明的抗体用于治疗FLT3相关的疾病或障碍的用途。FLT3相关的疾病或障碍可以为细胞增殖性疾病或障碍，例如造血系统出现的肿瘤，例如淋巴瘤或白血病，或骨髓增生异常综合征(MDS)。所述淋巴瘤或白血病可以选自非霍金奇淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B-细胞急性淋巴细胞性白血病/淋巴瘤(B-ALL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、毛细胞白血病(HCL)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓性白血病(AML)和多发性骨髓瘤(MM)，优选为急性骨髓性白血病。在另一个实施方式中，本发明涉及根据本发明的抗体用于以表达FLT3的细胞为靶向的用途。所述靶向可以包括使用所述抗体来给FLT3表达细胞递送药物或毒素。在又一方面，本发明包括根据本发明的抗体用于检测生物样品中的表达FLT3的细胞的用途。对于此用途，可以用可检测部分标记所述抗体，该可检测部分例如荧光团、发色团、免疫标签等。本发明还涉及抗FLT3的单克隆抗体，其中所述抗体由经转染产生的生产细胞系(producer cell line)产生,所述细胞系例如CHO或Sp2/0。在又一方面，本发明的特征在于产生根据本发明的抗体的经转染的细胞系。


结合非限制性实施例和附图考虑时，参照具体实施方式
可以更好地理解本发明。图I示出了用于嵌合单克隆抗体的克隆操作程序的示意图。框表示外显子，圆环指示增强子元件，细线指示UT区和内含子序列。P，启动子，L1和L2，由两个不同的外显子编码的前导序列；E，增强子；V，可变区；D，多变区；J，连接区；C(1_3)，恒定区的外显子；H，铰链 区。图2示出了含有小鼠轻链的VJ区和人K基因的C区的亲本载体(parentalvector)。用于片段交换的相关区域以放大形式示于图2A。经将单克隆抗体BVlO或4G8的VJ区插入到表达载体chimFLT3-light中产生的序列关系示于图2B。用于分泌信号肽的切割位点由I表示，外显子-内含子边界由[，]表示。图3示出了含有人Y I同种型Ig重链的初始载体。用于克隆VDJ片段的相关区域以放大形式示出(a)。被放大的MluI-SpeI片段(以放大形式示出为b)含有人Y I重链的整个恒定区，并在CH2结构域中具有所指示出的2个氨基酸修饰(Ser239-Asp ；ISo332-Glu)0图3B示出了经将单克隆抗体BVlO或4G8重链的VDJ区插入到重链表达载体chimFLT3_重中产生的序列关系。用于分泌信号肽的切割位点由I表示，外显子-内含子边界由[，]表
/Jn o图4分别示出了 Fe最优化的嵌合抗体chim4G8-SDIE (A)和chimBVlO-SDIE (B)以及未刺激的人PBMC针对培养的FLT3表达人NALM16白血病细胞的细胞杀灭作用，其中与未修饰的嵌合抗体chim4G8和ChimBVlO进行比较。图4C示出了针对NG2的嵌合抗体对人SKMel63-黑素瘤细胞的细胞杀灭作用，所述嵌合抗体已在与上文的抗体chim4G8_SDIE和chimBVlO-SDIE相同位置进行了 Fe最优化。使用铬释放测定、测定持续时间测定了细胞毒性，并示出了靶物效应物比率。图5示出了最优化的抗FLT3抗体4G8-SDIE和未刺激的人PBMC对AML-母细胞的细胞杀灭作用，其中与未修饰的亲本小鼠抗体进行了比较。图6示出了抗FLT3抗体克隆4G8和BVlO的轻(A)和重⑶链可变区的氨基酸序列比对。图7示出了小鼠嵌合的和最优化的4G8和BVlO与FLT3的结合。将FLT3-和假-转染的Sp2/0细胞(A)或NALM16细胞(B，C)与示出的抗体一起孵育，然后通过间接免疫荧光法和流式细胞术分析。(A)中的空白的和带阴影的柱状图分别表示用同种型对照和所示出的FLT3抗体(10 u g/ml)的染色。MFI=平均荧光强度。图8示出了 4G8SDIEM对FLT3-配体(FLT3L)结合和白血病细胞增殖的作用。(A)在存在所示出浓度的重组FLT3配体的情况下，将NALM16细胞与I y g/ml的4G8SDIEM或BV10SDIEM—起孵育，然后通过间接免疫荧光法和流式细胞术测定所结合抗体的量。⑶将通过密度梯度离心从3位不同患者的外周血分离的AML母细胞与所示出浓度的4G8SDIEM一起孵育24小时，然后使用3[H]-胸腺嘧啶掺入测定评估增殖。右侧的柱表示在不存在抗体的情况下的增殖。图9示出了未修饰和SDIEM-修饰形式的FLT3抗体4G8和BVlO的ADCC活性。在存在所示出浓度的未修饰的嵌合的(X )或SDIEM-修饰形式的4G8和BVlO的情况下，将51 [Cr] -标记的NALM16细胞与健康供体(#4)的PBMC —起孵育4小时，其中PBMC:靶细胞比率为50:1。使用标准的51[Cr]释放测定测定靶细胞的杀灭。示出了采用来自不同健康供体的PBMC的6个独立实验的一个示例性结果。图10示出了 4G8SDIEM抗白血病细胞的ADCC活性。分别在4小时和8小时51 [Cr]释放测定中测定了 3位不同健康供体的PBMC (PBMC #1、#2、#3)抗NALM16细胞的细胞裂解活性(A)和供体#2的PBMC抗3位不同患者的白血病母细胞(AML #1、#2、#7)的细胞裂解活性(B)。在(C)中，使用各个患者的自体PBMC作为效应物细胞，示出了抗AML母细胞#1和#15的8小时后的细胞裂解活性。填充和空白的符号分别指示了 4G8SDIEM和非结合对照抗体9. 2. 27SDIE介导的ADCC。右侧填充的柱(NK)指示了在不存在抗体的情况下的 NK-活性。注意，PBMC #1-3是指健康供体的PBMC，并不涉及AML母细胞#1-3。图11示出了抗原转变和不同来源的白血病细胞上的FLT3表达。(A)将NALM16细胞和来自2位不同AML患者的母细胞与所示出浓度的4G8SDIEM—起孵育。48小时后，洗涤细胞，再次与2 u g/ml 4G8SDIEM孵育，然后通过间接免疫荧光法和流式细胞术分析。将在无抗体预孵育的细胞上检测到的FLT3表达定义为100%。(B)将来自15位患者的AML母细胞与小鼠4G8 (IOii g/ml) —起孵育，洗涤，然后通过间接免疫荧光法和流式细胞术分析。通过与被校准的珠子(QIFIKIT)进行比较，测定所结合抗体分子的量。(C)将用于(B)的AML母细胞与PE-缀合的4G8SDIEM或非结合的PE缀合的9. 2. 27SDIE抗体(10 u g/ml) 一起孵育，然后通过直接免疫荧光法和流式细胞术分析。SFI=具体荧光系数。由于9. 2. 27SDIE对照抗体的高结合，没有测定到4个样品的SFI (n. d.)。图12示出了 FLT3在正常DC和骨髓细胞上的表达。(A)将通过磁性细胞分离法从健康供体的外周血分离的DC与小鼠4G8 —起孵育，洗涤用标记的第二抗体染色，再次洗涤，然后与不同标记的CDllc-和CD303-抗体的混合物一起孵育。然后通过流式细胞术分析细胞。在(B)和(C)中分别示出了 4G8 与 CD303+pDC 和 CDl lc+mDC 亚群(subpopulation)的结合。(D，E)类似于(A-C)，将通过密度梯度离心分离的正常骨髓细胞与小鼠4G8—起孵育，洗涤，用标记的第二抗体以及不同标记的⑶34-和⑶45-抗体的混合物染色。.在(E)中示出了 4G8与⑶34+⑶451ow亚组的结合。带阴影的柱状图表示用同种型对照的第一次染色，空白的柱状图表示用小鼠4G8的第一次染色。示出了用DC和来自不同健康供体的骨髓细胞的3次实验之一的示例性结果。图13示出了 4G8SDIEM抗正常细胞的细胞毒活性。(A)将来自2位不同健康供体的人骨髓细胞(黑色和带阴影的柱)与5 ii g/ml 4G8 SDIEM —起孵育，然后在半固体培养基孵育12天后测定菌落形成单元。将CFU的数量与未处理对照进行相关。(B)在4小时51 [Cr]释放测定中，将NALM16细胞和通过磁性细胞分离法从健康供体的PBMC分离的DC用作4G8SDIEM的靶物(PBMC:靶物比率为100:1)。示出了用来自不同供体的DC和自体PBMC的3个实验的一个示例性实验。图14示出了 4G8抗体对患者的靶物和效应物细胞的体外作用。(A)通过使用亲本小鼠4G8抗体和同种型对照、然后用抗-小鼠-PE缀合物进行FACS来分析FLT3表达，并进行CD34双染，分析患者PBMC。(B，C)将患者PBMC与铬标记的FLT3-阳性NALM16细胞(B)或通过⑶34+选择分离的患者母细胞(C) 一起孵育。用所示出浓度的4G8-SDIEM或未修饰的、嵌合的4G8抗体(4G8-ch)预处理靶细胞。通过铬释放测定，以PBMC:靶物比率为50:1测定ADCC的诱导。注意，采用PBMC和未纯化的NK细胞。图15示出了 4G8-SDIEM的体内半衰期和结合特征。(A)通过将表达FLT3的NALM16细胞与在临床施用的不同时间点获得的血清样品一起孵育，测定4G8-SDIEM的血清半衰期。通过FACS测定特异结合的抗体的量，然后与含有所限定水平的4G8-SDIEM的血清样品的结合活性比较。ND，未测得。(B)为了检测4G8-SDIEM的体内结合，将治疗(d0)之前和施用IOmg剂量(d5)后Ih获得的BM母细胞与IOii g/ml的亲本4G8小鼠抗体、如所示出的第二非交叉反应性的小鼠抗FLT3抗体(BVlO)或同种型对照(空白的峰)、然后用人-吸附的抗-小鼠-PE-缀合物一起孵育。如通过FACS测定的小鼠-4G8 (但非BV10)结合的完全抑制指示了 4G8-SDIEM的饱和结合。
图16示出了 4G8-SDIEM的临床作用。(A, B)通过FACS在显性白血病治疗期间所示出的时间，测定CD34+母细胞(空白的圆圈)和活化的(CD69+) CD56+CD3-NK细胞(菱形)在外周血(PB) (A)或骨髓(BM) (B)单核细胞中的百分比。(C)通过IMMUUTEk测量测定在显性白血病治疗期间所示出的时间的TNF血清水平。(D)如上所述，在完全缓解(CR)中施用4G8-SDIEM期间所示出的时间，测定活化的NK细胞在外周血单核细胞(菱形)的百分比和TNF的血清水平(圆环)。
具体实施例方式除非另外明确说明，本文使用的术语具有以下意义。本文使用的“ADCC”或“抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性”表示这样的细胞介导的反应在该反应中，表达Fe Y R的细胞毒性细胞识别靶细胞上结合的抗体，然后导致靶细胞的裂解。本文使用的“ADCP”或“抗体依赖性的细胞介导的吞噬”表示这样的细胞介导的反应在该反应中，表达Fe Y R的非特异的细胞毒性细胞识别靶细胞上结合的抗体，然后导致靶细胞的吞噬。本文使用的“氨基酸”和“氨基酸种类”表示可以在具体、限定的位置存在的20个天然存在的氨基酸或任何非天然类似物中的一者。因而，本文使用的“氨基酸”为天然存在的和合成的氨基酸二者。例如，高丙氨酸、瓜氨酸和正亮氨酸被认为是用于本发明的目的的氨基酸。“氨基酸”还包括亚氨基酸残基，例如脯氨酸和羟基脯氨酸。侧链可以处于(R)或
(S)构型。在一个实施方式中，氨基酸为处于(S)或L-构型。如果使用非天然存在的侧链，则可以使用非氨基酸取代基，例如防止或延迟体内降解。本文的“抗体”表示由一个或多个基本上由全部或部分所识别的免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白。所识别的免疫球蛋白基因，例如人的，包括kappa ( K )、lambda (入)和重链遗传基因座，其共同包括myriad可变区基因和恒定区基因mu (ii )、delta( 5 )、gamma( y )、epsilon ( e )和 alpha( a )，其分别编码 IgM、IgD、IgG (IgGU IgG2、IgG3 和IgG4)、IgE和IgA (IgAl和IgA2)同种型。本文的抗体意指包括全长抗体和抗体片段,并且可以指来自任何生物的天然抗体、工程化抗体或用于实验、治疗或其它目的的重组产生的抗体。本文使用的“B细胞”或“B淋巴细胞”表示在骨髓中发展、在血液和淋巴中循环且提供体液免疫的一类淋巴细胞。B细胞识别游离的抗原分子并分化或成熟为血浆细胞，所述血浆细胞分泌使抗原失活的免疫球蛋白(抗体)。还产生记忆细胞，该记忆细胞在后续与该抗原相遇时产生特定免疫球蛋白(抗体)。还将兰氏胰岛中的B细胞称为“ P细胞”。本文使用的“T细胞”或“T淋巴细胞”表示这样的淋巴细胞类型所述淋巴细胞类型在骨髓中发展，在血液和淋巴中循环，并且提供细胞免疫。T细胞包含识别细胞结合的抗原分子的T细胞受体。T细胞能够成熟为分泌细胞因子和活化其它细胞类型的辅助T细胞或者成熟为结合和破坏其它细胞的细胞毒性T细胞。本文可互换地使用的“FLT3”(fms-样酪氨酸激酶受体_3)、“FLK2”(胎肝激酶-2)、和“⑶135”表示在造血祖细胞表面上表达的细胞因子受体。FLT3为用来鉴定骨髓中某些类型的造血(血液)祖细胞的细胞表面标志物。特别地，多能祖细胞(MPP)和共同淋巴祖细 胞(CLP)表达高表面水平的FLT3。FLT3受体被细胞因子Flt3配体(Flt3L)结合。FLT3为III型受体酪氨酸激酶。当此受体被Flt3L结合时，它形成活化第二信使信号传递的二聚体(同型二聚体)。FLT3信号传递在细胞存活、增殖和淋巴细胞(B细胞和T细胞)发展的分化中起重要作用。由于FLT3信号传递的减量调节能够导致增殖性疾病，例如癌症，特别是白血病，因此将FLT3分类为原癌基因。事实上，FLT3的内部串联重复是与急性骨髓性白细胞(AML)相关的最常见突变。本文使用FLT3意指包括全部已知的或尚未发现的FLT3的等位基因和多态形式。人FLT3抗原的序列提供于SEQ IDNO:650本文使用的“CDC”或“补体依赖性的细胞毒性”表示这样的反应其中一个或多个补体蛋白组分识别靶细胞上的结合的抗体，然后导致靶细胞的裂解。本文定义的抗体的“恒定区”表示抗体的由轻链或重链免疫球蛋白恒定区基因中的一个编码的区域。本文使用的“恒定轻链”或“轻链恒定区”表示抗体的由kappa(CK)或lambda(CA)轻链编码的区域。恒定轻链通常包含单个结构域，并且本文所定义的是指Ck或lambda Ca的第108-214位，其中编号根据EU索引。本文使用的“恒定重链”或“重链恒定区”表示抗体的由ii、S、Y、a、或e基因编码以分别定义IgM、IgD、IgG、IgA、或IgE的抗体的同种型的区域。对于全长IgG抗体,本文定义的恒定重链是指CHl结构域的N-端至CH3结构域的C-端，因而包含第118-447位，其中编号根据EU索引。本文使用的“效应物功能”表示由抗体Fe区与Fe受体或配体的相互作用引起的生物化学事件。效应物功能包括Fe Y R介导的效应物功能(例如ADCC和ADCP)以及补体介导的效应物功能(例如⑶C)。本文使用的“效应物细胞”表示表达一个或多个Fe受体和介导一个或多个效应物功能的免疫系统的细胞。效应物细胞包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、郎氏细胞、自然杀伤(NK)细胞和T细胞，并且可以来自任何生物，所述生物包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、和猴。
本文使用的“Fab”或“Fab区”表示包含VH、CH1、VH、和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可以指分离的此区域或者处于全长抗体或抗体片段中的此区域。本文使用的“Fe”或“Fe区”表示包含抗体的恒定区的多肽，其排除了第一恒定区免疫球蛋白结构域。因而Fe是指IgA、IgD、和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域、和IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域、以及这些结构域N-端的柔性铰链区。对于IgA和IgM，Fe可以包括J链。对于IgG，Fe包括免疫球蛋白结构域Cy2和Cy3以及CYi和Cy2之间的铰链区。尽管Fe区的边界可以改变，但是通常将人IgG重链Fe区定义为包含其羧基-端的残基C226或P230，其中编号根据如Kabat中的EU索引。Fe可以指分离的此区域或者处于Fe多肽(例如抗体)中的此区域。本文使用的“Fe多肽”表示包含全部或部分Fe区的多肽。Fe多肽包括抗体Fe融 合物、分离的Fe、和Fe片段。本文使用的“Fe Y受体”或“Fe Y R”表示结合IgG抗体Fe区且基本上由Fe Y R基因编码的蛋白家族的任何成员。在人中，此家族包括但不限于Fe y RI (CD64)，包括同种型Fe y RIa, Fe Y Rib、和 Fe YRIc ;Fc Y RII (CD32)，包括同种型 Fe Y RIIa (包括异型 H131h 和R131)、Fe y RIIb (包括 Fe y RIIb-I 和 Fe y RIIb-2)和 Fe y RIIc ;以及 Fe Y RIII (CD16)，包括同种型Fe Y RIIIa (包括异型V158和F158)和Fe YRIIIb (包括异型Fe Y RIIIb-NAl和 Fe YRIIIb-NA2XJefferis 等人，2002，Immunol Lett 82:57-65)，以及任何未发现的人Fe Y R或Fe Y R同种型或异型。小鼠Fe Y R包括但不限于Fe y RI (CD64)、Fe y RII (CD32)、FcyRIII (CD 16)、和Fe Y RII1-2 (CD 16-2)、以及任何未发现的小鼠Fe Y R或Fe Y R同种型或异型。Fe Y R可以来自任何生物，所述生物包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、和猴。本文使用的“Fe配体”或“Fe受体”表示来自任何生物的分子(例如多肽)，所述分子结合抗体的Fe区以形成Fe-配体复合物。Fe配体包括但不限于Fe y R、FcRn> Clq、C3、甘露聚糖结合性凝集素、甘露糖受体、金黄色葡萄球菌A蛋白、金黄色葡萄球菌G蛋白、和病毒性Fe y R0 Fe配体还包括Fe受体同源物(FcRH)，它们是与Fe Y R同源的Fe受体家族(Davis 等人，2002，Immunological Reviews 190:123-136)。Fe 配体可以包括结合Fe 的未发现的分子。本文使用的“IgG”表示属于基本上由识别的免疫球蛋白Y基因编码的抗体类别的多肽。在人中，此类别包括IgGl、IgG2、IgG3、和IgG4。在小鼠中，此类别包括IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3。本文的“免疫球蛋白(Ig) ”表示这样基本上由免疫球蛋白基因编码的一个或多个多肽组成的蛋白。免疫球蛋白包括但不限于抗体。免疫球蛋白可以具有多个结构形式，包括但不限于全长抗体、抗体片段、和各个免疫球蛋白结构域。本文的“免疫球蛋白(Ig)结构域”表示以由蛋白结构领域技术人员确认的确切结构实体存在的免疫球蛋白的区域。Ig结构域通常具有特征性的￠-夹心折叠拓扑。抗体IgG类别中的已知Ig结构域为VH、C Y I、C Y 2、C Y 3、VLJP CL。本文的“氨基酸修饰”表示多肽序列中的氨基酸置换、插入、和/或缺失。本文的“氨基酸置换”或“置换”表示亲本多肽序列中特定位置处的氨基酸被其它氨基酸替换，例如，置换I332E是指变体多肽(此时为恒定重链变体)中332位处的异亮氨酸被谷氨酸替换。可以指定或可以不指定野生型残基。对于前述实例，332E表示332位被谷氨酸置换。对于本文目的，通常通过斜线将多个置换分开。例如，239D/332E是指包含置换239D和332E的双变体。本文使用的“氨基酸插入”或“插入”表示亲本多肽序列中特定位置处的氨基酸加入。例如，插入-236G指定236位处插入甘氨酸。本文使用的“氨基酸缺失”或“缺失”表示亲本多肽序列中特定位置处的氨基酸去除。例如，G236-指定236位处缺失甘氨酸。本文可互换地使用的“亲本多肽”、“亲本蛋白”、“前体多肽”、或“前体蛋白”表示之后经修饰以产生变体的多肽，例如用作进行至少一个本文所述的氨基酸修饰的模板和/或基础的任何多肽。亲本多肽可以为天然存在的多肽、或者天然存在的多肽的变体或工程化形式。亲本多肽可以指多肽本身、包含亲本多肽的组合物、或编码亲本多肽的氨基酸序列。因此，本文使用的“亲本抗体”或“亲本免疫球蛋白”表示经修饰以产生变体的抗体或免疫球蛋白(例如亲本抗体可以包括、但不限于，包含天然存在的Ig的恒定区的蛋白)。

本文使用的“蛋白”或“多肽”表示至少两个共价连接的氨基酸，其包括蛋白、多肽、寡肽和肽。所述蛋白可以由天然存在的氨基酸和肽键、或合成的类肽结构组成，即“类似物”，例如类肽。本文使用的“位”或“位置”表示蛋白序列中的位置。可以顺序地或根据已建立的形式对位置进行编号,所述已建立的形式例如如Kabat中的EU索引(Kabat等人，1983)。如果无另外说明，则本文提到的位置根据EU索引进行编号。如本文所述地测定相应的位置，一般通过与其它亲本序列进行比对。本文使用的“残基”表示蛋白中的位置及其相关的氨基酸同一性。例如，丝氨酸239(还被称为Ser239和S239)为人抗体IgGl中239位的残基。本文使用的“靶抗原”或“靶物”或“抗原”表示被给定抗体的可变区特异地结合的分子。靶抗原可以为蛋白、碳水化合物、脂质、或其它化合物。本文使用的“靶细胞”表示表达靶抗原的细胞。本文使用的“可变区”表示包含一个或多个基本上由Vk、VX、和/或VH基因中任一个编码的Ig结构域的免疫球蛋白的区域，所述Vk、VA、和VH基因分别产生K、A、和重链免疫球蛋白遗传基因座。本文使用的“变体蛋白”、“蛋白变体”、“变体多肽”、或“多肽变体”表示与亲本多肽序列有至少一个氨基酸修饰区别的多肽序列。变体多肽可以指多肽本身、包含该多肽的组合物、或编码该多肽的氨基酸序列。在一个实施方式中，变体多肽与亲本多肽相比具有至少一个氨基酸修饰，例如与亲本相比的约I至约10个氨基酸修饰，例如约I至约5个氨基酸修饰。本文的变体多肽序列可以具有与亲本多肽序列的至少约80%同源性，例如至少约90%同源性、至少约95%同源性等。因此，本文使用的“变体抗体”或“抗体变体”表示与亲本抗体序列有至少一个氨基酸修饰区别的抗体序列。变体抗体或抗体变体可以指抗体多肽本身、包含抗体变体多肽的组合物、或编码该抗体变体多肽的氨基酸序列。因此，本文使用的“恒定重链变体”或“恒定轻链变体”或“Fe变体”分别表示在序列上与亲本序列有至少一个氨基酸修饰区别的恒定重链、恒定轻链、或Fe区多肽或序列。本文的“野生型”或“WT”表示在自然中发现的包括等位基因变化的氨基酸序列或核苷酸序列。WT蛋白、多肽、抗体、免疫球蛋白、IgG等具有未被有意地修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。对于本发明中讨论的全部免疫球蛋白重链恒定区位置，编号根据如Kabat中的 EU 索引(Kabat 等人，1991，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, 5th Ed,United States Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda)。“如Kabat中的EU索引”是指人IgGl EU抗体的残基编号，如Edelman等人，1969，Biochemistry 63 78-85 中所述。“抗原”为能够在动物中产生抗体反应且被所得抗体识别的大分子。抗原和半抗原二者都包含至少一个抗原决定簇或“表位”，所述抗原决定簇或“表位”为结合抗体的抗原或 半抗原的区域。通常，半抗原上的表位为整个分子。本文使用的术语“样品”是指材料的等分试样，通常为源自生物材料的生物基质、水性溶液或水性悬浮液。要通过本发明的方法测定分析物的存在的样品包括，例如，细胞、组织、匀浆、裂解物、提取物、和纯化的或部分纯化的蛋白和其它生物分子以及它们的混合物。通常用于本发明的方法的样品的非限制性实例包括人和动物体液，例如全血、血清、血浆、脑脊液、痰、支气管洗液、抽取液、尿液、精液、淋巴液以及呼吸道、肠道和泌尿生殖道的各种外部分泌物、、泪液、唾液、乳液、白血细胞、骨髓瘤等；生物流体，例如细胞培养物上清液；可或不可固定的组织样本；以及可或不可固定的细胞样本。用于本发明的方法的样品将基于测定格式以及要测定的组织、细胞、提取物、或其它材料(尤其是生物材料)的性质而变。用于从细胞或样品制备蛋白提取物的方法是本领域公知的，并且能够易于修改以便获得与本发明的方法相容的样品。本文使用的“特异地结合”和“特异结合”表示，基于靶分子上表位的识别，抗体与其靶物(分析物)结合。相比于抗体结合可能存在的其它化合物，抗体优选以更高结合亲和力识别和结合靶分子。在本发明的多个实施方式中，“特异地结合”可以表示，相比于抗体结合与靶分子不相关的分子，抗体以至少约IO6倍大的亲和力、优选至少约IO7倍大的亲和力、更优选至少约IO8倍大的亲和力、和最优选至少约IO9倍大的亲和力与靶分子结合。通常，特异结合是指，相比于非特异结合，亲和力在约IO6倍至约IO9倍大的范围内。在一些实施方式中，特异结合的特征可在于是非特异结合IO9倍大的亲和力。结合亲和力可以通过任何适合的方法进行测定。此类方法是本领域已知的，包括、但不限于表面等离子共振和等热滴度量热法。在具体实施方式
中，抗体独特地识别和结合靶分析物。本文使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体的群体获得的抗体，SP，除了可以以微小量存在的可能的天然存在的突变，组成该群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体为高度特异的，为抗单一的抗原位点。并且，与通常包括抗不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物相比，每个单克隆抗体抗抗原上的单一的决定簇。除了它们的特异性以外，单克隆抗体的有利之处还在于，它们可以通过杂交瘤培养进行合成，未被其它免疫球蛋白污染。修饰语(单克隆)表示从基本上同质的抗体群获得的抗体的性质，而不被理解为要求通过任何特定方法产生该抗体。单克隆抗体能够包括“嵌合的抗体(美国专利 No. 4，816，567 ;和 Morrison 等人(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855)和人源化的抗体(Jones 等人(1986)Nature, 321:522-525 ；Reichmann 等人(1988)Nature, 332:323-329 ；Presta(1992)Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596)。
可以通过任何通过培养的连续细胞系产生抗体分子的技术获得单克隆抗体。这些技术包括、但不限于Koehler和Milstein (1975), Nature, 256:495-7的杂交瘤技术；和美国专利No. 4, 376, 110)、人B-细胞杂交瘤技术(Kosbor,等人(1983), ImmunologyToday, 4:72 ；Cote 等人(1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2026-30)以及 EBV-杂交瘤技术(Cole 等人(1985)，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, AlanR. Liss, Inc. , New York, pp. 77-96)。对祀化合物特异的单克隆抗体的制备还描述于Harlow和Lane，eds. (1988)Antibodies-A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory,第6章。这种抗体可以为任何免疫球蛋白类别，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和其任何亚类。产生mAb的杂交瘤可以在体外或体内培养。体内产生高滴度的mAbs使其成为非常有效的生产方法。“多克隆抗体”为异质的抗体分子群，其源自用抗原或其抗原功能衍生物免疫的动物的血清。为了产生多克隆抗体，宿主动物例如兔、小鼠和山羊，可以通过用任选地补充了佐剂的抗原或半抗原-载体缀合物进行注射而免疫。 能够改变针对产生单链抗体而描述的技术(美国专利No. 4，946，778 ；Bird(1988)，Science 242:423-26 ;Huston 等人(1988), Proc. Natl.Acad.Sci.USA, 85:5879-83 ;和 Ward 等人(1989)，Nature, 334:544-46)，以产生基因-单链抗体。通常通过经由氨基酸桥连接Fv区的重和轻链片段，从而得到单链多肽。可以通过已知技术产生识别特定表位的抗体片段。例如，此类片段包括但不限于能够通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab’)2片段和能够通过还原F (ab') 2片段的二硫键产生的Fab片段。或者，可以构建Fab表达文库(Huse等人(1989), Science, 246:1275-1281)以允许快速且简单地识别具有所需特异性的单克隆Fab片段。本文可互换地使用的术语“多核苷酸”和“核酸(分子)”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，包括天然存在的和非天然存在的核酸。多核苷酸可以含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或它们的类似物。用于选择和制备核酸的方法有多种，详细描述于标准生物分子手册中。通常的方式是从现有模板DNA开始的制备PCR和色谱纯化或逐步合成人工核酸。通常，核酸分子在本文是指DNA分子。本文结合氨基酸置换使用的术语“至少一个”涉及至少I、优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50 或多个氨基酸置换。 本文可互换地使用的术语“接触”或“孵育” 一般是指使一种组分、反应物、分析物或样品接触另一种。本文使用的术语“检测”是指验证给定分子存在与否的任何方法。用来实现此目的的技术可以包括、但不限于免疫测定，例如ELISA和免疫PCR(IPCR)。血液恶性病为影响血液、骨髓、和淋巴结的癌症的癌症类型。血液恶性病可以源自下述两种主要血细胞谱系中的任一种骨髓细胞系和淋巴细胞系。正常情况下，骨髓细胞系产生粒细胞、红细胞、凝血细胞、巨噬细胞和肥大细胞；淋巴细胞系产生B、T、NK和血浆细胞。淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、和骨髓瘤来自淋巴系，而急性和慢性骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征和骨髓增殖性疾病来源于骨髓。白血病为血液或骨髓的癌症，特征在于血细胞的异常增殖，所述血细胞通常为白血细胞(白细胞)。在临床和病理学上，将白血病细分成多个大组。急性白血病的特征在于不成熟血细胞的快速增加。此种拥挤现象使骨髓无法产生健康的血细胞。急性白血病需要立刻治疗，所述急性白血病由恶性细胞的快速发展和积聚导致的，然后所述恶性细胞会涌进血流中并且扩张到身体其它器官。急性形式的白血病为儿童白血病的最常见形式。慢性白血病通过相对较成熟、但仍异常的白血细胞的过多积聚进行区别。通常需要数月或数年发展，所述细胞以比正常细胞高得多的速度产生，从而在血液中产生多种异常白血细胞。尽管急性白血病必须立刻治疗，但是慢性形式优势在之前之前监测一段时间，以确保治疗效果最大。慢性白血病多发生于老年人中，但理论上可以发生于任何年龄群中。此外，根据哪种血细胞被影响来细分所述疾病。这种分类将白血病分成淋巴母细胞性或淋巴细胞性白血病和骨髓或骨髓性白血病在淋巴母细胞性或淋巴细胞性白血病中，癌性改变发生在正常情况下发展形成淋巴细胞的骨髓细胞类型中，所述淋巴细胞为对抗感染的免疫系统细胞。大多数淋巴细胞性白血病涉及特殊亚型的淋巴细胞，即B细胞。在骨髓或骨髓性白血病中，癌性改变发生在正常情况下发展形成红血细胞、一些其它类型的白细胞和血小板的骨髓细胞类型中。急性骨髓性白血病(AML)，也被称为急性骨髓性白细胞，为血细胞骨髓系的癌症， 特征在于在骨髓中积聚并且干扰正常血细胞产生的异常白血细胞的快速生长。AML为影响成人的最常见急性白血病，并且其发生随年龄增长而增加。尽管AML为相对罕见的疾病，但是由于占美国癌症死亡的大约1.2%，因此预期其发生率随人群年龄增长而增加。AML的症状由正常骨髓被替换为白血病细胞而造成,这红血细胞、血小板和正常白血细胞的下降。这些症状包括疲劳、呼吸短促、易于擦伤和出血、以及感染风险提高。尽管AML的若干风险因素已得到鉴定，但是该疾病的成因仍不清楚。作为急性白血病，AML快速发展，并且如果未得到治疗，通常在数周或数月内致命。AML具有若干亚型；治疗在预后在不同亚型之间改变。取决于亚型，五年存活期为15 - 70%,复发率为 78 - 33%。单克隆抗体为一类治疗性蛋白，其可以用来治疗细胞增殖性疾病和障碍，特别是影响造血系统的那些。抗体的多个有利特性，包括但不限于对于靶物的特异性、介导免疫效应物机制的能力、和血清半衰期长、使抗体成为有力的治疗药。本发明描述了抗原癌基因FLT3的抗体。已发现FLT3在白血病(特别是AML)的发作和进展中起重要作用，并且在AML患者中采用FLT3抑制剂的初期试验已示出了令人鼓舞的结果。然而，仍需要可用于治疗白血病、例如AML的抗FLT3抗体。抗FLT3抗体的临床成功取决于它们的可能作用机制。存在多个可行机制，抗体通过这些机制介导细胞作用，包括通过阻断所需生长通路而抗增殖，导致细胞凋亡的细胞内信号传递、受体的减量调节和/或周转的增加、补体依赖性的细胞毒性(CDC)、抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性的细胞介导的吞噬(ADCP)和适应性免疫反应白勺促进(Cragg 等人，1999，Curr Opin TmmunoI 11 541-547，Glennie 等人，2000，ImmunolToday 21 403-410)。抗体效用可以是由于这些机制的组合，并且它们在肿瘤临床治疗中的相对重要性似乎是癌症依赖性的。Fc Y R介导的效应物功能对于一些抗体活性的重要性已经在小鼠中(CI yn e s等人，1998，Proc Natl Acad Sci U S A 95652-656，Clynes 等人，2000，Nat Med 6443-446)和观察到的在人的临床效用和它们的FcyRIIIa的高(V158)或低(F158)亲和力多态形式的异型之间的相关性(Cartron 等人，2002, Blood 99754-758，ffeng&Levy, 2003, Journalof Clinical Oncology, 213940-3947)中得到了证实。这些数据一起表明，进行最优化以与某些Fe Y R结合的抗体可以更好地介导效应物功能，并且由此更有效地破坏患者中的靶细胞。因而，用于增强抗体的抗肿瘤效能的令人鼓舞的方式为通过增强它们介导细胞毒性效应物功能的能力，所述细胞毒性效应物功能例如ADCC、ADCP、和⑶C。此外，抗体能够经由生长抑制性或细胞凋亡信号传递而介导抗肿瘤机制，所述生长抑制性或细胞凋亡信号传递可以在抗体与其在肿瘤细胞上的靶物结合时发生。这种信号传递可以在抗体被经由Fe Y R呈递至与免疫细胞结合的肿瘤细胞时而强化。因此，抗体与Fe Y R的亲和力提高可以使得抗增殖作用增强。在修改与Fe Y R具有选择性增强的结合的抗体以提供增强的效应物功能方面已经取得了一定成功。使用氨基酸修饰已经实现了抗体工程化以最优化效应物功能(参见例如美国专利申请US 2004-0132101或美国专利申请2006-0024298)。 遗憾的是，对于给定靶抗原来说哪个先验作用机制是最优的尚未知。并且，哪个抗体能够介导抗靶细胞的给定作用机制也是未知的。在一些情况下，缺乏抗体活性，无论是Fv介导的还是Fe介导的，可以是由于靶向靶抗原上的表位难以介导这样的活性而导致的。在其它情况下，被靶向的表位可以是对期望的Fv介导的或Fe介导的活性顺从的，但是亲和力(Fv区对抗原的亲和力或Fe区对Fe受体的亲和力)可能不足。为了解决此问题，本发明描述了对抗FLT3抗体的修饰，以提供Fe介导的活性，例如从头产生的或最优化的Fe介导的活性。抗体为结合特定抗原的免疫蛋白。在大多数哺乳动物中，包括人和小鼠，由成对的重和轻多肽链构建抗体。轻和重链可变区在抗体之间显示出显著的序列多变性，并且负责结合靶抗原。每个链由各个免疫球蛋白(Ig)结构域组成，因而将通用术语免疫球蛋白用于此类蛋白。天然抗体结构单元通常包含四聚体。每个四聚体通常由相同两个对的多肽链组成，每对具有一个“轻”链(分子量通常为约25kDa)和一个“重”链(分子量通常为约50_70kDa)轻链和重链中的每一个均由两个不同的区域组成，该区域称为可变区和恒定区。对于IgG类别的免疫球蛋白来说，重链由4个免疫球蛋白结构域组成，所述4个免疫球蛋白结构域从N-到C-端以VH-CH1-CH2-CH3的顺序连接，分别指重链可变结构域、重链恒定结构域I、重链恒定结构域2、和重链恒定结构域3 (也称为VH-C y I-C y 2-C y 3，分别指重链可变结构域，恒定、I结构域、恒定、2结构域、和恒定Y 3结构域)。IgG轻链由2个免疫球蛋白结构域组成，所述2个免疫球蛋白结构域从N-到C-端以以VL-CL的顺序连接，分别指轻链可变结构域和轻链恒定结构域。恒定区显示出较低的序列多变性，并且负责结合多个天然蛋白以引发重要的生物化学事件。抗体的可变区含有分子的抗原结合决定簇，因而决定了抗体对其靶抗原的特异性。如此命名可变区的原因是，它与相同类别内的其它抗体在序列上差别最大。在可变区中，重链和轻链的每个V结构域都集中3个环，以形成抗原结合位点。每个环都被称为互补决定区(下文称为“CDR”),在互补决定区中，氣基Ife序列的变化最显者。总共存在6个CDR,每个重和轻链各 3 个，命名 SVh CDRUVh CDR2、Vh CDR3、VlCDR1、Vl CDR2、和 Vl CDRStjCDR 外部的可变区称为框架(FR)区。尽管不像CDR那样多变，在不同抗体之间在FR区中确实发生序列可变性。总的来说，抗体的此特征结构提供了稳定的支架(FR区)，在这个支架上，免疫系统可以探求显著的抗原结合多样性(CDR)，从而获得对于大量抗原的特异性。对于多个来自不同生物的可变区片段，可得到多个高分辨率的结构，一些未结合，一些与抗原复合。抗体可变区的序列和结构特征例如公开于Morea等人，1997，Biophys Chem 68:9-16 ；Morea等人，2000, Methods 20:267-279,而抗体的保守特征例如公开于Maynard等人，2000, AnnuRev Biomed Eng 2:339-376。通常通过恒定区决定，将抗体分类，也称为同种型。人恒定轻链被分类为kappa (C K )和 Iambda(CX)轻链。人重链被分类为 mu、delta、gamma、alpha、或 epsilon,且分别定义了抗体的同种型为IgM、IgD、IgG、IgA、和IgE。IgG类别最常用于治疗用途。本文使用的“IgG”表示属于基本上由识别的免疫球蛋白Y基因编码的抗体类别的多肽。在人中，这一类包括亚类IgGl、IgG2、IgG3、和IgG4。在小鼠中，这一类包括亚类 IgGU IgG2a、IgG2b和IgG3。IgM具有的亚类包括、但不限于IgMl和IgM2。IgA具有若干亚类，包括但不限于IgAl和IgA2。因此，本文使用的“同种型”表示通过它们的恒定区的化学和抗原特征定义的免疫球蛋白的任何类别或亚类。已知的人免疫球蛋白同种型为IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAU IgA2、IgMU IgM2、IgD、和 IgE。对于本发明同样有用的可以是作为天然人IgG同种型的混合组合物的IgG。效应物功能例如ADCC、ADCP、CDC、和血清半衰期在不同类别的抗体之间有显著差别，所述不同类别的抗体包括例如人 IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAU IgA2、IgD、IgE、IgG、和 IgM(Michaelsen 等人,1992, Molecular Immunology, 29 (3) : 319-326).多个研究已经探索了 IgGl、IgG2、IgG3、和IgG4变体，以便研究它们之间的效应物功能差别的决定簇。参见例如 Canf ieId&Morrison, 1991, J. Exp. Med. 173:1483-1491 ；Chappel 等人,1991, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88(20) :9036-9040 ；Chappel 等人，1993，Journal of BiologicalChemistry 268:25124-25131 ;Tao 等人，1991，J.Exp. Med. 173:1025-1028 ;Tao 等人,1993, J. Exp. Med. 178:661-667 ；Redpath 等人,1998, Human Immunology, 59, 720-727。如标题为“IgGImmunoglobulin Variants with Optimized Effector Function”的美国专利申请2006-0134105所述，可以在抗体中进行氨基酸修饰，所述氨基酸修饰包括来自其它免疫球蛋白类别的恒定区。这种工程化的混合IgG组合物可以提供改进的效应物功能特定，包括改进的ADCC、吞噬、⑶C、和血清半衰期。本领域公知，免疫球蛋白多态性存在于人群中。通过IGHG1、IGHG2和IGHG3基因测定Gm多态性，所述IGHGl、IGHG2和IGHG3基因具有编码异型的抗原决定簇的等位基因，所述异型的抗原决定簇称为人IgGl、IgG2和IgG3分子的标志物的Glm、G2m、和G3m异型(未在Y4链上发现Gm异型)。标志物可以被分类为“异型”和“同种异型(isoallotype)”。在取决于同种型之间的强序列同源性的不同血清学基础上对这些标志物进行了区分。异型为Ig基因的等位基因形式指定的抗原决定簇。异型表示不同个体的重链或轻链的氨基酸序列中的轻微差异。即使是单个氨基酸差异也能够产生异型的决定簇，尽管在许多情况下发生了若干氨基酸置换。异型为亚类的等位基因之间的序列差别，借此抗血清仅识别该等位基因差异。同种异型为一个同种型中的等位基因，所述同种型产生与一个或多个其它同种型的非多态同源区共有的表位，并且正由于此，抗血清将与相关的异型和相关的同源同种型二者反应(Clark, 1997, IgG effector mechanisms, Chem. Immunol. 65-88-110，Gorman&Clark, 1990, Semin. Immunol. 2(6) : 457-66)。人免疫球蛋白的等位基因形式已得到了充分表征。此外，其它多态性也得到了表征(Kim等人,2001, J. MoI. Evol. 541-9,通过引用全文并入本文)。目前，已知18个Gm异型:Glm(l、2、3、17)或 Glm(a、x、f、z)，G2m(23)或 G2m(n)，G3m(5、6、10、11、13、14、15、16、21、24、26、27、28)或 G3m(bl、c3、b5、b0、b3、b4、s、t、gl、c5、u、v、g5) (Lefranc 等人,Thehuman IgG subclasses:molecular analysis of structure, function and regulationPergamon, Oxford, pp 43-78 (1990)，Lefranc, G 等人，1979，Hum. Genet. : 50，199-21 I)。以固定组合遗传的异型称为Gm单倍型。本发明的抗体可以基本上由任何异型、同种异型、或任何免疫球蛋白基因的单倍型编码。本发明的抗体可以基本上由来自任何生物的基因编码，所述生物例如哺乳动物，包括但不限于人；啮齿类动物，包括但不限于小鼠和大鼠；兔类，包括但不限于兔和野兔；骆驼科动物，包括但不限于骆驼、美洲鸵、单峰骆驼；和非人灵长类动物，包括但不限于猿、阔鼻猿(新世界猴)、猕猴(旧世界猴)以及类人总科动物，包括长臂猿、Lesser、和巨猿。 在一个实施方式中，本发明的抗体基本上是人的抗体。本发明的抗体可以基本上由属于任何抗体类别的免疫球蛋白基因编码。在一个实施方式中，本发明的抗体包含属于IgG抗体类别的序列，所述IgG抗体类别包括人亚类IgGl、IgG2、IgG3、和IgG4。在一个替代实施方式中中，本发明的抗体包含属于IgA (包括人亚类IgAI和IgA2)、IgD、IgE、IgG、或IgM抗体类别的序列。本发明的抗体可以包含超过一个蛋白链。即，本发明可以可以利用为单体或寡聚体(包括同质或异质寡聚体)的抗体。在一个实施方式中，本发明的抗体基于人IgG序列，因而人IgG序列用作与其它序列相比较的“基础”序列，所述其它序列包括但不限于来自其它生物的序列，例如啮齿类动物和灵长类动物的序列，以及来自其它免疫球蛋白类别如IgA、IgE、IgD、IgM等的序列。考虑到的是，尽管本发明的抗体在一个亲本抗体的情况下进行工程化，该变体可以在另一个第二亲本抗体的情况下进行工程化或转化至另一个第二亲本抗体的情况。此目的通过下述方式实现基于第一和第二抗体的序列之间的序列或结构同源性，测定2个抗体之间“相同”或“相应”残基和置换。为了建立同源性，将本文所述的第一抗体的氨基酸序列直接与第二抗体的序列进行比较。在比对序列后，使用一个或多个本领域已知的同源性比对程序(例如使用物种之间的保守残基)，允许为了进行比对所必需的插入和缺失(即，通过主观插入和缺失而避免消除保守残基)，限定了与第一抗体的主序列中特定氨基酸等同的残基。保守残基的比对可以保留100%的此类残基。然而，大于75%或少至50%的保守残基的比对同样足以限定等同残基。通过测定处于结构已确定的抗体的四级结构水平的第一和第二抗体之间的结构同源性，也可以限定等同残基。在这种情况下，等同残基限定为这样的残基对于所述残基，比对后，亲本或前体的特定氨基酸残基的两个或更多个主链原子的原子坐标(N于N、CA于CA、C于C和0于0)在0. 13nm内，例如0. lnm。在最佳模型已经定向和定位从而给出蛋白的非氢蛋白原子的原子坐标的最大覆盖度之后，完成了比对。无论如何测定等同或相应残基，并且无论抗体在那个亲本抗体中进行同一性，想要传递的是，本发明发现的抗体可以被工程化为与该抗体具有显著的序列或结构同源性的任何第二亲本抗体。因而，例如，如果产生了变体抗体，其中亲本抗体为人IgGl，通过使用上文描述的方法或用于测定等同残基的其它方法，所述变体抗体可以被工程化人IgG2亲本抗体、人IgA亲本抗体、小鼠IgG2a或IgG2b亲本抗体等。并且，如上所述，亲本抗体的情况不影响将本发明的抗体转化成其它亲本抗体的能力。例如，被工程化为靶向一个抗原表位的人IgGl抗体的变体抗体可以被转化成祀向不同抗原表位的人IgG2抗体,等等。在IgG类别的免疫球蛋白中，在重链中存在若干个免疫球蛋白结构域。本文的“免疫球蛋白(Ig)结构域”表示具有确切的四级结构的免疫球蛋白区域。本发明中具有意义的是恒定重链结构域，包括，恒定重(CH)结构域和铰链区。在IgG抗体的 况下，IgG同种型各自具有3个CH区根据如Kabat中的EU索引，“CH1”是指118-220位，“CH2”是指237-340位，“CH3”是指341-447位。本文的“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”或“免疫球蛋白铰链区”表示包含抗体的第一和第二恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。类似地，IgG CHl结构域终止于EU 220位，IgGCH2结构域开始于残基EU 237位。因而对于IgG来说，本文限定铰链包括221 (IgGl中的D221)至236 (IgGl中的G236)，其中编号根据如Kabat中的EU索引。在一些实施方式中，例如在Fe区的情况下，包括较低铰链，其中“较低铰链区”一般是指226或230位。如本文定义的恒定重链是指CHl结构域的N-端至CH3结构域的C-端，因而包括118-447位，其中编号根据EU索引。恒定轻链包括单个结构域，本文定义的是指Ck或CX的108-214位，其中编号根据EU索引。特别包括在“抗体”定义内的是全长抗体。本文的“全长抗体”表示构成抗体的天然生物学形式的结构，包括可变区和恒定区。例如，在大多数哺乳动物包括人和小鼠中，IgG类别的全长抗体为四聚体并且由相同两对的2个免疫球蛋白链组成，每对具有一个轻链和一个重链，每个轻链包含免疫球蛋白结构域VL和CL，每个重链包含免疫球蛋白结构域VH、CHl (C y I)、CH2 (C y 2)、和CH3 (C Y 3)。在一些哺乳动物例如骆驼和美洲鸵中，IgG抗体可以仅由两个重链组成，每个重链包含与Fe区连接的可变结构域。或者，所述抗体能够为多种结构，包括、但不限于抗体片段。抗体片段包括但不限于双特异性抗体、微抗体、结构域抗体、合成的抗体、抗体类似物、嵌合抗体、融合抗体(有时称为“抗体缀合物”)和每一种的片段。特定抗体片段包括、但不限于，(i)由VL、VH、CL和CHl结构域组成的Fab片段，(ii)由VH和CHl结构域组成的Fd片段，(iii)由单个抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段，(iv)由单个可变区组成的dAb片段，(v)分离的CDR区，(vi)F(ab’)2片段，一种包含2个连接的Fab片段的二价片段，(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽连接物相连，所述肽连接物允许2个结构域相连以形成抗原结合位点，(viii)双特异性单链Fv 二聚体和(ix) “双价抗体”或“三价抗体”，为通过基因融合构建的多价或多特异性片段。抗体片段可以是修饰的。例如，可以通过掺入连接VH和VL结构域的二硫键来稳定所述分子。抗体形式和结构的实例描述于 Holliger&Hudson, 2006，Nature Biotechnology 23(9):1126-1136，and Carter2006, Nature Reviews Immunology 6:343-357 和本文引用的参考文献中。本发明的抗体可以包括多特异性抗体，显著双特异的抗体，有时也称为“双价抗体”。这些是结合2个或更多个不同抗原的抗体。双价抗体能够以本领域已知的多种方式制备，例如化学地制备或来自杂交的杂交瘤。在一个实施方式中，所述抗体为微抗体。微抗体为微型化的抗体状蛋白，其包含与CH3结构域连接的scFv。在一些情况下，所述scFv能够连接至Fe区，并且可以包含一些或全部铰链区。多特异性抗体的描述参见Hol I iger&Hudson, 2006, Nature Biotechnology 23 (9) : 1126-1136 和本文引用的参考文献。在一个实施方式中，本发明的抗体为抗体片段。特别有意义的是包含Fe区、Fe融合物和重链的恒定区(CH1-铰链区-CH2-CH3)的抗体。本发明的抗体可以包括Fe片段。本发明的Fe片段可以包含Fe区的1-90%,例如10-90%,30-90%等。因而，例如，本发明的Fe片段可以包含IgGlC Y 2结构域、IgGl C Y2结构域和铰链区、IgGl C Y3结构域等等。在一个实施方式中，本发明的Fe片段还包含融合伴侣(融合伴侣)，从而有效地使其成为Fe片段融合蛋白。Fe片段可以含有或可以不含有含有额外多肽序列。免疫原性是针对被认定为外来的物质的一系列复杂反应，可以包括产生中和抗体和非中和抗体、形成免疫复合物、补体激活、肥大细胞激活、炎症、超敏反应和过敏。若干因素能够促成蛋白免疫原性，包括但不限于蛋白序列、给药的途径和频率、和患者群。免疫原性可以在多个方面限制蛋白治疗药的效用和安全性。通过形成中和抗体，可以直接降低效用。还可以间接降低所述效用，如与中和或非中和抗体结合，通常导致其从血清中快速清 除。当出现免疫反应时，可能导致严重副作用，甚至死亡。因而在一个实施方式中，使用蛋白工程化来降低本发明的抗体的免疫原性。在一些实施方式中，支架组分可以是来自不同物种的混合物。该抗体可以为嵌合抗体和/或人源化的抗体。通常，“嵌合抗体”和“人源化的抗体”均是指组合来自超过一个物种的区域的抗体。“嵌合抗体”通常包括来自小鼠(在一些情况下为大鼠)的可变区和来自人的恒定区(Morrison 等人，1984，Proc Natl Acad Sci USA 816851-6855)。本文使用的“人源化的”抗体表示包含人框架区(FR)和一个或多个来自非人(通常为小鼠或大鼠)抗体的互补决定区(CDRs)的抗体。提供的CDR非人抗体称为“供体”，提供框架的人免疫球蛋白称为“受体”。人源化主要依赖于将供体CDR接枝到受体(人)VL和VH框架上(Winter US 5，225，539)。这种策略称为“CDR接枝”。通常需要将所选受体框架残基“回复突变”到相应的供体残基上，以获得在初始接枝的构建体中丢失的亲和力(US5，693，762)。最佳地，人源化的抗体还将包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分，通常为人免疫球蛋白的至少一部分，因而通常将包含人Fe区。用于人源化和重塑非人抗体的多种技术和方法是本领域公知的(参见 Tsurushita&Vasquez, 2004, Humanization of MonoclonalAntibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA)和本文引用的参考文献)。降低非人抗体可变区的免疫原性的人源化或其它方法可以包括resurfacing方法，如例如描述于 Roguska等人，1994，Proc Natl Acad Sci USA91969-973。在一个实施方式中，可以采用基于选择的方法来人源化和/或亲和力成熟抗体可变区，即，从而提高可变区对其靶抗原的亲和力。其它人源化方法可以包括CDR的仅部分的接枝，包括但不限于描述于 Tan 等人，2002，J Immunol 1691119-1125，De Pascalis 等人，2002，JImmunol 1693076-3084中的方法。可以采用基于结构的方法来进行人源化和亲和力成熟，例如描述于美国专利7，117，096和相关的申请中的方法。在某些变型中，使用描述于2004年12月3日提交的标题为“Methods ofGenerating Variant Proteins with Increased Host String Content and CompositionsThereof”的美国专利申请2006-0008883中描述的方法，来降低抗体的免疫原性。
降低免疫原性的修饰可以包括降低源自亲本序列的经处理的肽与MHC蛋白的结合的修饰。例如，氨基酸修饰将被工程化以使得不存在预测以高亲和力与任何普遍存在的MHC等位基因结合的免疫表位或者所述免疫表位数量最少。鉴定蛋白序列中MHC结合表位的若干方法为本领域已知的，并且可以用来对本发明的抗体中的表位进行计分。参见，例如，美国专利申请2002-0119492、2004-0230380或2006-0148009和本文引用的参考文献。在一个替代实施方式中，本发明的抗体可以为完全人的，即抗体的序列完整地或基本上为人的。“完全人抗体”或“完整人抗体”是指这样的人抗体，所述人抗体具有源自人染色体的具有本文所述修饰的抗体基因序列。用于产生完全人抗体的多个方法是本领域已知的，包括使用转基因小鼠(Bruggemann等人，1997，Curr Opin Biotechnol 8:455-458)或采用选择方法的人抗体文库(Griffiths 等人，1998，Curr Opin Biotechnol 9:102-108)。本发明的抗体靶向FLT3，并且可以包含任何已知的或未发现的抗FLT3抗体的可变区(例如，⑶R)。本发明的抗体可以显示对FLT3的选择性。实例包括全长相对于剪接变体，细胞-表面相对于可溶形式，对于各种多态变体的选择性，或对于靶物的特定构象形式的选择性。本发明的抗体可以结合FLT3上的任何表位或区域，并且对于抗原的片段、变体 形式、剪接形式、或异常形式可以是特异的。已经发现多个靶向FLT3的可用于本发明的可用抗体。适合的FLT3抗体包括抗FLT3抗体4G8和BVlO，如美国专利No. 5，777，084和美国专利No. 6，156，882中所公开。本发明的抗体可以用于大量产品中。在一个实施方式中，本发明的抗体为治疗剂、诊断剂、或研究试剂。在一个实施方式中，本发明的抗体为治疗剂。本发明的抗体可以为单克隆或多克隆的抗体组合物中。在一个实施方式中，本发明的抗体用来杀灭带有靶抗原的靶细胞，例如癌症细胞。在一个替代实施方式中，本发明的抗体用来阻断、拮抗、或干扰(agonize)靶抗原。在一个替代实施方式中，本发明的抗体用来阻断、拮抗、或干扰靶抗原并杀灭带有靶抗原的靶细胞。将认识到的是，可变结构域的包括本文鉴定的⑶R的序列可以以任何组合组合在抗体中。此外,这些序列通过加入如本文公开的Fe区或Fe变体的全部或部分而独立地进行修饰。经修饰的序列还可以以任何组合组合在抗体中。本发明涉及包含修饰的抗体,其中所述修饰改变对一个或多个Fe受体的亲和力，和/或改变抗体介导一个或多个效应物功能的能力。本发明的修饰包括氨基酸修饰。本发明的发明人惊奇地发现，通过在已知抗FLT3抗体(例如4G8和BVlO (同上))的CH2结构域中引入氨基酸置换239D和332E，这些抗体的细胞杀灭活性可以被显著提高，或者甚至首次被检测到和产生。在一个实施方式中，所述氨基酸置换为S239D和I332E。这是令人吃惊的，因为通过实验方式证明，相同修饰一般不提高细胞杀灭活性。换而言之，在涉及不同靶抗原的不同抗体中，这些置换的引入对于细胞杀灭没有可测得的作用。此外，此类经修饰的抗体可以在重链恒定区位置221、222、223、224、225、227、228、230、231、232、233、234、235、236、237、238、240、241、243、244、245、246、247、249、255、258、260、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、278、280、281、282、283、284、285、286、288、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、313、317、318、320、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、333、334、335、336、和337处包含其它氨基酸修饰，已发现所述其它氨基酸修饰允许改变Fe Y R结合特性、效应物功能、和抗体的可能临床特性(参见2005年5月5日提交的标题为“OptimizedFe Variants” 的 USSN11/124, 620)。具体地讲，改变与一个或多个人Fe受体的结合的其它变体可以在重链恒定区中包含如本文所述的选自下述的氨基酸修饰221K、221Y、222E、222Y、223E、223K、224E、224Y、225E、225K、225W、227E、227G、227K、227Y、228E、228G、228K、228Y、230A、230E、230G、230Y、231E、231G、231K、231P、231Y、232E、232G、232K、232Y、233A、233D、233F、233G、233H、233I、233K、233L、233M、233N、233Q、233R、233S、233T、233V、233W、233Y、234A、234D、234E、234F、234G、234H、234I、234K、234M、234N、234P、234Q、234R、234S、234T、234V、234W、234Y、235A、235D、235E、235F、235G、235H、235I、235K、235M、235N、235P、235Q、235R、235S、235T、235V、235W、235Y、236A、236D、236E、236F、236H、236I、236K、236L、236M、236N、236P、236Q、236R、236S、236T、236V、236W、236Y、237D、237E、237F、237H、237I、237K、237L、237M、237N、237P、237Q、237R、237S、237T、237V、237W、237Y、238D、238E、238F、238G、238H、238I、238K、238L、238M、238N、238Q、238R、238S、238T、238V、238W、238Y、240A、2401、240M、240T、 241D、241E、241L、241R、241S、241W、241Y、243E、243H、243L、243Q、243R、243W、243Y、244H、245A、246D、246E、246H、246Y、247G、247V、249H、249Q、249Y、255E、255Y、258H1258S、258Y、260D、260E、260H、260Y、262A、262E、262F、2621、262T、263A、2631、263M、263T、264A、264D、264E、264F、264G、264H、2641、264K、264L、264M、264N、264P、264Q、264R、264S、264T、264W、264Y、265F、265G、265H、2651、265K、265L、265M、265N、265P、265Q、265R、265S、265T、265V、265W、265Y、266A、2661、266M、266T、267D、267E、267F、267H、2671、267K、267L、267M、267N、267P、267Q、267R、267T、267V、267W、267Y、268D、268E、268F、268G、2681、268K、268L、268M、268P、268Q、268R、268T、268V、268W、269F、269G、269H、2691、269K、269L、269M、269N、269P、269R、269S、269T、269V、269W、269Y、270F、270G、270H、2701、270L、270M、270P、270Q、270R、270S、270T、270W、270Y、271A、271D、271E、271F、271G、271H、2711、271K、271L、271M、271N、271Q、271R、271S、271T、271V、271W、271Y、272D、272F、272G、272H、272I、272K、272L、272M、272P、272R、272S、272T、272V、272W、272Y、273I、274D、274E、274F、274G、274H、274I、274L、274M、274N、274P、274R、274T、274V、274W、274Y、275L、275W、276D、276E、276F、276G、276H、276I、276L、276M、276P、276R、276S、276T、276V、276W、276Y、278D、278E、278G、278H、278I、278K、278L、278M、278N、278P、278Q、278R、278S、278T、278V、278W、280G、280K、280L、280P、280W、281D、281E、281K、281N、281P、281Q、281Y、282E、282G、282K、282P、282Y、283G、283H、283K、283L、283P、283R、283Y、284D、284E、284L、284N、284Q、284T、284Y、285D、285E、285K、285Q、285W、285Y、286E、286G、286P、286Y、288D、288E、288Y、290D、290H、290L、290N、290W、291D、291E、291G、291H、2911、291Q、291T、292D、292E、292T、292Y、293F、293G、293H、293I、293L、293M、293N、293P、293R、293S、293T、293V、293W、293Y、294F、294G、294H、294I、294K、294L1294M1294P、294R、294S、294T、294V、294W、294Y、295D、295E、295F、295G、295H、2951、295M1295N、295P1295R1295S、295T1295V1295W1295Y、296A、296D、296E、296G、296H12961、296K1296L1296M、296N1296Q1296R1296S1296T1296V、297D、297E1297F1297G、297H、2971、297K、297L、297M1297P1297Q1297R、297S1297T、297V、297W、297Y、298A、298D、298E、298F、298H、2981、298K、298M、298N、298Q、298R、298T、298W、298Y、299A、299D、299E、299F、299G、299H、2991、299K、299L、299M、299N、299P、299Q、299R、299S1299V、299W、299Y、300A、300D1300E、300G、300H、300K、300M、300N、300P、300Q、300R、300S、300T、300V、300W、301D、301E、301H、301Y、302I、303D、303E、303Y、304D、304H、304L、304N、304T、305E、305T、305Y、313F、317E、317Q、318H、318L、318Q、318R、318Y、320D、320F、320G、320H、320I、320L、320N、320P、320S、320T、320V、320W、320Y、322D、322F1322G、322H13221、322P1322S1322T、322V、322W、322Y、3231、324D、324F、324G、324H、3241、324L、324M、324P、324R、324T、324V、324W、324Y、325A、325D、325E、325F、325G、325H、3251、325K、325L、325M、325P、325Q、325R、325S、325T、325V、325W1325Y、326E、3261、326L、326P、326T、327D、327E、327F、327H、3271、327K、327L、327M、327N、327P、327R、327S、327T、327V、327W、327Y、328A、328D、328E、328F、328G、328H、3281、328K、328M、328N、328P、328Q、328R、328S、328T、328V、328W、328Y、329D、329E、329F、329G、329H、3291、329K、329L、329M、329N、329Q、329R、329S、329T、329V、329W、329Y、330E、330F、330G、330H、3301、330L、330M、330N、330P、330R、330S、330T、330V、330W、330Y、331D、331F、331H、3311、331L、331M、331Q、331R、331T、331V、331W、331Y、333A、333F、333H、333I、333L、333M、333P、333T、333Y、334A、334F、334I、334L、334P、334T、335D、335F 、335G、335H、335I、335L、335M、335N、335P、335R、335S、335V、335W、335Y、336E、336K、336Y、337E、337H、和337N，其中编号根据EU索引。并且，本发明的抗体可以在Fe区之外包含其它氨基酸修饰，例如在2005年3月 24 日提交的标题为 “Immunoglobulin variants outside the Fe region” 的美国专利7，276，585中描述的那些，包括处在下述重链恒定区位置的氨基酸修饰118、119、120、121、122、124、126、129、131、132、133、135、136、137、138、139、147、148、150、151、152、153、155、157、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、183、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、201、203、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、216、217、218、219、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、和 236 和 / 或包括在下述轻链恒定区位置的氨基酸修饰 108、109、110、111、112、114、116、121、122、123、124、125、126、127、128、129、131、137、138、140、141、142、143、145、147、149、150、151、152、153、154、155、156、157、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、176、180、181、182、183、184、185、187、188、189、190、191、193、195、197、199、200、202、203、204、205、206、207、208、210、211、212、和 213。这些修饰可以允许进一步改变Fe YR结合特性、效应物功能、和抗体的可能临床特性。具体地讲，改变与一个或多个人Fe受体的结合的变体可以在重链恒定区中包含如本文所述的选自下述的氨基酸修饰:118K、118E、118Y、119R、119E、119Y、120R、120E、1201、121E、121Y、121H、122E、122R、124K、124E、124Y、126K、126D、129L、129D、131G、131T、132D、132R、132L、133R、133E、133L、1351、135E、135K、136E、136K、1361、137E、138S、138R、138D、1391、139E、139K、147A、147E、148Y、148K、150L、150K、150E、151A、151D、152L、152K、153L、153D、155E、155K、1551、157E、157K、157Y、159K、159D、159L、160K、160E、160Y、161D、162D、162K、162Y、163R、164R、164E、164Y、165D、165R、165Y、166D、167A、168L、169E、171G、171H、172K、172L、172E、173T、173D、174E、174K、174Y、175D、175L、176D、176R、176L、177R、177E、177Y、178D、179K、179Y、179E、180K、180L、180E、183T、1871、187K、187E、1881、189D、189G、1901、190K、190E、191D、191R、191Y、192N、192R、192L、193F、193E、194R、194D、195R、195D、195Y、196K、196D、196L、197R、197E、197Y、198L、199T、199D、199K、201E、201K、201L、203D、203L、203K、205D、205L、206A、206E、207K、207D、208R、208E、208Y、209E、209K、209Y、210L、210E、210Y、211R、211E、211Y、212Q、212K、212H、212L、212Y、213N、213E、213H、213L、213Y、214N、214E、214H、214L、214Y、216N、216K、216H、216L、216Y、217D、217H、217A、217V、217G、218D、218E、218Q、218T、218H、218L、218Y、219D、219E、219Q、219K、219T、219H、219L、2191、219Y、205A、210A、213A、214A、218A、221K、221Y、221E、221N、221Q、221R、221S、221T、221H、221A、221V、221L12211、221F、221M、221W、221 Pl 221G、222E、222Y1 222D1 222N、222Q、222R、222S、222T、222H、222V、222L、2221、222F、222M1222W、222P、222G、222A、223D、223N、223Q、223R、223S、223H、223A、223V、223L、2231、223F、223M、223Y、223W1 223P、223G、223E1223K、224D、224N、224Q、224K、224R、224S、224T、224V1224L1 224U224F1 224M1 224W、224P、224G、224E、224Y、224A、225D、225N1 225Q、225R、225S、225H、225A1 225V、225L、2251、225F1 225M、225Y1 225P1 225G1 225E、225K、225W、226S、227E、227K、227Y、227G、227D、227N、227Q、227R、227S、227T、227H、227A、227V、227L、2271、227F、227M、227W、228K、228Y1228G、228D1 228N1 228Q1 228R、228T、228H1 228A、228V、228L、2281、228F、228M、228W、 229S、230A、230E、230Y、230G、230D、230N、230Q、230K、230R、230S、230T、230H、230V、230L、2301、230F1230M1 230W、231K、231P、231D、231N、231Q、231R、231S、231T、231 Hl 231V1231L、2311、231F、231M、231W、232E、232K、232Y、232G、232D、232N、232Q、232R、232S、232T、232H、232A、232V、232L、232I、232F、232M1 232W、233D、233N1 233Q、233R、233S、233T、233H、233A、233V、233L、2331、233F、233M、233Y、233W、233G、234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、2341、234V、234F1 234K、234R、234S、234A、234M、234G、235D、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、2351、235V、235F、235E、235K、235R1 235A1 235M、235W、235P、235G、236D、236E、236N、236Q1236K、236R、236S、236T、236H、236A、236V、236L、2361、236F1236M、236Y、236W、和236P，其中编号根据EU索引。具体地讲，改变与一个或多个人Fe受体的结合的变体可以在轻链恒定区中包含如本文所述的选自下述的氨基酸修饰:108D、108I、108Q、109D、109P、109R、110E、110I、110K、111E、111K、1 11 LI 112E、112R、112Y1 114D、1141、114K、116T、121 Dl 122R、122S、122Y、123L、123R、124E、125E、125K、126D、126L、126Q、127A、127D、127K、128N、129E、1291、129K、131T、137K、137S、138D、138K、138L、140E1 140H、140K、141 El 141K、142D、142G、142L、143A、143L、143R、145D、145T、145Y、147A、147E、147K、149D、149Y1150A、1511、151 Kl152L、152R、152S、153D、153H、153S、154E、154R、154V、155E、1551、155K、156A、156D、156R、157N、158D、158L、158R、159E1 159K1 159L、160K、160V、161 Kl 161 LI 162T、163E、163K、163T、164Q、165K、165P、165Y、166E、166M、166S1167K1 167L、168K、168Q、168Y、169D、169H、169S、1701、170N、170R、171A1 171N、171V、172E1 17211 172K、173K、173L、173Q、174A、176T、180E、180K、180S、181 Kl 182E、182R、182T、183D、183L、183P、184E、184K、184Y、1851、185Q、185R、187K、187Y1188E、188S、188Y、189D、189K、189Y、190E、190L、190R、191E、191R1191S、193E、193K、193S、1951、195K、195Q、197E、197K、197L、199E、199K、199Y、200S、202D、202R、202Y、203D、203L、203R、204T、205E、205K、206E、206I、206K、207A、207E、207L、208E、208K、208T、210A、210E、210K、211A、211E、211P、212E、212K、212T、213L、213R,其中编号根据EU索引。也可以用于本发明的其它置换包括调节Fe受体亲和力、Fe Y R介导的效应物功能、和/或补体介导的效应物功能的其它置换，包括但不限于298A、298T、326A、326D、326E、326W、326Y、333A、333S、334L、和 334A (US 6, 737, 056 !Shields 等人,Journal ofBiological Chemistry, 2001，276(9) :6591-6604 ；US 6，528，624 ；ldusogie 等人，2001，J.Immonologyl66:2571-2572)、247L、255L、270E、392T、396L、和 421K (USSN10/754, 922 ；USSN10/902，588)、和 280H、280Q、和 280Y (USSN10/370, 749)。在其它实施方式中，本发明的抗体可以与改变FcRn结合的恒定重链变体组合。这些包括以pH特异的方式修饰FcRn亲和力的修饰。具体地讲，提高与FcRnFc结合的变体包括但不限于250E、250Q、428L、428F、250Q/428L (Hinton 等人，2004，J. Biol.Chem. 279(8):6213-6216, Hinton 等人 2006 Journal of Immunology 176:346-356，USSN 11/102621, PCT/US2003/033037, PCT/US2004/011213, USSN 10/822300,USSN10/687118, PCT/US2004/034440, USSN 10/966673)、256A、272A、286A、305A、307A、 311A、312A、376A、378Q、380A、382A、434A (Shields 等人，Journal of BiologicalChemistry, 2001, 276(9):6591-6604, USSN 10/982470，US6737056, USSN 11/429793，USSN 11/429786， PCT/US2005/02951 1， USSN 11/208422)、252F、252T、252Y、252W、254T、256S、256R、256Q、256E、256D、256T、309P、311S、433R、433S、433I、433P、433Q、434H、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H、308T/309P/311S (DalI Acqua 等人 Journalof Immunology, 2002，169:5171-5180，US7083784, PCT/US97/03321，US6821505, PCT/US01/48432, USSN 11/397328)、257C、257M、257L、257N、257Y、279E、279Q、279Y、281 后的Ser 插入、283F、284E、306Y、307V、308F、308Y 311V、385H、385N、(PCT/US2005/041220, USSN11/274065，USSN 11/436，266) 204D、284E、285E、286D、和 290E (PCT/US2004/037929，通过引用全文并入本文)。在本发明的一些实施方式中，抗体可以包含同种型修饰(isotypicmodification),即在亲本IgG中修饰成替代IgG中的氨基酸类型。本发明提供针对多个治疗性相关特性进行了最优化的变体抗体。变体抗体包含相对于亲本抗体的一个或多个氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰提供一个或多个最优化的特性。因而，本发明的抗体为变体抗体。本发明的抗体在氨基酸序列上通过至少2个氨基酸修饰239D和332E与其亲本抗体相区别。此外，与亲本相比，本发明的变体抗体可以包含超过2个前述氨基酸修饰，例如与亲本相比约3至50个氨基酸修饰，例如约3至10个氨基酸修饰，约3至约5个氨基酸修饰等。因而变体抗体的序列和亲本抗体的序列是基本上同源的。例如,本文的变体抗体序列将与亲本抗体序列具有约80%的同源性，例如至少约90%同源性，至少约95%同源性等。本发明的抗体可以提供相对于亲本而最优化的效应物功能特性的氨基酸修饰。置换和最优化的效应物功能特性描述于美国专利申请2004-0132101、PCT申请US03/30249、和美国专利7，317，091 10/822, 231中。可以被最优化的特性包括但不限于对于Fe Y R增强或降低的亲和力。在一个实施方式中，最优化本发明的抗体以具有对于人活化Fe YR增强的亲和力，所述 FcyR 例如 FcyRI、FcyRIIa, FcyRIIc, Fe Y Rllla、和 Fe Y Rlllb。在一个实施方式中，最优化本发明的抗体以具有对于人Fe Y RIIIa增强的亲和力。在一个替代实施方式中，最优化所述抗体以具有对于人抑制性受体Fe YRIIb降低的亲和力。预期这些实施方式提供在人中具有增强的治疗特性的抗体，所述增强的治疗特性例如增强的效应物功能和更大的抗癌效能。在其它实施方式中，本发明的抗体对于一个或多个Fe Y R提供增强的亲和力，而对于一个或多个其它Fe Y R提供降低的亲和力。例如，本发明的抗体可以具有与Fe Y RIIIa增强的结合，而具有与Fe y RIIb降低的结合。或者，本发明的抗体可以具有与Fe y RIIa和Fe y RI增强的结合，而具有与Fe Y RIIb降低的结合。本发明的修饰可以增强对于一个或多个Fe YR的结合亲和力。本文使用的比亲本免疫球蛋白“更大的亲和力”或“改进的亲和力”或“增强的亲和力”或“更好的亲和力”表示，当在结合测定中变体和亲本多肽的量基本上相同时，Fe变体以比亲本多肽高的缔合平衡常数(Ka)或比亲本多肽低的离解平衡常数(Kd)与Fe受体结合。例如，与亲本多肽相比，具有改进的Fe Y R结合亲和力的Fe变体可以显示出Fe受体结合亲和力的约5倍至约1000倍，例如约10倍至约500倍的改进，其中Fe受体结合亲和力提供本领域已知的方法进行测定。因此，本文使用的与亲本Fe多肽相比的“降低的亲和力”表示，Fe变体以显著低于亲本 多肽的Ka或高于亲本多肽的Kd结合Fe受体。实施方式包括优化与人Fe Y R的Fe结合，然而在替代实施方式中，本发明的抗体对于来自非人生物的Fe Y R具有增强或降低的亲和力，所述非人生物包括但不限于啮齿类动物和非人的灵长类动物。针对与非人Fe Y R的结合进行最优化的抗体可用于实验中。例如，可以得到多种疾病的小鼠模型，使得能够测试例如给定药物侯选物的效用、毒性和药代动力学的特性。如本领域已知，可以将癌细胞移植或注入小鼠中，以模拟人的癌症，这种过程称为异种移植。包括对于一个或多个小鼠Fe Y R进行最优化的抗体的抗体测试，可以提供关于蛋白效用、其作用机制等的有价值的信息。本发明的抗体还可以对于增强的功能和/或无糖基化形式的溶解特性进行最优化。在一个实施方式中本发明的无糖基化的抗体以比亲本抗体的无糖基化形式大的亲和力结合Fe配体。Fe配体包括但不限于Fe Y R、Clq、FcRn、以及蛋白A和G，并且可以来自任何来源，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、或猴。在一个替代实施方式中，最优化抗体从而比亲本抗体的无糖基化形式更稳定和/或更可溶。本发明的抗体可以包含调节与除Fe Y R之外的Fe配体的相互作用的修饰，所述除Fe Y R之外的Fe配体包括但不限于补体蛋白、FcRnJP Fe受体同源物(FcRH)。FcRH包括但不限于 FcRHl、FcRH2、FcRH3、FcRH4、FcRH5、和 FcRH6 (Davis 等人，2002, Immunol. Reviews190:123-136)。本发明的抗体可以包含提供与效应物功能本身不特别相关的最优化的特性的一个或多个修饰。所述修饰可以为氨基酸修饰，或可以为酶促地或化学地进行的修饰。此类修饰可能提供抗体的一些改进，例如其稳定性、溶解性、功能、或临床用途的增强。本发明涵盖了通过将本发明的抗体与额外的修饰结合而进行的各种改进。在一个实施方式中，本发明的抗体的可变区可以为亲和力成熟的，也就是说，已在抗体的VH和/或VL结构域进行氨基酸修饰以增强抗体与其靶抗原的结合。这种类型的修饰可以改进与靶抗原结合的缔合和/或离解动力学。其它修饰包括改进对于靶抗原相对可供选择的靶物的选择性的那些修饰。这些包括改进对于在靶细胞相对于非靶细胞上表达的抗原的选择性的修饰。额外的修饰可以提供对于靶物识别特性的其它改进。此类特性可以包括、但不限于，特定动力学特性(即缔合和离解动力学)、对于特殊靶物相对于可供选择的靶物的选择性、和对于靶物的特定形式相对于可供选择形式的选择性。实例包括全长相对于剪接变体、细胞表面相对于可溶形式、对于各种多态变体的选择性、或对于靶抗原的特定构想形式的选择性。 本发明的抗体可以包含一个或多个提供抗体的降低或增强的内化的修饰。在一个实施方式中，本发明的抗体能够与额外的修饰一起使用或组合，以便降低经由与一个或多个Fe配体相互作用而发生的抗体细胞内化。预期此特性可以增强效应物功能，并可能降低本发明的抗体的免疫原性。或者，本发明的抗体能够直接与额外的修饰一起使用或组合，以便增强经由与一个或多个Fe配体相互作用而发生的抗体细胞内化。在一个实施方式中，进行修饰以改进本发明的抗体的生物物理特性，包括但不限于稳定性、溶解性和寡聚状态。修饰可以包括，例如，提供更有利的抗体细胞内相互作用(例如提供更大稳定性)的置换、或暴露的非极性氨基酸与极性氨基酸的置换(以实现更高溶解性)。多个优化目标和方法描述于美国专利申请2004-0110226中，可以用于工程化额外的修饰以进一步优化本发明的抗体。本发明的抗体可以与额外的修饰组合，以降低寡聚状态或尺寸，使得根据需要增强肿瘤渗透或提高体内清除率。本发明的抗体的其它修饰包括使得能够特定形成同型二聚体或同源多聚体分子的那些修饰。此类修饰包括但不限于工程化的二硫键以及化学修饰或可以提供产生共价同型二聚体或同源多聚体的机制的聚集方法。例如，工程化方法和此类分子的组合物描述于Kan 等人,2001, J.免疫 I. , 2001, 166:1320-1326 ；Stevenson 等人,2002, Recent ResultsCancer Res. 159104-12 ;US 5，681，566 ;Caron 等人，1992，J. Exp. Med. 176:1191-1195，和Shopes, 1992，J. Immunol. 148(9) :2918-22。本发明的变体的额外的修饰包括使得能够特定形成异源二聚体、异源多聚体、双功能和/或多功能分子的那些修饰。此类修饰包括、但不限于，CH3结构域中的一个或多个氨基酸置换，在CH3结构域中置换降低同型二聚体形成和提高异源二聚体形成。例如，工程化方法和此类分子的组合物描述于Atwell等人，1997，J.MoI. Biol. 270 (I) : 26-35,和 Carter 等人，2001，J. TmmunoI. Methods 248:7-15，每个菌通过引用全文并入本文。额外的修饰包括在铰链和CH3结构域中的修饰，在铰链和CH3结构域中所述修饰降低形成二聚体的倾向。在其它实施方式中，本发明的抗体包含去除蛋白水解的降解位点的修饰。这些可以包括，例如，降低产量的蛋白酶位点以及体内降解所施用的蛋白的蛋白酶位点。在一个实施方式中，进行额外的修饰，以去除共价降解位点，例如脱酰胺(即谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基脱酰胺相应的谷氨酰基和天冬酰基残基)、氧化、和蛋白水解的降解位点。特别可用于去除的脱酰胺位点为具有增强的脱酰胺倾向的那些，包括、但不限于后面为甘氨酸的天冬酰胺酰基和谷氨酰基残基(分别为NG和QG基序)。在这种情况下，任一个残基的置换可以显著降低脱酰胺倾向。常见的氧化位点包括甲硫氨酸和半胱氨酸残基。其它可以引入或去除的共价修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸、和组氨酸侧链的氨基的甲基化(T. E. Creighton, Proteins: Structureand Molecular Properties, ff. H. Freeman&Co. , San Francisco, pp. 79_86 (I983) ), N_ 端胺的乙酰化，任何C-端羧基的酰胺。额外的修饰还可以包括但不限于翻译后修饰，例如N-连接的或0-连接的糖基化和磷酸化。
修饰可以包括改进从常用于生物生产的宿主或宿主细胞中表达和/或纯化产量的那些修饰。这些包括、但不限于各种哺乳动物细胞系(例如CH0)、酵母细胞系、细菌细胞系和植物。额外的修饰包括去除或降低重链形成链间二硫键的能力的修饰。额外的修饰包括去除或降低重链形成链内二硫键的能力的修饰。本发明的抗体可以包含这样的修饰，所述修饰包括使用非天然氨基酸，所述非天然氨基酸使用例如Schultz和同事开发的技术掺入，包括但不限于Cropp&Shultz, 2004, Trends Genet. 20(12):625-30, Anderson 等人,2004,Proc. Natl.Acad. Sci.U. S. A. 101 (2) :7566-71, Zhang 等人，2003，303 (5656) : 371-3，和 Chin 等人，2003，Science 301 (5635) :964-7描述的方法。在一些实施方式中，这些修饰使得能够控制上文所述的各种功能、生物物理、免疫、或制备特性。在其它实施方式，这些修饰允许用于其它目的的额外的化学修饰。本文涵盖其它修饰。例如，抗体可以连接至多种非蛋白质性的聚合物，例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。可以进行额外的氨基酸修饰以使得能够进行抗体的特异或非特异化学或翻译后修饰，包括、但不限于聚乙二醇化和糖基化。可用于能够进行聚乙二醇化的特定置换包括、但不限于，弓丨入新半胱氨酸残基或非天然残基，使得有效和特定偶联化学可用于连接PEG或其它聚合物 分子。通过将新的N-X-T/S序列引入到本发明的抗体中可以实现特定糖基化位点的引入。抗体的共价修饰包括在本发明的范围内，通常(但不总是)在翻译后实现。例如，通过使抗体的特定氨基酸残基与有机衍生化试剂反应，将若干类型的抗体的共价修饰引入到分子中，所述有机衍生化试剂能够与侧链或或the N-或C-端残基反应。在一些实施方式中，本发明的抗体的共价修饰包括加入一个或多个标记。术语“标记基团”为任何可检测的标记。在一些实施方式中，经由各种长度的间隔臂将标记基团偶联至所述抗体以降低可能的空间位阻。用于标记蛋白的各种方法为本领域已知的，并且可以用于进行本发明。通常，取决于将检测标记的测定方法，可将标记分成多种类别a)同位素标记，其可以放射性同位素或重同位素；b)磁性标记(例如，磁性颗粒)；c)氧化还原活性部分；d)光学染料；酶基团(例如辣根过氧化物酶、[3]_半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)；e)生物素化基团；和f)第二报告分子识别的预先测定的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签等)。在一些实施方式中，经由各种长度的间隔臂将标记基团偶联至所述抗体以降低可能的空间位阻。用于标记蛋白的各种方法为本领域已知的，并且可以用于进行本发明。特定标记光学染料，包括、但不限于，发色团、磷光团、和荧光团，其中后者在任何情况下都是特异的。荧光团可以是“小分子”荧光团或蛋白质性的荧光团。“荧光标记”表示可以经由其内在荧光特性检测的任何分子。在一个实施方式中，本发明的抗体为抗体“融合蛋白”，有时本文称为“抗体缀合物”。融合伴侣或缀合物伴侣可以为蛋白质性的或非蛋白质性的；后者一般使用抗体和融合伴侣上的官能团产生。缀合物和融合伴侣可以为任何分子，包括小分子化合物和多肽。例如，多种抗体缀合物和方法描述于Trail等人，1999，Curr. Opin. Tmmuno1. 11:584-588。可行的缀合物伴侣包括但不限于细胞因子、细胞毒性齐IJ、毒素、放射性同位素、化学治疗齐U、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂和其它具有治疗活性的药剂。在一些实施方式中，可以更多地认为缀合物伴侣为有效载荷，也就是说，缀合物的目标是通过抗体将缀合物伴侣靶物递送至祀向的细胞，例如癌细胞或免疫细胞。因此，例如，毒素与抗体的缀合以将毒素递送到表达靶抗原的细胞为目标。如本领域技术人员所理解的，实际上，融合蛋白和缀合物的概念和定义是重叠的。将抗体指定为融合蛋白或缀合物不是表示将其限制于本发明的任何具体实施方式
。相反，宽松地使用这些术语以传递广泛的概念，即本发明的任何抗体可以通过遗传、化学或其它方法连接至一个或多个多肽或分子以提供一些期望的特性。适合的缀合物包括、但不限于，如下文所述的标记、药物和细胞毒性剂，包括、但不限于，细胞毒性药物(例如，化学治疗剂)或毒素或此类毒素的活性片段。适合的毒素和它们的相应片段s包括白喉毒素A链 、外毒素A链、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、酚霉素、依诺霉素等。细胞毒性剂还包括放射性化学物质，所述放射性化学物质通过将放射性同位素与抗体缀合或将放射性核素与已共价连接至所述抗体的螯合剂结合进行制备。另外的实施方式采用卡奇霉素、aunstatins、格尔德霉素、美登素、和duocarmycin以及类似物；后者参见美国专利申请2003/0050331。在一个实施方式中，本发明的抗体融合或缀合至细胞因子。本文使用的“细胞因子”表示从一个细胞群释放的作为细胞间介质作用于其它细胞的蛋白的通用术语。例如，如描述于Penichet等人，2001，J TmmunoI Methods 248-91-101,细胞因子可以融合至抗体以提供多种所需特性。此类细胞因子的实例为淋巴因子、单核因子、和另外的多肽激素。所述细胞因子包括生长激素，例如人生长激素、N-甲二磺酰基人生长激素、和牛生长激素；甲状旁腺激素、甲状腺素；胰岛素；前胰岛素；松弛肽、前松弛肽；糖蛋白激素，例如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、和促黄体激素(LH);肝细胞生长因子；纤维母细胞生长因子、泌乳素、胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-a和;缪勒氏管抑制物、小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素、血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO);神经生长因子，例如NGF-P ;血小板生长因子、转化生长因子(TGF)例如TGF-a和TGF-P ;胰岛素样生长因子-I和-II ;红细胞生成素(EPO);骨生成诱导因子、干扰素例如干扰素- a、0、和-Y ；集落刺激因子(CSF)例如巨噬细胞-CSF (M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF (GM-CSF);和粒细胞-CSF(G-CSF)、白介素(IL)例如 IL-U IL-I a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、肿瘤坏死因子例如 TNF-a 或 TNF-P ；C5a ;和其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。本文使用的术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白以及天然序列细胞因子的生物活性等同物。在一个替代实施方式中，本发明的抗体融合、缀合或可操作地连接至毒素，所述毒素包括但不限于小分子毒素和细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体。例如，多种免疫毒素和免疫毒素方法描述于Thrush等人，1996，Ann. Rev.Immunol. 14:49-71。小分子毒素包括但不限于卡奇霉素、美登素(US 5，208，020)、单端孢霉烯、和CC1065。在本发明的一个实施方式中，抗体缀合至一个或多个美登素分子(例如每个分子约10个美登素分子)。美登素可以，例如，转化成May-SS-Me，其可以被还原为May_SH3然后与修饰的抗体反应(Chan等人，1992，Cancer Research 52127-131)，以产生类美登素抗体缀合物。感兴趣的其它缀合物包含缀合至一个或多个卡奇霉素分子的抗体。抗生素的卡奇霉素家族能够产生亚-皮摩尔浓度的双链DNA断裂物。可以使用的卡奇霉素的结构类似物包括，例如，公开于 Hinman 等人,1993, Cancer Research 533336-3342, Lode 等人，1998，Cancer Research 582925-2928，US 5，714，586 ；US5,712，374、US 5，264，586 ；和 US 5,773,001。Dolastatin 10 类似物,例如 auristatin E(AE)和一甲基 auristatinE(MMAE)可以用作用于本发明的抗体的缀合物(Doronina等人，2003，Nat Biotechnol21(7) :778-84 ;Francisco 等人，2003 Blood 102(4) : 1458-65)。可用的酶活性毒素包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、胡连根毒素A链、a-sarcin、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPIUP PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、sapaonariaofficinalis抑制剂、白树毒素、mitogellin、restrictocin、酹霉素、依诺霉素和单端孢霉烯族毒素。参见，例如，PCT WO 93/21232。本发明还涵盖本发明的抗体与具有核酸裂解活性的化合物之间的缀合物，所述化合物例如核糖核酸酶或DNA核酸内切酶，例如脱氧核糖核酸酶(DNA酶)。在一个替代实施方式中，本发明的抗体可以融合、缀合的、或可操 作地连接至放射性同位素，以形成放射性缀合物。多种放射活性同位素可用于制备放射性缀合物抗体。实例包括、但不限于，At211、1131、I125、Y90、Rel86、Rel88、Sml53、Bi212、P32、和 Lu 的放射活性同位素。在另一个实施方式中，本发明的抗体可以缀合至“受体”(例如链霉亲和素)以用于肿瘤预靶向中，其中给患者施用抗体-受体缀合物，然后使用清除剂从循环中去除未结合的缀合物，之后进行缀合至细胞毒性剂(例如放射性核苷酸)的“配体”(例如抗生物素)的给药。在一个替代实施方式中，抗体缀合或可操作地连接至酶，以便利用抗体依赖性的酶介导的前药治疗(ADEPT)。可以通过将抗体缀合或可操作地连接至前药活化酶而采用ADEPT，所述前药活化酶将前药(例如肽基化学治疗剂，参见PCT申请WO 81/01145，通过引用全文并入本文)转化成活性抗癌药物。参见，例如，PCT申请WO 88/07378或美国专利4，975，278，每个专利均通过引用全文并入本文。可用于ADEPT的免疫缀合物的酶组分包括任何能够作用于前药的酶，其作用方式使得将前药转化为其更具有活性的细胞毒性形式。可用于本发明的该方法的酶包括但不限于碱性磷酸酶，可用于将含有磷酸的前药转化成游离的药物；芳基硫酸酯酶，可用于将含有硫酸的前药转化成游离的药物；胞嘧啶脱氨酶，可用于将非毒性的5-氟胞嘧啶转化成抗癌药物5-氟尿嘧啶；蛋白酶，例如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B和L)，可用于将含有肽的前药转化成游离的药物；D_丙氨酰基羧肽酶，可用于转化含有D-氨基酸取代基的前药；碳水化合物切除酶，例如P -半乳糖苷酶和神经氨酸酶，可用于将糖基化的前药转化成游离的药物；@ -内酰胺酶，可用于将用a -内酰胺衍生的药物转化为游离的药物；和青霉素酰胺酶，例如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，可用于将在其氨基氮处分别与苯氧基乙酰基或苯基乙酰基衍生的药物转化成游离的药物。或者，具有酶活性的抗体，本领域还称为“抗体酶”，可以用来将本发明的前药转化为游离的活性药物(参见，例如，Massey, 1987，Nature328. 457-458，通过引用全文并入本文)。可以制备抗体-抗体酶缀合物来将抗体酶递送至肿瘤细胞群。涵盖了多种另外的缀合物以用于本发明的抗体。多种化学治疗剂、抗-血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂和其它治疗剂描述于下文，其可以用作抗体缀合物。还涵盖Fe多肽作为融合伴侣和缀合物伴侣。因而，抗体可以为多聚体Fe多肽，其包含两个或更多个Fe区。这种分子的优点在于，它提供了 Fe受体与单个蛋白分子的多个结合位点。在一个实施方式中，可以使用化学工程方法连接Fe区。例如，Fab' s和Fe’s可以通过源自铰链中的半胱氨酸残基处的硫醚键进行连接，从而产生例如FabFc2的分子。Fe区可以使用二硫化物工程化和/或化学交联进行连接。在一个实施方式中，Fe区可以通过遗传方式进行连接。在一个实施方式中，抗体中的Fe区通过遗传方式连接，以产生串联的Fe 区,如描述于标题为 “Fe polypeptides with novel Fe ligand binding sites，，的美国专利申请2005-0249723。串联的Fe多肽可以包含两个或更多个Fe区，例如I至3个、2个等Fe区。研究多个工程化构建体以便获得具有最有利的结构和功能特性的同源或异源串联的抗体，可以是有利的。串联的抗体可以同源串联的抗体，即一种同种型的抗体通过遗传方式融合至相同同种型的另一个抗体。预期到，因为在串联的Fe多肽上存在多个Fcy R、Clq、和/或FcRn结合位点，可以增强效应物功能和/或药代动力学。在一个替代实施方式中，来自不同同种型的抗体可以串联，称为异源串联的抗体。例如，由于因为靶向Fe Y R和Fe y Rl受体的能力，结合Fe Y R和Fe Y RI 二者的抗体可以提供显著的临床改进。融合伴侣和缀合物伴侣可以连接至本发明的抗体的任何区域，包括在N-或C-端处、或在末端内-之间的一些残基处。在一个实施方式中，融合伴侣或缀合物伴侣在抗体的 N-或C-端(例如N-端)处进行连接。多种连接物可以用于本发明中，以共价地将抗体融合至融合蛋白或缀合物伴侣。本文的“连接物”、“连接物序列”、“间隔物”、“系链序列”或其语法等同物表示连接两个分子且通常用于将该两个分子设置成期望构型的分子或分子组(例如单体或聚合物)。连接物为本领域已知的，例如，如公知的同源或异源双功能连接物(参见，1994 Pierce Chemical Company目录中关于交联连接物的技术部分,第155-200页)。多个策略可用于将分子共价地连接在一起。这些包括、但不限于蛋白或蛋白结构域的N-和C-端之间的多肽连接、经由二硫键的连接、和经由化学交联反应物的连接。在此实施方式的一个方面，连接物为通过重组技术或肽合成产生的肽键。该连接物可以含有提供柔性的氨基酸残基。因此，连接肽可以主要包括下述氨基酸残基Gly、Ser、Ala、或Thr。所述连接肽的长度应该足以连接两个分子，使得它们具有相对于彼此的正确构象，以使得它们保持期望的活性。用于此目的的适合长度包括至少一个和不超过50个氨基酸残基。在一个实施方式中，所述连接物的长度为约I至30个氨基酸，理想连接物的长度为I至20个氨基酸。可用连接物包括甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括，例如，(GS)n、(GSGGS)n, (GGGGS)n和(GGGS)n，其中n为至少I的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、和其它柔性连接物，如本领域认可的那些。或者多种非蛋白质性的聚合物可用于将本发明的抗体连接至融合伴侣或缀合物伴侣，或将本发明的抗体连接至缀合物，所述多种非蛋白质性的聚合物包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。本发明提供了用于产生和通过实验方式测试抗体的方法。所描述的方法不意在将本发明限制到任何具体应用或操作理论。相反，所提供的方法意在一般性地示例可以产生和通过实验方式测试一个或多个抗体以获得变体抗体。用于抗体分子生物学、表达、纯化、 和筛选的一般方法描述于 Duebel&Kontermann 编辑的 Antibody Engineering, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001 和 Hayhurst&Georgiou, 2001，Curr Opin Chem Biol 5683-689;Maynard&Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2339-76, Antibody. A Laboratory Manualby Harlow&Lane, New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988。在本发明的一个实施方式，产生编码抗体的核酸，然后可以将所述核酸克隆到宿主细胞中，根据需要表达和测。因此，可以制备编码每个蛋白序列的核酸、特别是DNA。使用公知的操作程序进行这些操作。例如，可用于本发明的多种方法描述于Molecular Clone-ALaboratory Manual, 3rdEd. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NewYork, 2001 )、和 Current 方案 s in Molecular Biology (John Wiley&Sons)。本领域技术人员将可以理解的是，产生用于包含大量序列的文库的确切序列可能是昂贵且耗时的。本文的“文库”表示任何形式的变体集合，包括但不限于一系列核酸或氨基酸序列、在可变位置的一系列核酸或氨基酸置换、包含编码文库序列的核酸的物质文库(physical library)或包含纯化或未纯化形式的变体蛋白的物质文库。因此，存在多种可用于有效产生本发明的文库的技术。可用于本发明的此类方法描述于或参见美国专利6，403，312 ;美国专利申请2002-0048772、美国专利 7，315，786 ;美国专利申请 2003-0130827、PCT 申请 WO 01/40091或PCT申请WO 02/25588中。此类方法包括但不限于基因组装方法、基于PCR的方法和使用PCR变型方式的方法、基于连接酶链反应的方法、混合寡聚物法例如用于合成穿梭的那些方法、易错扩增法和使用具有随机突变的寡聚物的方法、经典的定向诱变方法、基因盒诱变、以及其它扩增和基因合成方法。如本领域已知的，存在多种可商业购得的试剂盒和用于基因组装、诱变、载体亚克隆的方法等，此类商业产品可用于本发明中以产生编码抗体的核核酸。可以通过培养用核酸转化的宿主细胞而产生本发明的抗体，所述核酸例如含有编 码抗体核酸的表达载体，在合适的条件下诱导或导致蛋白表达。适于表达的条件将根据表达载体和宿主细胞的选择而变，并且本领域技术人员通过常规实验可以容易地确定。可以使用多种合适的宿主细胞，包括但不限于哺乳动物细胞、细菌、昆虫细胞、和酵母。例如，可用于本发明的多种细胞系描述于可得自美国模式培养物保藏中心的ATCC细胞系目录。在一个实施方式中，在哺乳动物表达体系中表达抗体，所述表达体系包括这样的体系在所述体系中，使用病毒将表达构建体引入到哺乳动物细胞中，所述病毒例如逆转录病毒或腺病毒。可以使用任何哺乳动物细胞，例如人、小鼠、大鼠、仓鼠、灵长类动物细胞等。适合的细胞还包括已知的研究细胞，包括但不限于Jurkat T细胞、NIH3T3、CH0、BHK、C0S、HEK293、PER C. 6、HeLa、Sp2/0、NSO细胞和它们的变体。在一个替代实施方式中，在细菌细胞中表达文库蛋白。细菌表达体系为本领域公知的，包括大肠杆菌(E. coli)、枯草芽孢杆菌、乳脂链球菌、和变铅青链霉菌。在替代实施方式中，在昆虫细胞(例如Sf21/Sf9)或酵母细胞(例如酿酒酵母、毕氏酵母等)中产生抗体。在一个替代实施方式中，使用细胞游离翻译体系体外表达抗体。可得到源自原核细胞(例如E. coli)和真核细胞(例如小麦胚芽、兔网织红细胞)二者的体外翻译体系，并且可以基于目标蛋白的表达水平和功能特性进行选择。例如，如本领域技术人员所理解的，体外翻译为一些展示技术所需，例如核糖体展示技术。此外，可以通过化学合成方法产生抗体。还包括动物(例如牛、绵羊或山羊乳液、小鸡胚胎蛋、昆虫幼虫等)和植物(例如玉米、烟草、浮萍等)的转基因表达体系。可以将编码本发明的抗体的核酸掺入到表达载体中，以便表达所述蛋白。表达载体可以用于蛋白表达。表达载体可以包含掺入宿主基因组的自复制的染色体外载体。将表达载体构建成与宿主细胞类型相容。因而，可用于本发明的表达载体包括但不限于那些使得可以在哺乳动物细胞、细菌、昆虫细胞S、酵母、和体外体系中进行蛋白表达的表达载体。如本领域已知的，可以商业方式或其它方式得到多种可用于本发明中以表达抗体的表达载体。表达载体通常包括用控制或调节序列、可选择的标志物、任何融合伴侣、和/或另外的元件可操作地连接的蛋白。本文的“可操作地连接”表示，将核酸设置到与另一个核酸序列的功能关系中。一般而言，这些表达载体包括可操作地连接至编码抗体的核酸的转录和翻译调节核酸，并且通常适于用来表达蛋白的宿主细胞。通常，转录和翻译调节序列可以包括启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、和增强子或激活序列。同样如本领域已知的，表达载体通常含有选择基因或标志物，以允许选择含有表达载体的经转化的宿主细胞。选择基因为本领域公知的，并且将根据使用的宿主细胞而变。抗体可以可操作地连接至融合伴侣，以使得能够靶向所表达的蛋白、纯化、筛选、展示等。融合伴侣可以经由连接序列连接至抗体序列。所述连接序列一般包含少量氨基酸，通常小于10个，尽管也可以使用更长的连接物。通常，选择为柔性且抗降解的连接序列。如本领域技术人员将理解的，大量序列中的任一种可以用作连接物。例如，常见的连接序列包括氨基酸序列GGGGS。融合伴侣可以为将抗体和任何相关融合伴侣导向至期望的细胞位置或细胞外培养基的靶向或信号序列。如本领域已知的，某些信号传递序列可以将引导蛋白分泌到生长培养基中，或到壁膜间隙中、位于细胞膜内外之间。融合伴侣还可以为编码肽或蛋白的序列，所述肽或蛋白使得能够进行纯化和/或筛选。此类融合伴侣包括但不限于多组氨酸标签(His-标签)(例如H6和HlO或其它用于与固定金属亲和色谱(IMAC)系统(例如Ni2+亲和柱)一起使用的标签)、GST融合蛋白、MBP融合蛋白、Str印-标签、细菌酶BirA 的BSP生物素化靶序列、通过抗体靶向的表位标签(例如c-myc标签、flag-标签等)如本领域技术人员将理解的，此类标签可用于纯化、筛选、或二者。例如，可以使用His-标签、通过将其固定到Ni2+亲和柱而纯化蛋白，然后在纯化后，同一 His-标签可用于将所述抗体固定至Ni2+包被的板，以进行ELISA或其它结合测定(如下文所述的)。融合伴侣可以使得能够使用选择方法来筛选抗体(参见下文)。使得能够进行多种选择方法的融合伴侣为本领域公知的，所有这些都可用于本发明中。例如，通过将抗体文库的成员融合至基因III蛋白，可以利用曬菌体展不技术(Kay等人，Phage display of peptides and proteins:a laboratorymanual, Academic Press, San Diego, CA, 1996 ;Lowman等人，1991，Biochemistry 30:10832-10838; Smith, 1985，Science 228:1315-1317)。融合伴侣可以使得抗体能够被标记。或者，融合伴侣可以结合表达载体上的特定序列，从而使得能够用编码融合伴侣和相关抗体的核酸共价或非共价地连接它们。将外源核酸引入到宿主细胞中的方法为本领域公知的，并且根据使用的宿主细胞而变。技术包括但不限于dextran介导的转染、磷酸|丐沉淀、氯化|丐处理、polybrene介导的转染、原生质体融合、电穿孔、病毒或噬菌体感染、多核苷酸在脂质体中的包封、和DNA向细胞核中的直接微注射。在哺乳动物细胞的情况下，转染可以为瞬时的或稳定的。在一个实施方式中，在表达后纯化或分离抗体。可以以多种本领域技术人员已知的方式分离或纯化蛋白。标准的纯化方法包括在大气压力或高压下使用例如FPLC和HPLC的系统的色谱技术,包括离子交换色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、尺寸或凝胶过滤色谱、和反相色谱。纯化方法还包括电泳、免疫学、沉淀、透析、和色谱聚焦(chromatofocusing)技术。还可以使用与蛋白浓度结合的超滤和渗滤技术。如本领域公知的，多种天然蛋白结合Fe和抗体，这些蛋白可用于本发明以进行抗体的纯化。例如，细菌蛋白A和G结合Fe区。同样,细菌蛋白L与一些抗体的Fab区结合,当然也结合抗体的革巴抗原。通常通过特定融合伴侣可以实现纯化。例如，可以如下进行抗体的纯化如果利用GST融合蛋白，则使用谷胱甘肽树脂；如果利用His-标签，则使用Ni2+亲和色谱；或者如果利用flag-标签，则使用固定抗-flag抗体。对于适合的纯化技术的一般指导，参见，例如Protein Purification:Principles and Practice, 3rd Ed. , Scopes, Springer-Verlag, NY，1994。必需的纯化程度将根据抗体的筛选和使用而变。在一些情况下无需纯化。例如在一个实施方式中，如果分泌了抗体，则筛选可以直接在培养基中进行。如本领域公知的，一些选择方法不涉及蛋白的纯化。因此，例如，如果将抗体文库制备成噬菌体展示文库，可以不进行蛋白纯化。可以使用多种方法筛选抗体，所述方法包括但不限于使用体外测定、体内和基于细胞的测定和选择技术的那些方法。筛选操作程序中可以利用自动化和高通量筛选技术。筛选可以利用融合伴侣或标记的使用。上文讨论了融合伴侣的使用，本文的“标记的”表示本发明的抗体具有一个或多个连接的元件、同位素、或化合物以使得能够在筛选中进行检测。通常，标记分成三类a)免疫标记，其可以为作为融合伴侣掺入的被抗体识别的表位；b)同位素标记，其可以为放射性或重同位素；和c)小分子标记，其可以包括荧光和比色染料，或例如生物素的分子，其使得能够进行其它标记方法。可以将标记掺入到化合物的任何 位置，并且可以体外或在蛋白表达期间体内掺入。在一个实施方式中，在体外测定中筛选抗体的功能和/或生物物理特性。体外测定可以允许进行目标筛选特性的广泛动态范围。可以筛选的抗体特性包括但不限于稳定性、溶解度、和对于Fe配体(例如FcyR)的亲和力。可以同时或单独筛选多个特性。取决于测定的要求，蛋白可以纯化的或未纯化的。在一个实施方式中，所述筛选为抗体与蛋白或非蛋白分子的结合的定性或定量结合测定，所述非蛋白分子已知为或据信为结合所述抗体。在一个实施方式中，所述筛选为用于测量与靶抗原的结合的结合测定。在一个替代实施方式中，所述筛选为抗体与Fe配体的结合的测定，所述Fe配体包括但不限于Fe Y R家族、新生受体FcRn、补体蛋白Clq、以及细菌蛋白A和G。所述Fe配体可以来自任何生物，例如，人、小鼠、大鼠、兔、猴等。可以使用本领域已知的多种方法进行结合测定，所述方法包括但不限于基于FRET (荧光共振能量转移)和BRET (生物荧光共振能量转移)的测定、AlphaScreen(TM)(扩增发光邻近同源测定)、闪烁邻近测定、ELISA (酶联免疫吸附测定一)、SPR (表面等离子共振，还已知为Biacore(TM))、等热滴度量热法、差示扫描量热法、凝胶电泳、和包括凝胶过滤的色谱法。这些和其它方法可以利用抗体的某个融合伴侣或标记。测定可以利用多种检测方法，包括但不限于显色标记、荧光标记、发光标记、或同位素标记。可以使用本领域已知的多种方法筛选闪烁生物物理抗体特性,例如稳定性和溶解度。可以通过测量折叠和解折叠状态之间的热力学平衡而测定蛋白稳定性。例如，可以使用化学变性剂、热、或PH解折叠本发明的抗体，可以使用包括但不限于下述的方法检测该转变圆二色光谱法、荧光光谱法、吸收光谱法、NMR光谱法、比色法、和蛋白质水解。如本领域技术人员将理解的，可以使用这些和其它技术检测折叠和解折叠转变的动力参数。可以使用本领域已知的多种方法定量或定性测定抗体的溶解度和整体结构完整性。可用于本发明表征生物物理抗体特性的方法包括凝胶电泳、等电聚焦、毛细管电泳、色谱法例如尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法、和反相高效液相色谱法、肽图分析、寡糖作图分析、质谱法、紫外吸收光谱法、荧光光谱法、圆二色光谱法、等热滴度量热法、差示扫描量热法、分析超离心、动态光散射、蛋白质水解、和交联、浊度测量、过滤延迟测定、免疫学测定、荧光染料结合测定、蛋白染色测定、显微镜法、和经由ELISA或其它结合测定的聚集体检测。也可以使用利用X射线晶体学技术和NMR光谱法的结构分析。在一个实施方式中，可以通过在某个限定的时间段之后测定蛋白溶解的量而测量稳定性和/或溶解度。在此测定中，蛋白可以或可以不暴露于某个极端条件，例如高温、低pH、或存在变性剂。因为功能通常需要稳定的、可溶的、和/或折叠良好/结构良好的蛋白，前述功能和结合测定还提供了进行这种测量的方式。例如，包含抗体的溶液可以进行抗体结合靶抗原的能力的测定，然后将所述溶液暴露于高温并持续一个或多个限定的时间段，之后再次测定抗原结合。因为预期解折叠和聚集的蛋白无法结合抗原，剩余活性量提供了抗体的稳定性和溶解度的量度。本发明的抗体的生物学特性可以在细胞、组织、整个生物体实验中进行表征。如本领域已知的，通常在动物中测试药物，所述动物包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、猫、猪、和猴，以便测量药物治疗疾病或疾病模型的效用，或测量药物的药代动力学、毒性、其它特性。所述动物可以称为疾病模型。关于本发明的抗体，当使用动物模型来评估候选多肽对于人的效用的潜力时，出现特定挑战——这至少部分由于下述事实在对人Fe受体的亲和力方面具有特定作用的抗体可能不具有与直系同源的动物受体相似的亲和力作用。与真正直系 同源的正确比对和一些直系同源(Mechetina等人，Immunogenetics, 200254:463-468)根本不存在于动物中的这一事实(例如人具有Fe Y Rlla，而小鼠则不具有)相关的无可避免的含糊问题，进一步加重了这些问题。通常在小鼠中测试治疗剂，所述小鼠包括但不限于裸鼠、SCID小鼠、异种移植小鼠、和转基因小鼠(包括基因敲入小鼠和基因敲除小鼠)。例如，可以在小鼠癌症模型、例如异种移植小鼠测试预期作为抗癌治疗剂的本发明的抗体。在此方法中，将肿瘤或肿瘤细胞系移植到或注射到小鼠中，然后用所述治疗剂治疗该小鼠以测定所述抗体降低或抑制癌症生长和转移的能力。可供选择的方法是使用SCID鼠模型，在所述SCID鼠模型用人外周血淋巴细胞(PBL)注射免疫缺陷的小鼠，从而赋予所述小鼠半功能性和人免疫系统(具有合适的多种人FcR)，所述小鼠之后被注射靶向注射的人肿瘤细胞的抗体或Fe-多肽。在这样的模型中，靶向期望抗原的Fe-多肽与小鼠内的人PBL相互作用，以产生杀肿瘤的效应物功能。这一实验可以提供用于确定所述抗体被用作治疗剂的潜力的有意义的数据。任何生物，例如哺乳动物，可以用于测试。例如，由于它们与人的遗传相似性，猴可以为适合的治疗模型，因而可用于测试本发明的抗体的效用、毒性、药代动力学、或其它特性。本发明的抗体在人中的测试是批准成为药物最终所需要的，因而当然涵盖这些实验。因此，可以在人中测试本发明的抗体，以测定它们的治疗剂效用、毒性、药代动力学、和/或其它临床特性。进行毒性研究以测定抗体或Fe-融合物相关的作用，所述作用无法在标准药理学模型中评估，或者仅在所述药剂的重复给药后发生。大多数毒性测试在两个物种(啮齿类动物和非啮齿类动物)中进行以确保不忽略在新治疗剂实体被引入人中之后的任何非期望的副作用。通常，这些模型可以测量多种毒性，包括基因毒性、慢性毒性、免疫原性、生殖/发育毒性、和致癌性。前述参数中包括饮食、体重、抗体形成、临床化学、以及标准的器官/组织(心肌毒性)的宏观和微观考察的标准测量。测量的另外的参数为注射位点创伤和中和抗体(如果有的话)的测量。传统上，评估单独或缀合的单克隆抗体治疗剂的与正常组织的交叉反应性、免疫原性/抗体产生、缀合物或连接物毒性和放射性标记物质的“旁观者”毒性。虽然如此，可以使这些研究个性化，以解决特定问题和按照ICH S6的指导集合(同样在上文提及的生物技术产品的安全性研究)。因此，一般原则为，充分良好表征所述产品，并且对于以去除的杂质/污染物，测试材料在整个开发中为相当的；以及GLP规范。可以在多种动物体系中研究本发明的抗体的药代动力学(PK)，其中最相关的动物体系为非人灵长类动物，例如猕猴和恒河猴。可以使用血浆浓度和清除率，可以评估在6000倍(0. 05-300mg/kg)剂量范围内的单次或重复i. v. /s. c.给药的半衰期(天至周)，以及可以测量稳态水平下的分布体积和全身吸收水平。此类测量參数的实例一般包括观察到的最大血浆浓度(Cmax)、达到Cmax的时间(Tmax)、从时间0到无限的血浆浓度-时间曲线下的面积[AUCVinf]和表观清除半衰期(T1/2)。另外的测量參数包括i.v.给药后获得的浓度-吋间数据的房室分析和生物利用度。已经针对Rituxan 和Zevalm 建立了使用猕猴的药理学/毒理学研究的实例，其中CD20的单克隆抗体为交叉反应性的。可以在啮齿类动物模型中进行生物分布、放射量測定(对于放射性标记的抗体)、和PK研究。此类研究可以评估施用的全部剂量下的耐受、对于局部组织的毒性、啮齿类动物异种移植动物模型的定位、靶细胞的耗竭。本发明的抗体在动物体系中或人中赋予卓越的药代动力学。例如，与FcRn的提高 的结合可以提高治疗性抗体的半衰期和暴露。或者，在降低的半衰期有利的情况下，例如此种药物具有副作用吋，与FcRn的降低的结合可以降低含有Fe的药物的半衰期和暴露。本领域已知的是，多种Fe受体在各种免疫细胞类型上以及在不同组织中有差别地表达。Fe受体的差别组织分布最終可以对本发明的抗体的药效动力学(PD)和药代动力学(PK)特性具有影响。因为抗体的呈递对于多种Fe受体具有不同亲和力，对于ro和/或PK特性的多肽其它筛选可以最终用于定义H)、PK、和每个候选多肽赋予的治疗效用的最佳平衡。药效动力学研究可以包括、但不限于，靶向特定肿瘤细胞或阻断信号传递机制、测量靶抗原表达细胞或信号的耗竭等。可以在动物模型中或人中显示此类药效动力学作用。本发明的抗体可以用于治疗目的。如本领域技术人员将理解的，本发明的抗体可以用于使用抗体的任何治疗用途等。在一个实施方式中，将抗体施用给患者以治疗包括但不限于癌症的障碍。用于本发明的用途的“患者”包括人和其它动物二者，例如哺乳动物，例如人。因而，本发明的抗体具有人治疗和兽用二者。本发明中的术语“治疗”意指包括治疗性治疗以及疾病或障碍的预防性或抑制性量度。因此，例如，在疾病发作之前，抗体的成功给药导致疾病的治疗。又如，在疾病临床显现之后，优化抗体的成功给药以对抗疾病的症状包括疾病的治疗。“治疗”还包括在疾病出现之后最优化的抗体的给药，以便根除所述疾病。在发作之后和临床症状已出现之后，药剂的成功给药(具有可能的临床症状的减轻和可能的疾病改善)包括治疗疾病。那些“需要治疗的”包括已具有疾病或障碍的哺乳动物，以及倾向于具有疾病或障碍的那些，包括其中预防疾病或障碍的那些。在一个实施方式中，给具有涉及蛋白或其它分子(例如FLT3)不适当表达的疾病的患者施用本发明的抗体。在本发明的范围内，此意指包括以异常蛋白为特征的疾病和障碍，例如由于下述的改变存在的蛋白的量、蛋白定位、翻译后形式、构象状态、变体蛋白的存在等。过多可以由任何原因导致，所述原因包括但不限于，分子水平的过表达、在作用位点处延长或积聚出现、或蛋白相对于正常的活性提高。包括在此定义内的疾病和障碍以蛋白的減少为特征。此減少可以由于任何原因导致，所述原因包括但不限于分子水平的表达降低、在作用位点处缩短或降低出现、蛋白的变体形式、或蛋白相对于正常的活性降低。可以相对于蛋白的正常表达、出现、或活性而测量蛋白的这种过多或減少，并且所述测量在本发明的抗体的开发和/或临床测试方面发挥重要作用。本文的“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物的生理情况，其通常以失调的细胞生长为特征。癌症的实例包括但不限于恶性肿瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤(包括脂肪肉瘤)、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、腺瘤、黑素瘤、和白血病或淋巴恶性肿瘤。此类癌症的更具体实例包括血液恶性病，例如非霍金奇淋巴瘤(NHL)、B-细胞急性淋巴细胞性白血病/淋巴瘤(B-ALL)、和T-细胞急性淋巴细胞性白血病/淋巴瘤(T-ALL)、胸腺瘤、兰氏细胞增生症、多发性骨髄瘤(MM)、骨髓瘤变例如急性骨髄性白细胞(AML)(包括成熟的AML、无分化的AML)、急性早幼粒细胞白血病、急性髓单核细胞白血病、和急性单核细胞白血病、骨髄增生异常综合征、和慢性髓增生性障碍(MDS)(包括慢性骨髄性白血病(CML))。 如果所述癌症或肿瘤为淋巴瘤或白血病，则所述疾病可以处于微小残留病(MRD)的状态。此状态可以例如在无或有干细胞移植的常规化疗后达到。在此情况下，“ MRD”涉及这样的疾病状态在该疾病状态中，当患者处于减轻期间时，少量淋巴瘤/白血病细胞在治疗期间或治疗后保留在患者中，所述减轻包括完全缓解(无疾病的症状或迹象)。这是癌症和白血病复发的主要原因。在这种状态下，尽管患者可以完全缓解，但是通过本领域计数仍可检测到所述疾病，所述疾病例如聚合酶链反应(PCR)和流式细胞术(FACS)。本发明的抗体的靶物在人群中可以是多态的。对于给定患者或患者群，本发明的抗体的效用可以因而受蛋白的具体多态性的存在或不存在影响。例如，Fe Y RIIIA在158位为多态的，其通常为V (高亲和力)或F (低亲和力)。观察到具有V/V纯和基因型的患者对于用抗-CD20抗体Rituxan (rituximab)进行治疗具有更好的临床反应，可能是因为这些患者实现更强的NK反应(Dali’Ozzo等人(2004)Cancer Res. 64-4664-9)。另外的多态性包括但不限于Fe y RIIA R131或H131，并且此类多态性已知提高或降低Fe结合和之后的生物学活性，这取决于所述多态性。本发明的抗体可以结合受体的特定多态形式，例如Fe YRIIIA 158V或以等量亲和カ结合受体中特定位置处的全部多态性，例如Fe y RIIIA的158V和158F多态性二者。在一个实施方式中，本发明的抗体可以具有与可用于抗体中的多态性相同的结合，以消除在具有不同多态性的患者中可见的差异效用。这样的特性可以提供治疗反应的更大一致性，并减少不反应的患者群。这种与受体多态性具有相同结合的变体Fe经由调节与相关Fe受体的结合，可以具有提高的生物学活性，例如ADCC、CDC或循环半衰期、或降低的活性。在一个实施方式中，本发明的抗体可以以更高或更低亲和力与受体多态性之一，从而增强现有的结合差异或逆转所述差异。这ー特性可以允许产生特别针对具有此种多态性的患者群的效用而定制的治疗剂。例如，具有对抑制性受体(例如FcYRIIb)的更高亲和力的患者群可以接受含有对所述受体此种多态形式降低的结合的抗体的药物，从而产生更有效的药物。在一个实施方式中，筛选患者的一个或多个多态性，以便预测本发明的抗体的效用。可以使用这种イM息，例如选择患者以包括在临床试验中或者从临床试验中排除，或者在批准后给临床医生或患者提供关于合适剂量和治疗选择的指导。在一个实施方式中，选择患者以包括在本发明的抗体的临床试验中，如果他们的基因型指示了，相比于ー个或多个目前使用的抗体治疗剂，他们更显著地响应本发明的抗体。在另ー个实施方式中，使用这种基因型信息来确定合适剂量和治疗方案。在另ー个实施方式中，选择患者以基于他们的多态性基因型包括在临床试验中或在批准后接受治疗，其中这种治疗含有被工程化以对此类群体特异有效的抗体，或者其中这种治疗含有对于不同多态性形式不显示出差异活性的抗体。包括在本发明中的诊断性测试鉴定对于本发明的抗体可能显示出有利的临床反应的患者，或者当用本发明的抗体治疗时显示出相对于ー个或多个目前使用的抗体治疗剂显著更好的反应的患者。可以使用多个用于测定本领域已知的人中Fe Y R多态性的方法中的任ー个。并且，本发明包括在临床样品上进行的预后测试，所述临床样品例如血液和组织样品。此类测试可以測定效应物功能活性，包括但不限于ADCC、⑶C、吞噬、和调理，或測定(无论机制)癌性或其它致病细胞的杀灭。在一个实施方式中，ADCC測定，例如之前描述的那些，用于预测本发明给定抗体对于特定患者的效用。这种信息可用于鉴定包含于或排除于临床试验的患者，或者提供关于合适剂量和治疗方案的决策的信息。这种信息还可以用 来选择含有在这种测试中显示出卓越活性的特定抗体的药物。涵盖了药物组合物，在所述药物组合物中配制本发明的抗体和ー个或多个具有治疗活性的药剂。通过将具有期望纯度水平的抗体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington，s Pharmaceutical Sciences 16thedition, Osol, A. Ed.，1980),制备本发明的抗体的制剂进行储存，其为冻干制剂或水性溶液的形式。可接受的赋形剂或稳定剂在所利用的剂量和浓度下对于受体来说是无毒的，并且包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐、こ酸盐、和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剤(例如氯化十八烷基ニ甲基苄基铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚、丁基苄醇；对羟基苯甲酸烷基酷，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯ニ酚；环己醇；3_戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基的多肽；蛋白、例如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚こ烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、组氨酸、精氨酸，或赖氨酸；单糖、ニ糖、和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂，例如EDTA ;糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；甜味剂和其它矫味剂；填料，例如微晶纤维素、乳糖、玉米和其它淀粉；结合剂；添加剤；着色剂；成盐反粒子，例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEEN 、PLUR0NICS 或聚こニ醇(PEG)。在一个实施方式中，包含本发明的抗体的药物组合物可以为水溶性形式，例如以药学上可接受的盐存在，所述药学上可接受的盐意指包括酸和碱加成盐二者。“药学上可接受的酸加成盐”是指与有机酸形成的保留游离碱的生物学有效性且非生物学或其它方面不期望的那些盐，所述有机酸例如こ酸、丙酸、こ醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙ニ酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、こ磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。“药学上可接受的碱加成盐”包括源自无机碱的那些盐，所述无机碱例如钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝盐等。特别可用的是铵、钾、钠、钙、和镁盐。源自药学上可接受的有机非毒性碱的盐包括下述的盐伯胺、仲胺、和叔胺、取代的胺(包括天然存在的取代的胺)、环胺和碱性离子交换树脂，例如异丙基胺、三甲基胺、ニこ基胺、三こ基胺、三丙基胺、和こ醇胺。用于体内给药的制剂应该是无菌的。这通过无菌过滤膜或其它方法可以容易地实现。本文公开的抗体还可以配制为免疫脂质体。脂质体为小囊，包括可用于将治疗剂递送至哺乳动物的各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剤。通过本领域已知的方法制备含有抗体的脂质体，所述方法例如描述于Epstein等人，1985，Proc Natl Acad SciUSA, 82:3688 ;Hwang 等人，1980，Proc Natl Acad Sci USA, 77:4030 ；US 4,485, 045 ；US 4，544，545 ;和PCT申请W097/38731。具有增强的循环时间的脂质体公开与美国专利5，013，556。所述脂质体的组分通常以双层形式排列，类似于生物膜的脂质排列。可以通过反相蒸发法用脂质组合物产生特别可用的脂质体，所述脂质组合物包含卵磷脂、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰こ醇胺(PEG-PE)。将脂质体挤压通过具有限定孔径的过滤器，从而产生具有期望直径的脂质体。脂质体内任选地含有化学治疗剂或其它具有治疗活性的药剂(Gabizon 等人，1989，J National Cancer Inst 81:1484)。所述抗体和其它具有治疗活性的药剂还可以被捕集在微胶囊中，所述微胶囊通过包括但不限于下述的方法制备凝聚技术、界面间聚合(例如使用羟甲基纤维素或明胶-微胶囊、或聚(甲基丙烯酸甲酷)微胶囊)、胶体药物递送体系(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)、和粗乳液。此类技术公开于Remington的PharmaceuticalSciences,第16版，Osol, A. Ed.，1980。可以制备持续释放制备物。持续释放制备物的适合的实例包括固体疏水聚合物的半滲透性基质，所述基质为成形制品的形式，例如膜或微胶 囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟こ基-丙烯酸甲酷)、或聚(こ烯醇))、聚乳酸(美国专利3，773，919)、L-谷氨酸和、こ基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的こ烯-こ烯こ酯、可降解的乳酸-こ醇酸共聚物例如Lupron Depot (其为可注射的微球，由乳酸-こ醇酸共聚物以及醋酸亮丙瑞林组成)、聚-D-(-)-3-羟基丁酸、和pr0Lease (可从Alkermes商业购得)，其为基于微球的递送体系，由掺入到聚-DL-丙交酯-共-こ交酷(PLG)的共聚物的期望生物活性分子組成。包含本发明的抗体的药物组合物的给药，例如以无菌水溶液的形式，可以以多种方式进行，包括、但不限于经ロ、皮下、静脉内、鼻内、intraotically、经皮、局部(例如，凝胶、膏剂、洗剤、霜剂等)、腹膜内、肌肉内、肺内、阴道内、非肠道、经直肠或眼内。如本领域已知的，根据弓I入的方式可以相应地配制药物组合物。如本领域已知的，通常通过IV输注或弾丸式输注递送蛋白治疗剂。还可以使用此类方法递送本发明的抗体。例如，可以通过静脉内输注给药，其中以0. 9%氯化钠作为输注介质。此外，多个递送体系中的任ー个为本领域已知的，并且可用于施用本发明的抗体。实例包括、但不限于，包封于脂质体、微粒、微球(PLA/PGA微球)中等。或者，可以使用多孔、无孔或胶状材料的植入物，所述材料包括膜或纤维。持续释放体系可以包括聚合物材料或基质，例如聚酯、水凝胶、聚(こ烯醇)、聚乳酸、L-谷氨酸和こ基-L-谷氨酸的共聚物、こ烯-こ烯こ酯、乳酸-こ醇酸的共聚物例如Lupron Depot (R)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。还可以施用编码本发明的抗体的核酸，例如通过逆转录病毒感染、直接注射、或用脂质宝贝、细胞表面受体、或其它转染剂。在所有情况下，受控释放体系可用于在期望作用位置处或其附近释放所述抗体。在一个实施方式中，选择治疗或预防有效的给药剂量和频率。如本领域已知的，针对蛋白降解、全身相对于局部递送、新蛋白酶合成的速率以及年龄、体重、一般健康、性別、饮食、给药时间、药物相互作用和病况的严重性进行调整可以是必需的，并且可以由本领域技术人员以常规实验确定。有治疗活性的抗体在制剂中的浓度可以从约0. I至100重量％变化。在一个实施方式中，抗体的浓度在0. 003iiM至I. 0摩尔的范围内。为了治疗患者，可以施用治疗有效剂量的本发明的抗体。本文的“治疗有效剂量”表示这样的剂量所述剂量对其所施用的产生作用。确切剂量将取决于治疗目的，并且可以由本领域技术人员使用已知技术确认。齐U量的范围可以为0. 0001至100mg/k体重或更大，例如0. I、I、10、或50mg/kg体重，例如I至10mg/kg 体重。在一些实施方式中，仅施用单个剂量的抗体。在其它实施方式中，施用多个剂量的抗体。给药之间的间隔时间可以小于I小时、约I小时、约1-2小时、约2-3小时、约3-4小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约2-4天、约4_6天、约I周、约2周、或超过2周。在其它实施方式中，以节奏式给药方案(连续输注或贫乏给药，而无延长的休止时间段)施用本发明的抗体。这种节奏式给药可以涉及以恒定间隔给药，而无休止时间段。通 常，这种方案包括慢性低剂量或连续输注延长的时间段，例如1-2天、1-2周、1-2月、或长达6月或更长。使用较低剂量可以使副作用和休止时间段的需求最小化。在某些实施方式中，将本发明的抗体和一种或多种其它预防剂或治疗剂临床地施用给患者。循环治疗涉及一个时间的第一药剂的给药、第二时间的第二药剂的给药、任选地另外时间的另外药剂的给药、任选地休止时间段，以及然后重复此给药序列一次或多次。循环次数通常为2 - 10。循环治疗可以减少发生ー个或多个药剂的抗性，可以使副作用最小化、或可以改进治疗效用。本发明的抗体可以与ー个或多个其它治疗方案或药剂同时施用。另外的治疗方案或药剂可用于改进所述抗体的效用或安全性。并且，另外的治疗方案或药剂可用于治疗相同疾病，而不是改变抗体的作用。例如，可以将本发明的抗体与化疗、放射治疗、或化疗和放射治疗二者一起施用给患者。本发明的抗体可以与ー种或多种其它预防剂或治疗剂组合施用，所述其它预防剂或治疗剂包括但不限于细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞因子、生长抑制齐[J、抗激素剂、激酶抑制剂、抗血管生成剂、保心剂、免疫刺激剂、免疫抑制剂、促进血液细胞増殖的药剂、血管生成抑制剂、蛋白酪氨酸激酶(PTK)抑制剂、另外的抗体、FcyRIIb或其它Fe受体抑制剂、或其它治疗剂。术语“组合地”和“共同给药”不限于预防剂或治疗剂在完全相同的时间给药。相反，其表示，本发明的抗体和其它药剂或药剂顺序地或者在时间间隔内给药，以使得它们可以一起起作用，从而提供相比于仅本发明的抗体或其它药剂治疗提高的益处。在一个实施方式中，抗体和其它药剂加和地起作用，例如它们协同地起作用。此类分子适合以组合存在，存在量是对于预期目的有效的。熟练的医学从业者可以凭经验或通过考虑药剂的药代动力学和作用模式确定每种治疗剂的合适剂量以及给药的合适时间和方法。在一个实施方式中，将本发明的抗体与ー种或多种包含抗体或Fe的另外的分子一起使用。本发明的抗体可以与与一种或多种其它抗体共同施用，所述其它抗体具有治疗相同疾病或另外的同病的效用，例如可以施用识别在给定癌症类型中过表达的两种抗原的两种抗体。在一个实施方式中，将本发明的抗体与化学治疗剂一起施用。本文使用的“化学治疗剂”表示可用于治疗癌症的化合物。化学治疗剂的实例包括但不限于烷基化药齐U，例如塞替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯例如白消安、胺丙磺酯和哌泊舒凡、雄激素例如卡鲁睾酮、丙酸甲雄烷酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酷、抗肾上腺物质例如氨鲁米特、米拓坦、曲洛司坦、抗雄激素例如氟他胺、尼鲁米持、比卡鲁胺、亮丙瑞林、和戈舍瑞林；抗生素例如阿克拉霉素、放线菌素、蒽霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素、卡奇霉素、卡柔比星、洋红霉素、carzinophilm、着色霉素(chromomycin)、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星、表阿霉素、表柔比星、伊达比星、麻希罗霉素、丝裂霉素、霉酹酸、诺加霉素、橄榄霉素、派来霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、多柔比星、链黑霉素、链脲霉素、杀結核菌素、乌苯美司、净司他汀、佐柔比星；抗雄激素包括例如它莫西芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制性的4(5)-咪唑、4-羟基三苯氧胺、三氧杂环己烷、keoxifene、LY 117018、奥纳司酮、和托瑞米芬(Fareston);抗代谢剂例如甲氨蝶呤和5_氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物例如ニ甲叶酸、氨甲叶酸、蝶罗呤、三甲曲沙；氮杂环丙烷例如benzodopa、卡波醌、meturedopa、和uredopa ;こ烯亚胺和六甲蜜胺包括克瘤灵、曲他月安、trietylenephosphoramide、thethyIenetniophosphaoramide 和三甲 3 三聚氣胺；叶酸补充剂例如亚叶酸；氮芥例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、雌莫司汀、异磷 酰胺、甲氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆留醇、破尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；硝铵例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫丝汀、雷莫司汀；钼类似物例如顺钼和卡波钼；长春碱；钼；蛋白例如精氨酸脱亚氨酶和天冬酰胺酶；嘌呤类似物例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、ニ脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、伊诺他滨、氟尿苷、5-FU;紫杉烷，例如紫衫醇(TAX0L , Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N. J.)和多西他赛(TAX0TERE ; Rhne-Poulenc Rorer, Antony, France);拓扑异构酶抑制剂 RFS 2000 ；胸苷酸合成酶抑制剂(例如Tomudex);另外的化学治疗剂包括醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基こ酰丙酸；安卩丫唳；bestrabucil ;比生群；依达曲沙；defofamine ;地美可辛；地卩丫醌；ニ氟甲基鸟氨酸(DMFO) ；elformithine ;こ酸elliptinium ;依托格鲁；硝酸镓；轻基脲；香燕多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；nitracrine ;喷司他汀；phenamet ;批柔比星；podophyllinic acid ；2~こ基酰肼；甲基苯肼;PSK ;丙亚胺;西佐喃；锗螺胺；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2，2’，2〃-三氯三こ胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；ニ溴甘露醇；ニ溴卫矛醇；哌泊溴烷；gaCyt0Sine ;阿拉伯糖苷(“Ara_C”)；环磷酰胺；塞替派；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6_硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；依托泊苷(VP-16);异环磷酰胺；丝裂霉素C ;米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；去甲长春碱；诺安托；替尼泊苷；道诺霉素；氨蝶呤；希罗达；依班磷酸酯；CPT-11 ;视黄酸；esperamicins ;卡培他滨。也可以使用上述任何一种的药学上可接受的盐、酸、或衍生物。 化学治疗剂或其它细胞毒性剂可以以前药施用。本文使用的“前药”表示药学活性物质的前体或衍生物形式，与亲本药物相比，其对肿瘤细胞的细胞毒性更小且能够被酶促活化或转化成更有活性的亲本形式。參见，例如Wilman, 1986, Biochemical SocietyTransactions, 615th Meeting Belfast, 14:375-382 ;Stella 等人，〃 Prodrugs:A ChemicalApproach to Targeted Drug Delivery, "Directed Drug Delivery ；和 Borchardt 等人，(ed.) :247-267，Humana Press, 1985。可以用于本发明的前药包括但不限于含有磷酸盐的前药、含有硫代磷酸盐的前药、含有硫酸盐的前药、含有肽的前药、D-氨基酸-修饰的前药、糖基化的前药、含有内酰胺的前药、含有任选地取代的苯氧基こ酰胺的前药或含有任选地取代的苯基こ酰胺的前药、可以转化成更有活性的细胞毒性游离药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷的前药。可以衍生化成可用于本发明的抗体的前药形式的细胞毒性药物的实例包括但不限于任何前述化学治疗剂。在另ー个实施方式中，将抗体与ー种或多种免疫调节剂一起使用。此类药剂可以提高或降低一种或多种细胞因子的产生、增量调节或减量调节自抗原呈递、掩蔽MHC抗原、或促进ー种或多种类型的免疫细胞増殖、分化、迁移或激活状态。免疫调节剂包括但不限于非留体抗炎药(NSAID)，例如阿司匹林、布洛芬、塞来考昔、双氯芬酸、依托度酸、非诺洛芬、吲哚美辛、ketoralac、丙嗪、萘丁美酮、舒林酸、托美丁、罗非考昔、萘普生、酮洛芬、和萘布美酮、留类(例如糖皮质激素、地塞米松、可的松、羟基可的松、甲基强的松龙、强的松、强的松龙、氟轻强的松龙、azulfidineicosanoid例如前列腺素、血栓素、和白三烯、以及局部甾类例如蒽啉、钙泊三醇、氯倍他索、和他扎罗汀)、细胞因子例如TGFb、IFN、IFNP、IFN Y、IL-2、IL-4、IL-10、细胞因子、趋化因子、或受体拮抗剂包括抗体、可溶受体、和抗BAFF的受体-Fe 融合物、87、(0 2、(0 5、0)2、0)3、0)4、0)6、0)7、0)8、0)11、0)14、0)15、0)17、0) 18、CD20、CD23、CD28、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD402、CD64、CD80、CD86、CD147、CD152、补体因子(C5、D)CTLA4、eotaxin、Fas、ICAM、I COS, IFN、IFN^、IFN Y、IFNAR、IgE、IL-U IL-2,IL-2R、IL-4、IL-5R、IL-6、IL-8、IL-9IL-12、IL-13、IL-13R1、IL-15、IL-18R、IL-23、整合素、LFA-1、LFA-3、MHC, selectin、TGF^、TNF, TNF^、TNF-RU T-细胞受体、包括Eilbrel (依那西普)、Humira (阿达姆单抗)、和Remicade (英夫利西单抗)、异源抗-淋巴细胞球蛋白；其它免疫调节分子例如2-氨基-6-芳基1-5取代的嘧啶，用于MHC结合肽和MHC片段的抗独特型抗体、硝基咪唑硫嘌呤、布喹那、溴隐亭、环磷酰胺、环孢霉素A、D-青霉胺、deoxyspergualm、FK506、戍ニ醒、金、轻基氯喹、来氟米特、malononitriIoamide (例如来氟米持)、甲氨蝶呤、ニ甲胺四环素、咪唑立宾、麦考酚酸莫酯、雷帕霉素、和sulfasasazine。在ー个替代实施方式中，将本发明的抗体与细胞因子一起施用。本文使用的“细胞因子”表示由一个细胞群释放的蛋白的一般术语，所述蛋白作为细胞间介质作用于另ー个细胞上。此类细胞因子的实例为淋巴因子、单核因子、和传统的多肽激素。所述细胞因子包括生长激素，例如人生长激素、N-甲ニ磺酰基人生长激素、和牛生长激素；甲状旁腺激素、甲状腺素；胰岛素；胰岛素原、松弛肽、前松弛肽、糖蛋白激素例如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、和促黄体激素(LH)、肝细胞生长因子、纤维母细胞生长因子；泌乳素、胎盘催乳激素、肿瘤坏死因子-a和-3 ;苗勒氏管抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素；激活素、血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO);神经生长因子例如NGF-^ ;血小板生长因子、转化生长因子(TGF)例如TGF-a和TGF-0、胰岛素样生长因子-1和-II ;红细胞生成素(EPO)、骨生成诱导因子、干扰素例如干扰素-a、0、和-Y、集落刺激因子(CSF)例如巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)、和粒细胞-CSF(G-CSF)、白介素(IL)例如 IL-UIL-I a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、肿瘤坏死因子例如TNF-a或TNF-0、和其它多肽因子包括LIF和kit配体(KL)。本文使用的术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白和天然系列细胞因子的生物活性等同物。
在一个实施方式中，将细胞因子或其它刺激细胞的免疫系统的药剂与本发明的抗体共同施用。这种治疗模式可以增强期望的效应物功能。例如，可以共同施用刺激NK细胞的药剂，包括但不限于IL-2。在另ー个实施方式中，可以共同施用刺激巨噬细胞的药齐U，包括但不限于C5a、甲酰基肽例如N-甲酰基-甲ニ磺酰基-亮氨酰基-苯基丙氨酸(Beigier-Bompadre 等人(2003) Scand J. immunol. 57. 221-8)。并且，可以施用刺激嗜中性粒细胞的药剂，包括但不限于G-CSF、GM-CSF等。此外，可以使用促进此类免疫刺激细胞因子的迁移的药剂。并且，包括但不限于干扰素Y、IL-3和IL-7的药剂可以促进ー个或多个效应物功能。在ー个替代实施方式中，将细胞因子或其它抑制效应物细胞功能的药剂与本发明的抗体共同施用。这种治疗模式可以限制不期望的效应物功能。可以将本发明的抗体其它治疗方案组合。例如，在一个实施方式中，要用本发明的抗体治疗的患者还可以接受放射治疗。可以根据本领域通常使用的和技术人员已知的方案施用放射治疗。这种治疗包括但不限于铯、铱、碘、或钴放射。所述放射治疗可以为全身放射或可以为直接局部针对身体内或身体上的特定位点或组织，例如肺、膀胱或前列腺。通 常，以脉冲形式经过约I至2周的时间段施用放射治疗。然而，可以经更长时间段施用放射治疗。例如，可以放射治疗施用给具有头颈癌的患者约6至约7周。任选地，可以以单个剂量或多个顺序剂量施用所述放射治疗。熟练的医学从业者可以凭经验确定本文可用的放射治疗的合适剂量。根据本发明的其它实施方式利用本发明的抗体和一种或多种其它抗癌疗法来离体治疗癌细胞。考虑到的是，这样的离体治疗可以用于骨髄移植、尤其是自体骨髄移植。例如，用抗体和一种或多种其它抗癌疗法(例如上文所述的)治疗细胞或含有癌细胞的组织，可以利用所述治疗来在受体患者移植之前耗竭或基本上耗竭癌细胞。确定涵盖的是，本发明的抗体可以组合利用再其它治疗技术，例如手术或光线疗法。还通过下述实施例示例了本发明。然而，应当理解，本发明不限于例示的实施方式。实施例材料和方法A.细菌菌株和质粒将大肠杆菌DH5a(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)用于扩增质粒和克隆。B.细胞系将用于产生重组hum_FLT3特定抗体衍生物的小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0_Agl4(ATCC，美国模式培养物保藏中心，Manassas, VA，USA)在补充了下述物质的IMDM (PAN-Biotech, Aidenbach, Germany)中培养10%胎牛血清(PAN-Biotech, Aidenbach, Germany)、1%青霉素和链霉素(Lonza, Basel, Switzerland)。用 lmg/ml G418 (Invitrogen, Karlsruhe, Germany)选择稳定的转染子。将分泌小鼠IgGl/ K抗人FLT3特异性抗体的杂交瘤细胞系BVlO和4G8(获自H-J.Biihring 博士, UKT Tubingen, Germany)在补充了下述物质的 RPMI 1640 (PAN-Biotech, Aidenbach, Germany)中培养10% 胎牛血清(PAN-Biotech, Aidenbach, Germany)、1% 青霉素和
(Lonza, Basel, Switzerland)。
在RPMI 1640 中保持通过密度梯度离心(LSM 1077, Lonza, Basel, Switzerland)获得的外周血单核细胞(PBMC)、杂交瘤细胞和NALM16细胞(R. Handgretinger, Departmentof Pediatrics, University of Tiibingen 的馈赠)，在 IMDM 培养基(Lonza)中保持小鼠Sp2/0-Agl4细胞(ATCC，Manassas，USA)。所有培养基都补充了 10%热灭活的胎牛血清、100U/ml青霉素、IOOii g/ml链霉素、ImM丙酮酸钠、非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺和57nM3 -巯基こ醇。C. FLT3-转染子从ImaGenes, Berlin, Germany 获得人 FLT3 的全长 cDNA(GenBank#BC126350)。使用添加的BamHI-和XbaI-限制性位点将cDNA克隆到pcDNA3载体中，然后通过电穿孔转染到Sp2/0-Agl4细胞中。D.抗体和流式细胞术
从BD Biosciences (Heidelberg, Germany)购买 CD33_PE_Cy5 (克隆 WM53)、CD34-APC (克隆 581)、CD-45-FITC (克隆 HI30)、CD123_PE_Cy5 (克隆 9F5)、CDllc-PE (克隆 B_ly6)和同种型对照抗体，从 Miltenyi Biotech (Bergisch-Gladbach, Germany)购买⑶303-FITC抗体。将全部抗体与细胞一起在4° C下孵育30分钟。为了进行间接免疫荧光法，分别使用PE-或APC-缀合的山羊-杭-小鼠F (ab) 2-片段和山羊-杭-人F (ab) 2-片段(Jackson ImmunoResearch, West Grove, USA)。在若干实验中，我们组合了间接和直接免疫荧光法以进行多维度分析，其中在最后步骤添加了标记的抗体。在FACSCanto II或FACSCalibur (Becton Dickinson)上分析细胞。用于间接免疫突光法(QlFIKIl )分析的珠子购自Dako (Hamburg, Germany)并根据制造商的方案使用。对于人源化抗体的定量，无法得到适合的珠子。因此，通过将用4G8SDIEM获得的平均荧光强度除以用非结合的SDIE-修饰的对照抗体9. 2. 27检测到的平均荧光强度，计算具体荧光系数(SFI)。为进行这些实验,使用用Lynx快速PE抗体缀合试剂盒(AbD Serotec, Diisseldorf, Germany)产生的 PE 缀合的抗体。重组 FLT3 配体(rFLT3L)购自 Peprotech EC (London, Great Britain)。为进行竞争实验。将各种浓度的rFLT3L与NALM16细胞和BV10SDIEM或4G8SDIEM(1 u g/ml) 一起在4° C下孵育30分钟，然后通过间接免疫荧光法和流式细胞术分析。E. 3 THl-甲基-胸腺嘧啶掺入测定将2xl05个AML母细胞一式三份地接种于96孔板中，然后与各种浓度的最优化的抗体一起孵育。24小时后，再用3[H]_甲基-胸苷(0，5iiCi/孔)脉冲细胞20小时，然后在过滤垫上收集细胞。通过在2450微量板计数器(Perkin Elmer, Waltham, USA)中进行液态闪烁计数而测定掺入的放射活性。F. 51「Cr1_ 释放测定将NALM16细胞和原代AML母细胞用作靶物。为了从白血病患者的PBMC制备物中分离母细胞和效应物细胞，用用⑶34和⑶33微珠标记细胞，然后根据制造商(MiltenyiBiotec)的方案在LD柱上分离。通过FACS分析测定反向筛选的效应物细胞群中的污染母细胞的数量，取决于初始母细胞污染情况，所述数量在1%至10%之间而变。在一些试验中，将标记的DC用作祀细胞。如前所述进行铬释放测定(Otz T, Grosse-Hovest L, HofmannMj Rammensee Hbj Jung Ir. A bispecmc singlechain antibody that mediates targetcell-restricted，supra—agonistic CD28 stimulation and killing 01 lymphomacells. Leukemia. 2009; 23 (I) :7ト77)。简而言之，在96孔平底板中，在各种浓度的抗体存在下，以50:1的PBMC:靶物比率，将标记的靶细胞和PBMC在37° C下孵育4或8小时。根据公式[cpm(测试)-cpm(自发)/[cpm(triton裂解)]-cpm(自发)]计算特定51 [Cr]释放百分比。如果将白血病母细胞用作靶物，在一些实验中加入无抗体的效应物细胞降低了自发51[Cr]释放，从而导致特定释放的负值。G.杭原转夺在RPMI 1640培养基中将NALM16细胞或AML母细胞与各种浓度的4G8SDIEM或BV10SDIEM—起孵育。24或48小时后，用冰冷的FACS-缓冲液洗涤细胞，在4° C下用饱和浓度的4G8SDIEM(2 u g/ml) 一起孵育30分钟，用PE-缀合的山羊-杭-人F(ab) 2-片段染色，然后通过FACS分析。计算FLT3的相对表面表达，其中将无抗体预富裕的细胞的平均荧光強度定义为100%。H.树突细胞(DC)分离和成熟 使用血液DC分离试剂盒II、根据制造商的方案(Miltenyi Biotec)从健康个体的暗黄覆盖层制备物中分离DC。用CDllc-PE、CD303-FITC和CD123_PE_Cy5抗体的混合物对骨髓(mDC)和类浆细胞(pDC)亚组进行染色。为了体外产生mDC，将健康个体的IxlO8个PBMC 接种于 IOml X_Vivol5 培养基(Gibco, Darmstadt, Germany)中。2 小时后,在补充了50ng/ml GM-CSF和IL-4(20ng/ml)的RPMI 1640培养基中，在37。C下培养粘附的细胞5天。在第6天,加入LPS(100ng/ml)。在第7天收获细胞,然后通过流式细胞术分析。I.集落形成单元测定通过灌洗经历髋关节手术的患者的股骨头获得骨髓细胞。通过密度梯度离心纯化所述细胞，然后以107/ml接种于含有5 u g/ml 4G8SDIEM或9. 2. 27SDIE的RPMI 1640培养基中。孵育24小时后，将细胞转移到含有抗体(5iig/ml)的甲基纤维素培养基(10. 000个细胞/ml, MethoCult H4434 classic, Stemcell Technologies, Grenoble, France)中。一式三份地进行所述測定。12天后，计算集落井分类。实施例I :来自FLT3特异性抗体的未知序列的鉴定A.编码V区的DNA的克降通过PCR进行V区的克隆。大多数技术从mRNA开始，并且利用抗体V区的相似 (Kabat, E. A. , ffu, T. T. , Reid-Miiller, M. , Perry, H. M. , Gottesman, K.b.Sequences of Proteins of immunological interest,4th ed. U. S. Departmentof Health and Human Services,Public Health Service, National Institute ofHealth, Bethesda, MD. 1987),所述相似性使得可以设计用于可能的PCR扩增的简并引物(Larrick, J. ff. , Danielison，L. , Brenner, C. A. , Wallace, E. F. , Abrahamson, M. , Fry, K.E.,Borrebaeck, C. A. K. Polymerase chain reaction used mixed primers: cloning of ahuman monoclonal antibody variable region genes from single hybridoma cells.Bio/Technology 7 :934-938, 1989 ；0rlandi, R. , Giissow, D. H. , Jones, P. T. , Winter, G.しloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chainreaction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-3837，1989)。然而，完整 V 的无偏差扩增需要简并引物的非常复杂的集合(Marks J. D. , Hoogenboom H. R. , Bonnert T. P. , McCaffertyJ.,Griffitns A.D. , Winter G.By-passing immunization. Human antibodies fromV-gene libraries displayed on phage. J. Mol. Biol. 222:581-597，1991 )。通过此方法仍然可能克隆具有非常非典型序列的V区。此外，初始序列会在那些被引物覆盖的部分中丢失。这些区域中的氨基酸看起来有助于⑶R区的正确折叠(Chothia, C.，Lesk, A. M.
,Tramontano, A. , Levitt, M. , Smith-Gi11，S. J.等人 Conformations of immunoglobulinhypervariable regions. Nature, 342:877-883，1989)。处于此原因，利用简并引物的 V-区克隆能够导致降低的抗体亲和カ规避这些潜在问题的方法是用匹配抗体的已知恒定区序列的引物，通过反向聚合酶链反应(iPCR)克隆抗体的两条链。所述克隆操作程序的示意图示例于图I。使用RNeasy试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany),应用为了仅分离胞质RNA而修改的方案，从杂交瘤细胞系BVlO和4G8制备胞质RNA(Rappold I.，Ziegler B. L. , KdhlerI. , Marchetto S. , Rosnet 0. , Birnbaum D. , Simmons P. J. , Zannettino A. C. , Hill B. , NeuS., Knapp W.，Alitaio R.，Alitalo K.，Ullrich A., Kanz L. , Biihring H. J. Functional andphenotypic characterization of cord blood and bone marrow subsets expressing FLT3(CD 135)receptor tyrosine kinase.Blood, 90:111-125，1997)。使用寡聚物(dT) 15引物，使用cDNA合成系统(Roche, Mannheim, Germany),从0，3-2 u gmRNA制备双链cDNA(ds-cDNA)。更具体地，为了允许DNA链的平端形成，将ds-cDNA与T4-DNA聚合酶一起孵育。用等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1) —次性提取反应混合物，然后用こ醇沉淀。将溶解的ds-cDNA沉淀与T4DNA连接酶(Roche, Mannheim, Germany)一起孵育以环化所述 cDNA(Uematsu Y. A novel and rapid cloning method for theT-cell receptor variable region sequences. Immunogenetics, 34:174-178，1991)。通过环化将3’ poly (A)尾连接至cDNA的未知5’末端。B.免疫球蛋白可变区cDNA的PCR扩增在iPCR反应中使用2个向外定向的恒定区特定引物(总结于表I中)允许重排的轻链和重链基因区段的整个cDNA的扩增。将1-5 u I环化的ds-cDNA包括在50 U I标准的PCR反应(HotStar Taq DNA聚合酶，Qiagen, Hilden, Germany)中，其中对于轻链扩增采用引物对Ck-for和Ck-back,对于重链扩增采用引物对gammal-for和gammal-back。将所述引物设计为与cDNA的恒定区退火。以下述条件进行40个扩增循环在94° C下30分钟，在56° C下I分钟，在72° C下2分钟30秒。所得扩增产物含有完整的V区、5’UT区、pA尾、3’UT区并且侧翼为恒定区序列。在1%琼脂糖凝胶上分离获自反相PCR的DNA。切出相应大小的DNA带(轻链约IOOObp ;重链约1600bp)，然后标准技术分离(Maniatis等人1982)并克隆到pGEM-T Easy载体(Promega, Madison, WI, USA)中。为了进行序列測定,采用载体体系的标准引物和免疫球蛋白恒定区特定引物(轻链k-forl和k-for2 ;重链CGl_forl、CGl-for2, CGl-revl, CGl-rev2)(參见表 I)。表I :用于FLT3特异性抗体的VJ和VDJ区的扩增和测序的引物
权利要求
1.一种结合人受体酪氨酸激酶FLT3的抗体，所述抗体包含重链和/或轻链且相对于亲本抗FLT3抗体，所述抗体在恒定区中包含至少一个氨基酸置换，其中所述至少一个氨基酸置换包括氨基酸置换S239D和I332E，其中位置编号根据EU索引。
2.根据权利要求I所述的抗体，其中所述抗体具有抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应物功能。
3.根据权利要求I或2所述的抗体，其中所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含VhCDRUVh CDR2JPVh CDR3 区，所述轻链包含'CDRl、V1^ CDR2、和 Vl CDR3，其中 所述'CDRl包含选自下述的氨基酸序列、基本上由选自下述的氨基酸序列组成或由选自下述的氨基酸序列组成氨基酸序列SEQ ID NO: I和SEQ ID NO:7 ； 所述'CDR2包含选自下述的氨基酸序列、基本上由选自下述的氨基酸序列组成或由选自下述的氨基酸序列组成氨基酸序列SEQ ID N0:2和SEQ ID NO:8 ； 所述'CDR3包含选自下述的氨基酸序列、基本上由选自下述的氨基酸序列组成或由选自下述的氨基酸序列组成氨基酸序列SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:9 ； 所述Vh CDRl包含选自下述的氨基酸序列、基本上由选自下述的氨基酸序列组成或由选自下述的氨基酸序列组成氨基酸序列SEQ ID N0:4和SEQ ID NO: 10; 所述Vh CDR2包含选自下述的氨基酸序列、基本上由选自下述的氨基酸序列组成或由选自下述的氨基酸序列组成氨基酸序列SEQ ID NO:5和SEQ ID NO: 11 ;并且 所述Vh CDR3包含选自下述的氨基酸序列、基本上由选自下述的氨基酸序列组成或由选自下述的氨基酸序列组成氨基酸序列SEQ ID NO:6和SEQ ID NO: 12。
4.根据权利要求3所述的抗体，其中所述'⑶Rl包含SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列组成；所述' CDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成；所述' CDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成；所述Vh CDRl包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成或由SEQ IDN0:4所示的氨基酸序列组成；所述Vh⑶R2包含SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列组成；以及所述Vh⑶R3包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列组成。
5.根据权利要求3所述的抗体，其中所述'⑶Rl包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列组成；所述'CDR2包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成；所述' CDR3包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列组成；所述Vh CDRl包含SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列组成；所述Vh⑶R2包含SEQID NO: 11所示的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列组成或由SEQ IDNO: 11所示的氨基酸序列组成；所述Vh⑶R3包含SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列组成。
6.根据权利要求3或4所述的抗体，其中所述重链包含Vh结构域，所述Vh结构域包含SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列组成，并且所述轻链包含'结构域，所述'结构域包含SEQID NO: 13所示的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列组成或由SEQ IDNO: 13所示的氨基酸序列组成。
7.根据权利要求3或5所述的抗体，其中所述重链包含Vh结构域，所述Vh结构域包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列组成或由SEQ ID N0:30所示的氨基酸序列组成，并且所述轻链包含'结构域，所述'结构域包含SEQID NO:29所示的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列组成或由SEQ IDNO:29所示的氨基酸序列组成。
8.根据权利要求3所述的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体并且包含具有SEQID NO: 27所示的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列的轻链。
9.根据权利要求3所述的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体并且包含具有SEQID NO: 43所示的氨基酸序列的重链和/或具有SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列的轻链。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的抗体，其中与所述亲本抗体相比，所述抗体以增强的亲和力结合Fe YRIIIa受体或具有增强的ADCC效应物功能。
11.根据权利要求ι- ο中任一项所述的抗体，其在选自下述的位置处包含一个或多个其它氨基酸修饰221、222、223、224、225、227、228、230、231、232、233、234、235、236、237、238、240、241、243、244、245、246、247、249、255、258、260、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、278、280、281、282、283、284、285、286、288、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、313、317、318、320、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、333、334、335、336、和 337，其中位置编号根据 EU索引。
12.根据权利要求11所述的抗体，其中所述一个或多个其它氨基酸修饰选自下述氨基酸置换221K、221Y、222E、222Y、223E、223K、224E、224Y、225E、225K、225W、227E、227G、227K、227Y、228E、228G、228K、228Y、230A、230E、230G、230Y、231E、231G、231K、231P、231Y、232E、232G、232K、232Y、233A、233D、233F、233G、233H、233I、233K、233L、233M、233N、233Q、233R、233S、233T、233V、233W、233Y、234A、234D、234E、234F、234G、234H、2341、234K、234M、234N、234P、234Q、234R、234S、234T、234V、234W、234Y、235A、235D、235E、235F、235G、235H、2351、235K、235M、235N、235P、235Q、235R、235S、235T、235V、235W、235Y、236A、236D、236E、236F、236H、236I、236K、236L、236M、236N、236P、236Q、236R、236S、236T、236V、236W、236Y、237D、237E、237F、237H、237I、237K、237L、237M、237N、237P、237Q、237R、237S、237T、237V、237W、237Y、238D、238E、238F、238G、238H、238I、238K、238L、238M、238N、238Q、238R、238S、238T、238V、238W、238Y、240A、2401、240M、240T、241D、241E、241L、241R、241S、241W、241Y、243E、243H、243L、243Q、243R、243W、243Y、244H、245A、246D、246E、246H、246Y、247G、247V、249H、249Q、249Y、255E、255Y、258H、258S、258Y、260D、260E、260H、260Y、262A、262E、262F、262I、262T、263A、263I、263M、263T、264A、264D、264E、264F、264G、264H、264I、264K、264L、264M、264N、264P、264Q、264R、264S、264T、264W、264Y、265F、265G、265H、265I、265K、265L、265M、265N、265P、265Q、265R、265S、265T、265V、265W、265Y、266A、266I、266M、266T、267D、267E、267F、267H、267I、267K、267L、267M、267N、267P、267Q、267R、267T、267V、267W、267Y、268D、268E、268F、268G、268I、268K、268L、268M、268P、268Q、268R、268T、268V、268W、269F、269G、269H、269I、269K、269L、269M、269N、269P、269R、269S、269T、269V、269W、269Y、270F、270G、270H、270I、270L、270M、270P、270Q、270R、270S、270T、270W、270Y、271A、271D、271E、271F、271G、271H、2711、271K、271L、271M、271N、271Q、271R、271S、271T、271V、271W、271Y、272D、272F、272G、272H、272I、272K、272L、272M、272P、272R、272S、272T、272V、272W、272Y、273I、274D、274E、274F、274G、274H、2741、274L、274M、274N、274P、274R、274T、274V、274W、274Y、275L、275W、276D、276E、276F、276G、276H、2761、276L、276M、276P、276R、276S、276T、276V、276W、276Y、278D、278E、278G、278H、2781、278K、278L、278M、278N、278P、278Q、278R、278S、278T、278V、278W、280G、280K、280L、280P、280W、281D、281E、281K、281N、281P、281Q、281Y、282E、282G、282K、282P、282Y、283G、283H、283K、283L、283P、283R、283Y、284D、284E、284L、284N、284Q、284T、284Y、285D、285E、285K、285Q、285W、285Y、286E、286G、286P、286Y、288D、288E、288Y、290D、290H、290L、290N、290W、291D、291E、291G、291H、2911、291Q、291T、292D、292E、292T、292Y、293F、293G、293H、293I、293L、293M、293N、293P、293R、293S、293T、293V、293W、293Y、294F、294G、294H、294I、294K、294L、294M、294P、294R、294S、294T、294V、294W、294Y、295D、295E、295F、295G、295H、2951、295M、295N、295P、295R、295S、295T、295V、295W、295Y、296A、296D、296E、296G、296H、2961、296K、296L、296M、296N、296Q、296R、296S、296T、296V、297D、297E、297F、297G、297H、2971、297K、297L、297M、297P、297Q、297R、297S、297T、297V、297W、297Y、298A、298D、298E、298F、298H、2981、298K、298M、298N、298Q、298R、298T、298W、298Y、299A、299D、299E、299F、299G、299H、2991、299K、299L、299M、299N、299P、299Q、299R、299S、299V、299W、299Y、300A、300D、300E、300G、300H、300K、300M、300N、300P、300Q、300R、300S、300T、300V、300W、301D、301E、301H、301Y、3021、303D、303E、303Y、304D、304H、304L、304N、304T、305E、305T、305Y、313F、317E、317Q、318H、318L、318Q、318R、318Y、320D、320F、320G、320H、320I、320L、320N、320P、320S、320T、320V、320W、320Y、322D、322F、322G、322H、322I、322P、322S、322T、322V、322W、322Y、323I、324D、324F、324G、324H、3241、324L、324M、324P、324R、324T、324V、324W、324Y、325A、325D、325E、325F、325G、325H、3251、325K、325L、325M、325P、325Q、325R、325S、325T、325V、325W、325Y、326E、3261、326L、326P、326T、327D、327E、327F、327H、3271、327K、327L、327M、327N、327P、327R、327S、327T、327V、327W、327Y、328A、328D、328E、328F、328G、328H、3281、328K、328M、328N、328P、328Q、328R、328S、328T、328V、328W、328Y、329D、329E、329F、329G、329H、3291、329K、329L、329M、329N、329Q、329R、329S、329T、329V、329W、329Y、330E、330F、330G、330H、3301、330L、330M、330N、330P、330R、330S、330T、330V、330W、330Y、331D、331F、331H、3311、331L、331M、331Q、331R、331T、331V、331W、331Y、333A、333F、333H、333I、333L、333M、333P、333T、333Y、334A、334F、334I、334L、334P、334T、335D、335F、335G、335H、335I、335L、335M、335N、335P、335R、335S、335V、335W、335Y、336E、336K、336Y、337E、337H、和 337N，其中位置编号根据 EU 索引。
13.根据权利要求11所述的抗体，其中所述一个或多个其它氨基酸修饰处在选自下述的位置:221、222、223、224、225、228、230、231、232、240、244、245、247、262、263、266、271、.273、275、281、284、291、299、302、304、313、323、325、328、和 336，其中位置编号根据 EU 索引。
14.根据权利要求13所述的抗体，其中所述一个或多个其它氨基酸修饰选自下述氨基酸置换221K、221Y、222E、222Y、223E、223K、224E、224Y、225E、225K、225W、228E、228G、228K、228Y、230A、230E、230G、230Y、231E、231G、231K、231P、231Y、232E、232G、232K、232Y、240A、240I、240M、240T、244H、245A、247G、247V、262A、262E、262F、2621、262T、263A、2631、263M、263T、266A、2661、266M、266T、271A、271D、271E、271F、271G、271H、2711、271K、271L、271M、271N、271Q、271R、271S、271T、271V、271W、271Y、273I、275L、275W、281D、281E、281K、281N、281P、281Q、281Y、284D、284E、284L、284N、284Q、284T、284Y、291D、291E、291G、291H、2911、291Q、291T、299A、299D、299E、299F、299G、299H、299I、299K、299L、299M、299N、299P、299Q、299R、299S、299V、299W、299Y、304D、304H、304L、304N、304T、313F、323I、325A、325D、325E、325F、325G、325H、3251、325K、325L、325M、325P、325Q、325R、325S、325T、325V、325W、325Y、328A、328D、328E、328F、328G、328H、3281、328K、328M、328N、328P、328Q、328R、328S、328T、328V、328W、328Y、336E、336K、和 336Y。
15.根据权利要求11所述的抗体，其中所述一个或多个其它氨基酸修饰选自236A、268D、268E、330Y、和 330L。
16.一种核酸分子，其编码根据权利要求1-15中任一项所述的抗体的重链或轻链。
17.根据权利要求16所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含编码所述轻链的可变结构域的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自SEQ ID N0:17和SEQ ID N0:33所示的核苷酸序列。
18.根据权利要求16所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含编码所述重链的可变结构域的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自SEQ ID N0:18和SEQ ID N0:34所示的核苷酸序列。
19.根据权利要求16所述的核酸分子，其中编码本发明的抗体的轻链的核酸分子具有选自SEQ ID No. 24和SEQ ID No. 40的核苷酸序列。
20.根据权利要求16所述的核酸分子，其中编码本发明的抗体的重链的核酸分子具有选自SEQ ID No. 28和SEQ ID No. 44的核苷酸序列。
21.一种治疗人受体酪氨酸激酶FLT3相关的疾病或障碍的方法，其中所述方法包括给有此需要的受试者施用根据权利要求1-15中任一项所述的抗体。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述受试者为哺乳动物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述哺乳动物为人。
24.根据权利要求21-23中任一项所述的方法，其中所述疾病或障碍为细胞增殖性疾病或障碍。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述细胞增殖性疾病或障碍为造血系统出现的肿瘤或骨髓增生异常综合征(MDS)。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述肿瘤为淋巴瘤或白血病。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述淋巴瘤或白血病处于微小残留病(MRD)阶段。
28.根据权利要求26或27所述的方法,其中所述淋巴瘤或白血病选自非霍金奇淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、B-细胞急性淋巴细胞性白血病/淋巴瘤(B-ALL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、毛细胞白血病(HCL)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓性白血病(AML)、和多发性骨髓瘤(丽)。
29.根据权利要求21-28中任一项所述的方法，其中所述抗体与至少一种选自下述的药剂组合给药细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、激酶抑制剂、抗血管生成剂、保心剂、免疫刺激剂、免疫抑制剂、血管生成抑制剂、蛋白酪氨酸激酶抑制剂和第二抗体。
30.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-15中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体。
31.一种抑制表达FLT3的细胞增殖的方法，其中所述方法包括使所述细胞与根据权利要求1-15中任一项所述的抗体接触。
32.—种增强对于表达FLT3的细胞的抗体依赖性细胞毒性的方法，其中所述方法包括使所述细胞与根据权利要求1-15中任一项所述的抗体接触。
33.一种耗竭哺乳动物的至少一种表达FLT3的细胞的方法，其中所述方法包括给所述哺乳动物施用根据权利要求1-15中任一项所述的抗体。
34.根据权利要求1-15中任一项所述的抗体用于制备治疗FLT3相关的疾病或障碍的药物的用途。
35.根据权利要求34所述的用途，其中所述疾病或障碍为细胞增殖性疾病或障碍。
36.根据权利要求35所述的用途，其中所述疾病或障碍为造血系统出现的肿瘤或骨髓增生异常综合征(MDS)。
37.根据权利要求36所述的用途，其中所述肿瘤为淋巴瘤或白血病。
38.根据权利要求37所述的用途，其中所述淋巴瘤或白血病处于微小残留病(MRD)的阶段。
39.根据权利要求37或38所述的方法，其中所述淋巴瘤或白血病选自非霍金奇淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、B-细胞急性淋巴细胞性白血病/淋巴瘤(B-ALL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、毛细胞白血病(HCL)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓性白血病(AML)、和多发性骨髓瘤(丽)。
40.根据权利要求1-15中任一项所述的抗体用于以表达FLT3的细胞为靶向的用途。
41.根据权利要求1-15中任一项所述的抗体用于检测生物样品中表达FLT3的细胞的用途。
42.根据权利要求1-15中任一项所述的单克隆抗体，其中所述抗体由经转染的细胞系产生。
43.经转染的细胞系，其产生根据权利要求1-15中任一项所述的抗体。
全文摘要
本发明涉及具有修饰的Fc区的抗FLT3抗体，所述修饰的Fc区包含氨基酸置换239D和332E以增强这些抗体的抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)。本发明还涉及含有这些抗体的药物组合物、编码这些抗体的核酸以及使用此类抗体的方法。
文档编号C07K16/28GK102770453SQ201080064659
公开日2012年11月7日 申请日期2010年12月23日 优先权日2009年12月23日
发明者G·荣格, H·J·比林, L·格罗塞霍维斯特, M·霍夫曼, S·奥尔沃姆 申请人:合成免疫股份有限公司