具有降低的免疫原性的bmp-7变体的制作方法

专利名称：具有降低的免疫原性的bmp-7变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及已经被修饰以降低免疫原性的骨形态发生蛋白-7(BMP_7)和修饰BMP-7以降低免疫原性的方法。
背景技术：
BMP-7，也称为成骨蛋白-I (0P-1)，是能够诱导骨生长的蛋白质，其可用于治疗各种软骨和骨的疾病和缺陷。例如，重组人BMP-7在全球已被用于治疗超过40，000位的患者。然而，临床结果已经显示重组人BMP-7在ー些临床适应症中是高度免疫原性的。换言 之,该重组蛋白可刺激患者的免疫应答,这引起患者产生抗BMP-7的抗体。这些抗体也可抑制由患者内源性产生BMP-7的功能，导致对患者健康潜在的长期后果。因此，本领域中需要BMP-7——包括重组BMP-7，其具有降低的免疫原性，以便提高其有效性并降低对患者的副作用，同时保持其生物活性和临床相关的骨形态发生性质。

发明内容
本申请涉及BMP-7，例如人重组BMP-7，其与野生型人BMP-7相比已经被修饰以降低其免疫原性。更具体地，根据本发明的BMP-7蛋白被修饰，以去除潜在的免疫原性表位。因此，与野生型BMP-7相比，本发明的BMP-7蛋白具有改进的生物学性质。根据ー个方面，本发明包括与成熟人BMP-7具有至少90%序列同一性的变体BMP-7蛋白。该变体BMP-7包含在与成熟人BMP-7相应的以下位置中的ー个或多个、两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个、七个或多个或八个或多个处的取代G61、A63、Y65、Y66、E68、E70、A72、H92、F93、194、N95、P96、E97、T98、V99、P100、P102 或A105。在进ー步的实施方式中，该变体蛋白与成熟人BMP-7具有至少95%的同一性。在进ー步的实施方式中，取代为以下的ー个或多个G61E、A63E/Q/H、Y65F/N、Y66E、E68D/K/H、E70G/D、A72S/F/P、H92N、F93N/L/S、I94M/K/S/V, N95V/F、P96S/N、E97S/T/D/K、T98K/I/S/Y/H、V99I、P100G、P102A或A105V。在进ー步的实施方式中，该变体显示了BMP-7活性。在另ー个方面中，本发明涉及编码本发明变体BMP-7蛋白的核酸。例如，该核酸为DNA 或 RNA。在另ー个方面中，本发明涉及包含编码本发明变体BMP-7蛋白的核酸的重组表达载体。还在另ー个方面中，本发明涉及包含表达载体的细胞，所述表达载体包含编码本发明变体BMP-7蛋白的核酸。该细胞在一个实施方式中可为原核的，或在另ー个实施方式中可为真核的。在进ー步的方面中，本发明涉及包括本发明变体BMP-7蛋白和药物载体的药物组合物。根据进一歩的方面，本发明涉及治疗患者骨骼病的方法。该方法要求向患者施用治疗有效量的本发明变体BMP-7蛋白。根据又进一歩的方面，本发明涉及降低人BMP-7蛋白的免疫原性的方法。该方法要求识别人BMP-7上的免疫原性表位和通过在BMP-7的氨基酸序列中改造一个或多个取代以产生修饰的氨基酸序列来修饰人BMP-7的氨基酸序列中的表位。所述ー个或多个取代在与成熟人BMP-7相应的以下位置中的一个或多个处发生G61、A63、Y65、Y66、E68、E70、A72、H92、F93、I94、N95、P96、E97、T98、V99、P100、P102 或 A105。在一个实施方式中，人 BMP-7是重组的。在进ー步的实施方式中，所述ー个或多个取代为以下中的任ー个或多个G61E、A63E/Q/H、Y65F/N、Y66E、E68D/K/H、E70G/D、A72S/F/P、H92N、F93N/L/S、I94M/K/S/V, N95V/F、P96S/N、E97S/T/D/K、T98K/I/S/Y/H、V99I、P100G、P102A 或 A105V。在进ー步的实施方式 中，该方法可包括在合适的表达系统中表达由修饰的氨基酸序列编码的蛋白质和纯化该蛋白质的步骤。在一个实施方式中，该蛋白质可在真核细胞中表达，或在另ー个实施方式中，该蛋白质可在原核细胞中表达。


图I显示了包括人BMP-7成熟区域的整个序列的十八种肽，每种肽十五个氨基酸长，并且重叠5或10个氨基酸。图2是十八种肽的示意图，其显示与人BMP-7整个成熟区域相关的这些肽之间的重叠。图3为条形图，其显示在图I示出的十八种肽的ELISA中结合至来自患者血清样本的非中和抗BMP-7抗体的結果。(条形从左到右为111266-、111694+、111945+、111665+和 1B12/12G3+)。图4为条形图，其显示在图I示出的十八种肽的ELISA中结合至来自患者血清样本的中和抗BMP-7抗体的結果。(条形从左到右为113791-、113113+、113331+、113756+、112956+、113757+、113766+、111694+ 和 1B12/12G3+)。图5A是与肽9 (如图I所示)相应的BMP-7部分与BMP_2、4、5、6和9中的相应区域的比对。图5B是与肽13(如图I所示)相应的BMP-7部分与BMP_2、4、5、6和9中的相应区域的比对。图6为成熟人BMP-7 (SEQ ID NO: I)的序列。发明详述已经显示重组人BMP-7在ー些临床适应症中是高度免疫原性的。例如，当BMP-7作为OP-It6Putty 或OP-l Implant (Stryker Biotech Hopkinton, MA)的一部分被植入患者时，引起ー些患者通过产生对重组人BMP-7的抗体显示免疫应答。这降低了 BMP-7治疗的有效性并可导致副作用。因此，本发明涉及变体BMP-7蛋白，其与野生型BMP-7相比具有降低的免疫原性。本发明也包括制造和使用具有降低的免疫原性的BMP-7变体的方法。根据本发明，通过修饰包含潜在免疫原性表位的BMP-7部分的氨基酸残基降低免疫原性。因此，根据本发明修饰的BMP-7蛋白保持了它们的生物学活性，但与它们的野生型BMP-7对应物相比大大减少了免疫原性。例如，根据本发明，BMP-7的免疫原性性质被消除或大大降低。因此，预期当被施用给患者例如人患者时，这样的变体BMP-7蛋白将具有更少的免疫原性。骨形态发生蛋白骨形态发生蛋白(BMP)属于TGF-P超家族。TGF-0超家族蛋白是以六个保守的半胱氨酸残基为特征的细胞因子。该人基因组包含大约42个编码TGF-P超家族蛋白的开放阅读框。TGF-P超家族蛋白可基于序列相似性和它们激活的特定信号传导通路至少被分成BMP亚家族和TGF-P亚家族。BMP亚家族包括但不限于BMP-2、BMP-3(骨生成蛋白)、BMP-3b (⑶ F-10)、BMP-4 (BMP_2b)、BMP-5、BMP-6、BMP-7 (成骨蛋白-1 或 0P-1)、BMP-8 (0P-2)、BMP-8B (0P-3)、BMP-9 (⑶F-2)、BMP-10, BMP-11 (GDF-Il)、BMP-12 (⑶F-7)、BMP-13 (⑶F-6、CDMP-2)、BMP-15 (⑶F-9)、BMP-16、⑶F-1、⑶F-3、⑶F_5 (CDMP-1、MP-52)和 ⑶F-8(肌骨素(myostatin))。此外，在人群的不同成员之间的BMP序列中具有等位基因变异，并且在至今发现和表征的BMP之间具有物种差异。如在此所用的，“BMP亚家族”、“BMP”、“BMP配体”和其语法上的等同物指BMP亚家族成员，除非另有具体说明。公开这些序列以及它们的化学和物理性质的出版物包括BMP_7和0P_2(美国专利号 5,011,691;美国专利号 5，266，683 ;0zkaynak 等，EMBOJ.，9，pp.2085-2093(1990) ;0P_3 (W094/10203 (PCT US93/10520))、BMP-2、BMP-4、(W088/00205 ；ffozney 等 Science,242,pp. 1528-1534(1988))、BMP-5 和 BMP-6(Celeste等，PNAS, 87，9843-9847(1990))、Vgr-I (Lyons 等，PNAS, 86，pp. 4554-4558 (1989))；DPP (Padgett 等 Nature, 325, pp. 81-84(1987)) ；Vg-l (Weeks, Cell, 51, pp. 861-867(1987)) ；BMP-9(W095/33830(PCT/US95/07084) ；BMP-10(W094/26893(PCT/US94/05290)；BMP-11 (W094/26892 (PCT/US94/05288) ；BMP-12 (W095/16035 (PCT/US94/14030)；BMP-13 (W095/16035 (PCT/US94/14030) ;GDF_1(W092/00382 (PCT/US91/04096)和Lee 等 PNAS,88，pp. 4250-4254 (1991) ；GDF-8(W094/21681 (PCT/US94/03019)；GDF-9 (W094/15966 (PCT/US94/00685) ;GDF_10 (W095/10539 (PCT/US94/11440)；GDF-Il (W096/01845 (PCT/US95/08543) ;BMP_15 (W096/36710 (PCT/US96/06540)；MP-121 (W096/01316 (PCT/EP95/02552) ；GDF-5 (CDMP-1, MP52) (W094/15949 (PCT/US94/00657)和 W096/14335(PCT/US94/12814)和 W093/16099 (PCT/EP93/00350))；⑶F-6(CDMP-2, BMPI3)(W095/01801(PCT/US94/07762)和 W096/14335 和 W095/10635(PCT/US94/14030)) ；GDF-7 (CDMP-3, BMP 12) (W095/10802 (PCT/US94/07799)和W095/10635 (PCT/US94/14030)) 以上出版物在此通过引用并入。如在此所用的，“TGF-P超家族成员”或“TGF-P超家族蛋白质”，指本领域技术人员称为转化生长因子-P (TGF-P)超家族成员的蛋白质。在结构上，这样的蛋白质为同ニ聚体或异ニ聚体，其表达为大的前体多肽链，所述大的前体多肽链包含疏水信号序列、数百个氨基酸的N-末端前区(pro region)和成熟结构域，所述成熟结构域包括可变N-末端区域和包含大约100个氨基酸的高度保守的C-末端区域，所述100个氨基酸含有具有保守的六个或七个半胱氨酸骨架的特征性半胱氨酸基序。这些结构上相关的蛋白质已经被鉴定为涉及多种发育事件。术语“形态发生蛋白”指属于具有真实形态发生活性的蛋白质的TGF-P超家族的蛋白质。例如，这种蛋白质能够诱导祖细胞増殖和/或启动分化途径中的级联事件，其根据局部环境信号导致形成软骨、骨、腱、韧带、神经或其他类型的分化组织。因此，根据本发明可用的形态发生蛋白在不同的周围环境中可表现不同。在某些实施方式中，本发明的形态发生蛋白可为同ニ聚体种类或异ニ聚体种类。术语“成骨蛋白(OP) ”指也能够诱导祖细胞形成软骨和/或骨的形态发生蛋白。该骨可为膜内骨或软骨内骨。大多数成骨蛋白是BMP亚家族的成员并因此也是BMP。然而，反过来说是不对的。根据本发明，由DNA序列同源性或氨基酸序列同一性识别的BMP也必须具有功能性生物測定中可论证的成骨活性或软骨形成活性，成为成骨蛋白。合适的生物測定在本领域中是公知的；特别有用的生物測定为异位骨形成測定(见例如美国专利号5，011，691 ;美国专利号 5，266，683)。在结构上，BMP为ニ聚半胱氨酸结蛋白。每个BMP单体包括多个分子内ニ硫链。 额外的分子间ニ硫链调节了大多数BMP中的ニ聚作用。BMP可形成同ニ聚体。ー些BMP可形成异ニ聚体。BMP被表达为包括长的前域、一个或多个切割位点和成熟结构域的前蛋白。该前域被认为帮助正确折叠和加工BMP。此外，在ー些但不是所有的BMP中，该前域可非共价结合成熟结构域并可起到抑制剂的作用(例如，Thies等，(2001)Growth Factors18:251-259)。BMP自然地表达为包括长的前域、一个或多个切割位点和成熟结构域的前蛋白。该前蛋白随后通过细胞机器加工以产生ニ聚的成熟BMP分子。该前域被认为帮助正确折叠和加工BMP。此外，在ー些但不是所有的BMP中，该前域可非共价结合成熟结构域并可起到蛋白伴侣以及抑制剂的作用(例如，Thies等，(2001)Growth Factors, 18:251-259)。当BMP ニ聚体结合两个I类型和两个II类型的丝氨酸/苏氨酸激酶受体时，BMP信号转导被启动。I类型受体包括但不限于ALK-1、ALK-2(也称为ActRla或ActRI)、ALK-3 (也称为BMPRIa)和ALK-6 (也称为BMPRIb)。II类型受体包括但不限于ActRIIa (也称为ActRII)、ActRIIb和BMPRII。人基因组包含受体丝氨酸/苏氨酸激酶家族的12个成员，包括7个I类型和5个II类型受体，其全部參与TGF-P信号传导(Manning等，2002，Science, 298:1912-1934)，其公开在此通过引用并入)。BMP结合后，II类型受体使类型I受体磷酸化，I类型受体使转录因子的Smad家族成员磷酸化，并且Smad家族成员易位至细胞核并激活许多基因的表达。BMP也与抑制剂、可溶受体和诱杀型受体相互作用，其包括但不限于BAMBI (BMP和激活蛋白膜结合抑制剂)、BMPER(BMP-结合内皮细胞前体源调节子)、Cerberus、cordin、类chordin、Dan、Dante、促滤泡素抑制素、促滤泡素抑制素相关蛋白(FSRP)、ectodin、gremlin、头蛋白、与Dan和cerberus相关的蛋白(PRDC)、硬化蛋白(sclerostin)、类硬化蛋白(sclerostin-like)和子宮致敏相关基因-1 (USAG-I)。此外，BMP可与共同受体相互作用，例如BMP-2和BMP-4结合共同受体DRAGON (Samad等(2005) J. Biol.Chem. ,280:14122-14129);和细胞外基质成分，诸如硫酸肝素和肝素(Irie等(2003)Biochem. Biophys. Res. Commun. 308:858-865)。如在此考虑的，术语“BMP”指属于在DNA同源性和氨基酸序列同一性的基础上定义的蛋白质的TGF-P超家族的BMP亚家族的蛋白质。根据本发明，当蛋白质具有与表征BMP亚家族的保守C-末端半胱氨酸-富含结构域内的已知BMP亚家族成员至少50%氨基酸序列同一性时，该蛋白质属于BMP亚家族。BMP亚家族的成员可总的来说具有小于50%的DNA或氨基酸序列同一性。如在此所用的，术语“BMP”进ー步指如此蛋白该蛋白是天然产生的骨形态发生蛋白以及由两个不同的単体BMP肽形成的异ニ聚体蛋白诸如BMP-2/7、BMP-4/7、BMP-2/6、BMP-2/5、BMP-4/7、BMP-4/5 和 BMP-4/6 异ニ聚体的氨基酸序列变体、结构域交换变体、平截和活性片段。合适的BMP变体和异ニ聚体包括在US 2006/0235204 ；WO07/087053 ;WO 05/097825 ;WO 00/020607 ；WO 00/020591 ；WO 00/020449 ;WO 05/113585 ；W095/016034 和 W093/009229 中提出的那些。根据ー个实施方式，根据本发明的方法产生的BMP变体诸如BMP-7变体与相应的野生型BMP蛋白序列保持至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性。
根据ー个实施方式，根据本发明方法产生的BMP变体诸如BMP-7变体与相应的野生型BMP蛋白序列的C-末端区域的保守半胱氨酸结构域保持至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性。对于“相应的野生型蛋白”，其指修饰的或变体BMP的野生型版本。例如，如果修饰的或变体BMP为修饰的或变体BMP-7，则相应的野生型BMP为野生型BMP-7。为了确定两个氨基酸序列或两个核酸的同一性百分比，出于最优化比较的目的，比对该序列(例如，缺ロ可被引入第一氨基酸序列或核酸序列，用干与第二氨基酸或核酸序列进行最优化比对)。两个序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置数量的函数(即，%同源性(homology) =相同位置的数量/位置的总数量X 100)。两个序列之间同源性百分比的測定可利用数学算法完成。用于比较两个序列的优选的、非限制性数学算法的实例为 Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68 的算法，如在Karlin and Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77 中改进的。这样的算法被并入 Altschul,等(1990) j. Mol. Biol. 215:403-10 的 NBLAST 和 XBLAST 程序。BLAST 核苷酸搜索可用NBLAST程序实施,得分(score) =100,字长(wordlength) =12。BLAST蛋白搜索可用XBLAST程序实施，得分=50，字长=3。为了获得用于比较目的的有缺ロ的(gapped)比对，Gapped BLAST可如Altschul 等，(1997)Nucleic Acids Research 25(17) :3389-3402中描述的进行使用。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST)的缺省參数。变体MIP-7本发明提供了降低BMP-7免疫原性的方法。为了降低或消除免疫原性，产生不同于野生型BMP-7的变体BMP-7蛋白。根据本发明的一个实施方式，因为BMP-7免疫原性表位中的一个或多个氨基酸被修饰，所以这些变体不同于野生型BMP-7。根据本发明的一个实施方式，BMP-7潜在的免疫原性表位如在本文中描述的和/或根据在本领域中已知的其他方法进行识别，并且表位被修饰以降低或消除表位的免疫原性作用。氨基酸修饰，诸如取代、缺失或插入，随后在表位(epitopic)区域中根据标准遗传工程操作进行，以降低或消除表位的免疫原性作用。根据本发明的一个实施方式，本发明的BMP-7变体保持了它们的生物活性，同时与野生型BMP-7相比，它们已经降低或大大降低或消除了免疫原性。根据本发明的一个实施方式，识别为包含表位的BMP-7的区域被来自另ー个BMP的相应区域的氨基酸序列置換，以便去除该表位。例如，在一个实施方式中，来自残基61-75的成熟人BMP-7的序列被来自以下的相应氨基酸序列置换BMP-2(GYHAFYCHGECPFPL(SEQID NO:20)-图 5A 的残基 319-333)、BMP-4(GYQAFYCHGDCPFPL(SEQ ID N0:21) —图 5A 的残基 33卜345)、BMP-5 (GYAAFYCDGECSFPL (SEQ ID NO: 22) —图 5A 的残基 376-390)、BMP-6(GYAANYCDGECSFPL (SEQ ID NO: 23) — 图 5A 的 残基 435-449)或 BMP-9(EYEAYECKGGCFFPL(SEQ ID NO:24)— 图 5A 的残基350-364)。在另ー个实施方式中，来自残基91-105的成熟人BMP-7的序列被来自以下的相应氨基酸序列置换BMP-2(VNSVNSKIPKACCV(SEQ IDNO: 25) — 图 5B 的残基 349-362)、BMP-4(VNSVNSSIPKACCV (SEQ ID NO: 26) —图 5B 的残基 361-374)、BMP-5(VHLMFPDHVPKPCCA (SEQ ID NO :27)-图 5B 的残基 406-420)、BMP-6 (VHLMNPEYVPKPCCA (SEQ ID NO: 28) — 图 5B 的残基 465-479)或BMP-9 (VHLKFPTKVGKACCV (SEQ ID NO: 29)—图 5B 的残基 380-394)。在本发明的另ー个实施方式中，识别为处于包含表位的BMP-7区域中的BMP-7的一个或多个氨基酸，通过例如用与另ー个BMP中的该残基相应的氨基酸取代进行修饰，以便去除表位。例如，如图5A和5B所示，显示了两个推定表位区域(肽9和13)与来自其他BMP蛋白的相应区域的比对，其建议对BMP-7可能的氨基酸修饰。在本发明的另ー个实施方式中，一个或多个点突变被引入人BMP-7，以去除表位。例如，在一个实施方式中，BMP-7 在残基 G61、A63、Y65、Y66、E68、E70、A72、H92、F93、194、N95、P96、E97、T98、V99、P100、P102或A105中的ー个或多个处具有取代。在另ー个实施方式中，BMP-7在残基 G61、A63、Y65、Y66、E68、E70、A72、H92、F93、194、N95、P96、E97、T98、V99、P100、P102或A105中的两个或多个处具有取代。在另ー个实施方式中，BMP-7在残基 G61、A63、Y65、Y66、E68、E70、A72、H92、F93、194、N95、P96、E97、T98、V99、P100、P102或A105中的三个或多个处具有取代。在另ー个实施方式中，BMP-7在残基 G61、A63、Y65、Y66、E68、E70、A72、H92、F93、194、N95、P96、E97、T98、V99、P100、P102或A105中的四个或多个处具有取代。在另ー个实施方式中，BMP-7在残基 G61、A63、Y65、Y66、E68、E70、A72、H92、F93、194、N95、P96、E97、T98、V99、P100、P102或A105中的五个或多个处具有取代。在另ー个实施方式中，BMP-7在残基 G61、A63、Y65、Y66、E68、E70、A72、H92、F93、194、N95、P96、E97、T98、V99、P100、P102或A105中的六个或多个处具有取代。在另ー个实施方式中，BMP-7在残基 G61、A63、Y65、Y66、E68、E70、A72、H92、F93、194、N95、P96、E97、T98、V99、P100、P102或A105中的七个或多个处具有取代。在另ー个实施方式中，BMP-7在残基 G61、A63、Y65、Y66、E68、E70、A72、H92、F93、194、N95、P96、E97、T98、V99、P100、P102或A105中的八个或多个处具有取代。在另ー个实施方式中，BMP-7 在残基 G61、A63、Y65、Y66、E68、E70、A72、H92、F93、194、N95、P96、E97、T98、V99、P100、P102或A105中的九个或多个处具有取代。在另ー个实施方式中，BMP-7在残基 G61、A63、Y65、Y66、E68、E70、A72、H92、F93、194、N95、P96、E97、T98、V99、P100、P102或A105中的十个或多个处具有取代。在进ー步的实施方式中，BMP-7具有以下取代中的ー个或多个G61E、A63E/Q/H、Y65F/N、Y66E、E68D/K/H、E70D/G、A72S/F/P、H92N、F93N/L/S、I94M/K/S/V, N95V/F、P96S/N、E97S/T/D/K、T98K/I/S/Y/H、V99I、P100G、P102A 或 A105V。在进ー步的实施方式中，BMP-7具有以下取代中的两个或多个G 61E、A63E/Q/H、Y65F/N、Y66E、E68D/K/H、E70D/G、A72S/F/P、H92N、F93N/L/S、I94M/K/S/V,N95V/F、P96S/N、E97S/T/D/K、T98K/I/S/Y/H、V99I、P100G、P102A 或 A105V。在进ー步的实施方式中，BMP-7具有以下取代中的三个或多个G61E、A63E/Q/H、Y65F/N、Y66E、E68D/K/H、E70D/G、A72S/F/P、H92N、F93N/L/S、I94M/K/S/V, N95V/F、P96S/N、E97S/T/D/K、T98K/I/S/Y/H、V99I、P100G、P102A 或 A105V。在进ー步的实施方式中，BMP-7具有以下取代中的四个或多个G61E、A63E/Q/H、Y65F/N、Y66E、E68D/K/H、E70D/G、A72S/F/P、H92N、F93N/L/S、I94M/K/S/V, N95V/F、P96S/N、E97S/T/D/K、T98K/I/S/Y/H、V99I、P100G、P102A 或 A105V。在进ー步的实施方式中，BMP-7具有以下取代中的五个或多个G61E、A63E/Q/H、Y65F/N、Y66E、E68D/K/H、E70D/G、A72S/F/P、H92N、F93N/L/S、I94M/K/S/V, N95V/F、P96S/N、E97S/T/D/K、T98K/I/S/Y/H、V99I、P100G、P102A 或 A105V。在进ー步的实施方式中，BMP-7具有以下取代中的六个或多个G61E、A63E/Q/H、Y65F/N、Y66E、E68D/K/H、E70D/G、A72S/F/P、H92N、F93N/L/S、I94M/K/S/V, N95V/F、P96S/N、E97S/T/D/K、T98K/I/S/Y/H、V99I、P100G、P102A 或 A105V。在进ー步的实施方式中，BMP-7具有以下取代中的七个或多个G61E、A63E/Q/H、Y65F/N、Y66E、E68D/K/H、E70D/G、A72S/F/P、H92N、F93N/L/S、I94M/K/S/V, N95V/F、P96S/N、E97S/T/D/K、T98K/I/S/Y/H、V99I、P100G、P102A 或 A105V。在进ー步的实施方式中，BMP-7具有以下取代中的八个或多个G61E、A63E/Q/H、Y65F/N、Y66E、E68D/K/H、E70D/G、A72S/F/P、H92N、F93N/L/S、I94M/K/S/V, N95V/F、P96S/N、E97S/T/D/K、T98K/I/S/Y/H、V99I、P100G、P102A 或 A105V。在进ー步的实施方式中，BMP-7具有以下取代中的九个或多个G61E、A63E/Q/H、Y65F/N、Y66E、E68D/K/H、E70D/G、A72S/F/P、H92N、F93N/L/S、I94M/K/S/V, N95V/F、P96S/N、E97S/T/D/K、T98K/I/S/Y/H、V99I、P100G、P102A 或 A105V。在进ー步的实施方式中，BMP-7具有以下取代中的十个或多个G61E、A63E/Q/H、Y65F/N、Y66E、E68D/K/H、E70D/G、A72S/F/P、H92N、F93N/L/S、I94M/K/S/V, N95V/F、P96S/N、E97S/T/D/K、T98K/I/S/Y/H、V99I、P100G、P102A 或 A105V。根据本发明的另ー个方面，根据本发明的BMP-7变体保持了 BMP-7的生物学活性。如在此所用的，术语“生物学活性”指任何体内或体外的BMP的可测量的功能。可測量BMP的生物学活性的ー些方法被列在以下的“实施例”部分中。在一个实施方式中，与野生型BMP-7相比，本发明的BMP-7变体具有至少30%、至少40%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%的生物学活性。例如，在一个实施方式中，与人野生型BMP-7或重组人野生型BMP-7相比，本发明的BMP-7变体具有前述的生物学活性％中的至少ー个。BMP-7夺体的治疗用涂根据本发明的BMP-7变体可被植入或施用给哺乳动物患者，例如人，以治疗各种病症。本发明的BMP-7变体可単独或与合适的载体或其他制剂结合，以固体、凝胶或糊状物形式植入患者，或以凝胶，糊状物或液体形式注入患者。本发明的BMP-7变体对于治疗各种病症是有用的。例如，本发明的BMP-7变体可用于治疗骨骼病，包括不管是由创伤还是炎性疾病引起的软骨退变(cartilage degeneration)。例如,本发明的BMP-7变体可治疗的疾病包括类风湿性关节炎(RA)和骨关节炎(OA)和自身免疫疾病诸如系统性红斑狼疮(SLE)和硬皮病。本发明的BMP-7变体可有效用于治疗骨骼疾病或损伤。例如，BMP-7变体可用于治疗骨折，诸如开放性骨折或闭合性骨折。对于治疗闭合性骨折，BMP-7变体优选在骨折位置上被注入。对于开放性骨折，临界尺寸缺陷或持续不结合，BMP-7变体可通过在骨折位置上手术植入而被施用。在两种情况下，BMP-7变体可被単独施用，或与合适的载体、基质(基 体，matrix)或支架，诸如骨粘骨粉、磷酸钙材料、凝胶材料或胶原蛋白基质结合施用。合适的载体、基质和支架包括在美国专利号6，919，308,6, 949，251和7，041, 641中公开的那些。在优选的实施方式中，本发明的BMP-7变体可用于治疗导致软骨退化(cartilagedegradation)或软骨缺陷的疾病或损伤。例如，本发明的BMP-7变体可被应用于软骨缺陷位置，诸如退变的椎间盘，或其他纤维软骨组织，包括腱、韧带或关节盘。这种方法在美国专利号6，958，149中说明。本发明的BMP-7变体可也用于治疗关节软骨的缺陷或退变，如在公布的PCT申请WO 05/115438中所提出的，诸如关节的软骨衬垫(cartilage lining ofa joint)，诸如滑膜关节，包括膝盖、肘部、臀部或肩膀。在该实施方式中，BMP-7变体优选被注入关节的滑液空间(synovial space)。在另ー个实施方式中，本发明的BMP-7变体用于治疗关节中的关节软骨缺陷位置，诸如软骨缺陷或骨软骨缺陷。这样的关节软骨缺陷可为疾病过程诸如骨关节炎或类风湿性关节炎的结果，或者由于关节损伤。在该实施方式中，BMP-7变体可被注入关节空间或其可通过外科手术植入。例如，BMP-7变体可被单独或与一种或多种附加的活性剂、支撑基质或支架或髓基质细胞结合放置在缺陷内。BMP-7变体——被放置在缺陷内的——可任选地被覆盖有合适的覆盖物，例如肌瓣或生物可再吸收膜，诸如胶原蛋白膜。如本领域技术人员将理解的，被施用给患者的BMP-7变体的浓度将根据多种因素而变化，包括但不限于被施用的药物剂量和给药途径。待被施用药物的优选剂量也类似地根据如此变量，其包括但不限于，疾病、组织损失或缺陷的类型和程度，具体患者的总体健康情况，所选择化合物的相对生物学效力，化合物的制剂，制剂中赋形剂的存在和类型，和给药途径。本申请的BMP-7变体可被提供给个人，其中典型的剂量范围为每天大约10ng/kg至大约lg/kg体重；优选的剂量范围为大约0. lmg/kg至100mg/kg体重,和更特别优选的剂量范围为IO-IOOOii g/剂。在特别优选的实施方式中，IO-IOOOii gBMP-7的剂被施用给遭受骨关节炎的个体。另外，如下所述，本申请的BMP-7变体可用于治疗非骨骼组织的疾病或损伤。如本申请进ー步考虑的，BMP能够对不同于骨或骨骼软骨的哺乳动物中的多种组织，诱导骨形态发生和组织形态发生的发育级联(developmental cascade)。该形态发生活动包括诱导祖细胞増殖和分化的能力，以及通过导致骨、软骨、非矿化骨骼或结缔组织和其他成年组织形成的事件发展支持和維持分化表型的能力。例如，本发明的BMP-7变体可用于在代谢性骨疾病中进行治疗以防止损失和/或増加骨质量。在代谢性骨疾病中利用成骨蛋白进行治疗以防止损失和/或増加骨质量的一般方法在美国专利号5，674，844中公开，其公开在此通过引用并入。本申请的BMP-7变体可用于牙周组织再生。利用成骨蛋白的牙周组织再生的一般方法在美国专利号5，733，878中公开，其公开在此通过引用并入。BMP-7变体可用于肝脏再生。利用成骨蛋白的肝脏再生的一般方法在美国专利号5，849，686中公开，其公开在此通过引用并入。BMP-7变体可用于治疗慢性肾衰竭。利用成骨蛋白治疗慢性肾衰竭的一般方法在美国专利号6，861，404中公开，其公开在此通过引用并入。本发明的BMP-7可用于提高中枢神经系统缺血或创伤之后的功能恢复。利用成骨蛋白提高中枢神经系统缺血或创伤之后的功能恢复的一般方法在美国专利号6，407, 060中公开，其公开在此通过引用并入。本发明的BMP-7变体可用于诱导树突生长(dendritic growth)。利用成骨蛋白诱导树突生长的一般方法在美国专利号6，949，505中公开，其公开在此通过引用并入。BMP-7变体可用于诱导神经细胞黏着。利用 成骨蛋白诱导神经细胞黏着的一般方法在美国专利号6，800, 603中公开，其公开在此通过引用并入。BMP-7变体可用于治疗和预防帕金森氏病。利用成骨蛋白治疗和预防帕金森氏病的一般方法在美国专利号6，506，729中公开，其公开在此通过引用并入。作为另ー个实例，BMP-7变体也可用于诱导牙本质发生。至今，牙髓组织对损伤的不可预测的应答是牙科医学中的基础临床难题。作为又另ー个实例，BMP-7变体可诱导对中枢神经系统(CNS)修复的再生作用，这可利用大鼠脑刺模型(rat brain stab model)进行评估。实施例I :经ELISA识别免疫原件表位为了识别BMP-7的潜在线性T-细胞表位，合成覆盖野生型人BMP-7成熟区域的整个序列的月太(Synthetic Biomolecules San Diego, CA)。十五个(15)氨基酸的十八种(18)肽中的每ー种都被构造。每种肽都与覆盖BMP-7邻接区域的肽具有5至10个氨基酸的重叠。18种肽中的每ー种的序列都在图I中示出，在不同肽之间的重叠在图2中示出。所述18种肽在ELISA测定中进行检测，以确定它们与抗BMP-7抗体的结合。18种肽中的每ー种都以g/mL的浓度单独包被在96孔高结合微量滴定板的単独一行上。使用三个平板，平板I具有肽1-6，平板2具有肽7-12，平板3具有肽13-18。以合成方法生成的阴性对照肽被包被在每个平板的第7行上，以用作阴性对照。BMP-7被包被在每个平板的第8行上，以用作阳性对照。包被的平板在室温下温育过夜。第二天，在BBS/T中清洗平板六次。平板随后用200 u I/孔的BBS/T牛奶封闭，并在37°C下温育2小吋。该平板被再次用BBS/T清洗六次。对BMP-7的中和抗体呈阳性的七个患者血清样本和对BMP-7的非中和抗体呈阳性的的三个患者血清样本在BBS/T牛奶中以1:80进行稀释，并被添加至所有3个平板的两个邻近列(以100 U I/孔,一式两份检测)。患者血清样本从用OP-I Putty (Stryker BiotechHopkinton, MA)治疗的患者获得。例如，来自患者I的血清被添加至所有平板的第1_2列，来自患者2的血清被添加至所有平板的第3-4列等等。对抗BMP-7抗体呈阴性的ー个患者血清样本被用作阴性对照。单克隆抗BMP-7抗体、1B12和12G3的组合被用作阳性对照。
患者血清样本被添加至肽包被的平板并在37°C下温育I小吋。该平板用BBS/T清洗六次。IOOu I的山羊抗人Ig HRP (Southern Biotech)以在BBS/T牛奶中1:40,000的稀释添加至每个孔。该平板随后在37°C下温育I小吋，并且随后在BBS/T牛奶中清洗六次。IOOu I的TMB底物(BioFX)被添加至每个孔，用于研究。IOOiU的0.18M H2SO4硫酸停止液被添加至每个平板。平板随后被放置在M5SpectraMax (Molecular Devices)中并在 450nm 下读取光密度。结合来自患者血清的非中和抗BMP-7抗体与18种肽的结果在图3中示出，结合来自患者血清的中和抗BMP-7抗体与18种肽在图4中示出。如图3所示，肽13显示了对来自3个阳性患者血清样本(111694、111945和111665)的非中和抗BMP-7抗体的高结合亲和性，但阴性患者血清(111266)，如所预期的，没有显示结合亲和性。这说明肽13包含这些非中和抗BMP-7抗体的线性结合表位。如图4所示，肽13再次显示了对来自数个阳性患者样本的中和抗BMP-7抗体的高结合亲和性，这提示肽13包含中和抗BMP-7抗体的线性结合表位。此外，图4中的数据不 但证实了抗BMP-7抗体与包含在肽13中的线性表位的结合，而且提示了中和抗体也可具有ー些对包含在肽I和9中的线性表位的结合亲和性。对于肽5来说，也观察到ー些结合。实施例2.通过改变表位改造具有降低的免疫原性的BMP-7蛋白肽9具有氨基酸序列GYAAYYCEGECAFPL (SEQ ID NO: 10)，而肽13具有氨基酸序列VHFINPETVPKPACCA (SEQ ID NO: 14)。然而，如在实施例I所示的，表位位于与肽9和肽13相应的BMP-7的区域中。因此，为了降低或消除这些序列的免疫原性，在BMP-7中在与肽9和肽13中的残基相应的残基处，进行氨基酸改变。为了确定造成肽9和13免疫原性的具体残基，产生数种肽类似物，其中两个连续的氨基酸被修饰，每ー个被修饰为丙氨酸残基。产生足够的肽，以便产生具有两个连续丙氨酸残基的肽9和13的所有排列。随后，測定该肽类似物以分析与肽9和13与抗BMP-7抗体结合的能力相比，它们结合抗BMP7抗体的能力。与抗BMP-7抗体的结合降低的肽类似物被识别，并且确定肽9的残基1、3、5、6、8、10或12中的ー个或多个(与成熟人BMP-7 (SEQ IDNO: I)的残基 61、63、65、66、68、70 和 72 相应)和 / 或肽 13 的残基 2、3、4、5、6、7、8、9、10、12 或 15 中的ー个或多个(与成熟人 BMP-7 (SEQ ID NO: I)的残基 92、93、94、95、96、97、98、99、100、102或105相应)是与抗BMP-7抗体结合的原因，并由此引起重组人BMP-7的免疫原性。因此，确定为引起BMP-7免疫原性的那些残基例如通过取代被修饰，以产生具有降低的免疫原性的BMP-7变体。根据本发明的改变，诸如本文中教导的氨基酸取代，根据标准重组遗传工程技术被引入BMP-7的遗传序列。变体BMP-7随后根据标准方案在原核或真核表达系统中进行表达。所表达的变体BMP-7随后根据标准方案被纯化。实施例3. BMP-7变体诱导碱件磷酸酶活件测定了本发明的BMP-7变体在大鼠骨肉瘤细胞系ROS 17/2. 8中诱导碱性磷酸酶(ALP)活性的能力。本发明的变体BMP-7在九个点的剂量响应中一式三份进行检测，野生型BMP-7用作阳性对照。具体地，ROS 17/2. 8细胞在96孔组织培养平板中铺板。BMP-7变体以以下剂量添加至细胞6000、2000、666、222、74、24、8、2和0. 9ng/ml，并被温育48小时的时间。细胞随后被裂解，并且基于从样本的平均光密度(OD)的非线性回归获得的EC50评估生长因子诱导ALP活性的能力。所有检测的BMP-7变体证明了稳固的碱性磷酸酶活性，这说明变体保持了它们的生物活性。实施例4.与野生型相比，BMP-7变体具有降低或消除的免疫原性根据本发明实施方式的BMP-7变体在灵长类中被检测，以确定它们的免疫原性。以真核产生的BMP-7变体被检测，野生型人BMP-7(以真核产生的)被施用作为对照。在典型的实验中，称猴(rhesus macaques)被皮下注射40 ii g/kg的蛋白样本,姆天一次,持续四周。以规定的间隔，从动物处获得血清，并且抗BMP-7的抗体的血清浓度利用人IL-7包被的96孔平板，通过ELISA进行测量。通常，每个血清样本的系列稀释被添加至每个孔，一式三份，持续两个小时，用PBS中的0. 05%吐温(Tween)(吐温20)清洗，并用PBS中1%BSA/1%山羊血清封闭。向每个样本，添加辣根过氧化物酶缀合的抗猕猴IgG(在样本缓冲液中为1:60, 000)，在37°C下温育2小时，并且平板用PBS中的0. 05%吐温清洗8次。样本随后利用比色基质溶液OPD (邻苯ニ胺ニ盐酸盐)，通过在490nm下测量0D，减去在650nm下的背 景读数进行測定。
发现以真核产生的野生型人BMP-7导致高抗BMP-7抗体的效价。相比之下，以真核产生的变体人BMP-7的抗体效价导致显著较低的抗BMP-7抗体的效价。实施例6.变体BMP-7以低浓度，在人患者体内，在诱导骨和软骨生长方面是有效尥。两位人患者，每个都要求治疗，以实现腰脊柱中的后外侧融合。在一位患者中，在牛骨胶原蛋白和羧甲基纤维素钠(类似于OP-1 Putty, Stryker Biotech, Hopkinton, MA)的基质中I. 5mg的变体BMP-7通过手术植入脊柱的每ー侧要求融合的位置上。该基质在植入前用无菌盐水(0.9%)溶液重建。在另一位患者中，在牛骨胶原蛋白和羧甲基纤维素钠(类似于OP-I⑩ Putty, Stryker Biotech, Hopkinton, MA)的基质中 3. 5mg 的野生型 BMP-7通过手术植入脊柱的每ー侧要求融合的位置上。在数个月的第一段时间后，每位患者的脊柱都用射线照相技术例如通过X射线观看，以确定在融合处出现骨生长。在接受变体BMP-7的患者中，在融合位置上检测到骨生长。然而，融合是不完全的。在接受野生型BMP-7的患者中，与在接受变体BMP-7的患者中相同水平的骨生长被检测到。同样，椎骨的融合是不完全的。在与数个月的第一段时间相同的数个月的第二段时间后，每位患者的脊柱都再次用射线照相技术例如通过X射线观看。在每位患者中，在植入位置处的椎骨融合是完全的。因此，变体BMP-7可以以低于相应野生型BMP的浓度施用，同时仍然促进相同骨生长速度。这可归因于对BMP-7变体减弱的免疫应答，由此允许施用与野生型BMP-7相比更低浓度的变体BMP-7，以实现相同水平的骨生长，这是因为对于免疫系统应答，没有BMP-7损失。在另ー个实施例中，两位患者，每位都要求治疗，以实现腰脊柱中的后外侧融合。在一位患者中，在牛骨胶原蛋白和羧甲基纤维素钠(类似于OP-r'Putty，StrykerBiotech, Hopkinton, MA)的基质中3. 5mg的变体BMP-7通过手术植入脊柱的姆一侧要求融合的位置上。该基质在注入前用无菌盐水(0.9%)溶液重建。在另一位患者中，在牛骨胶原蛋白和羧甲基纤维素钠(类似于OP-1 Putty, Stryker Biotech, Hopkinton, MA)的基质中
3.5mg的野生型BMP-7通过手术被注入脊柱的每ー侧要求融合的位置上。
在数个月的第一段时间后，每位患者的脊柱都用射线照相技术例如通过X射线观看，以确定在融合处出现骨生长。在接受变体BMP-7的患者中，在融合位置上检测到骨生长，并且椎骨融合是完全的。相比之下，在接受野生型BMP-7的患者中，在植入位置处检测到骨生长。然而，椎骨融合是不完全的。在与数个月的第一段时间相同的数个月的第二段时间后，接受野生型BMP-7的患者的脊柱再次用射线照相技术例如通过X射线观看。在植入位置处的椎骨融合是完全的。因此，变体BMP-7可以以与相应的野生型BMP相同的浓度施用，以实现加速的骨生长速度。这可归因于对BMP-7变体发动的(mount)减弱的免疫应答，由此允许与野生型相 比更多的变体BMP-7促进骨生长。
权利要求
1.BMP-7变体，其包括与成熟人BMP-7 (SEQ ID NO: I)至少90%的序列同一性，其中所述BMP-7变体包括在与成熟人BMP-7相应的以下位置中的一个或多个处的取代G61、A63、Y65、Y66、E68、E70、A72、H92、F93、194、N95、P96、E97、T98、V99、P100、P102 或 A105。
2.根据权利要求I所述的BMP-7变体，其中所述取代为以下中的ー个或多个G61E、A63E/Q/H、Y65F/N、Y66E、E68D/K/H、E70G/D、A72S/F/P、H92N、F93N/L/S、I94M/K/S/V, N95V/F、P96S/N、E97S/T/D/K、T98K/I/S/Y/H、V99I、P100G、P102A 或 A105V。
3.根据权利要求I所述的BMP-7变体，其中所述变体显示BMP-7活性。
4.根据权利要求I所述的BMP-7变体，其中所述变体包括与成熟人BMP-7至少95%的序列同一性。
5.编码根据权利要求I所述的BMP-7变体的核酸。
6.包括权利要求I所述的核酸的重组表达载体。
7.包括权利要求6所述的表达载体的细胞。
8.根据权利要求7所述的细胞，其中所述细胞为原核的。
9.根据权利要求7所述的细胞，其中所述细胞为真核的。
10.组合物，其包括根据权利要求I所述的BMP-7变体和药物载体。
11.治疗患者中骨骼病的方法，其包括对所述患者施用治疗有效量的根据权利要求I所述的BMP-7变体。
12.降低人BMP-7蛋白免疫原性的方法，其包括以下步骤 识别人BMP-7的氨基酸序列中的免疫原性表位；和 通过在所述BMP-7的氨基酸序列中改造ー个或多个取代修饰所述表位，其中所述ー个或多个取代在与成熟人81^-7相应的位置661、463、￥65、￥66、￡68、￡70、ム72、1192、？93、194、N95、P96、E97、T98、V99、P100、P102或A105中的任何一个或多个处发生，以产生修饰的氨基酸序列。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述ー个或多个取代为以下中的任何一个或多个G61E、A63E/Q/H、Y65F/N、Y66E、E68D/K/H、E70G/D、A72S/F/P、H92N、F93N/L/S、I94M/K/S/V, N95V/F、P96S/N、E97S/T/D/K、T98K/I/S/Y/H、V99I、P100G、P102A 或 A105V。
14.根据权利要求12所述的方法，进ー步包括在合适的表达系统中表达由修饰的氨基酸序列编码的蛋白质和纯化所述蛋白质的步骤。
15.根据权利要求12所述的方法，其中表达所述蛋白在真核细胞中发生。
16.根据权利要求12所述的方法，其中表达所述蛋白在原核细胞中发生。
全文摘要
本发明涉及具有降低的免疫原性的骨形态发生蛋白。具体地，本发明涉及通过改变野生型BMP-7的氨基酸序列已被修饰以降低免疫原性的人BMP-7。
文档编号C07K14/51GK102822197SQ201080064396
公开日2012年12月12日 申请日期2010年12月21日 优先权日2009年12月22日
发明者M·E·帕特森, M·H·阿拉维-伊斯玛仪 申请人:史赛克公司