抗Bv8抗体及其用途的制作方法

专利名称：抗Bv8抗体及其用途的制作方法
技术领域：
一般而言，本发明涉及分子生物学领域。更具体地，本发明关注抗BvS抗体及其用途。
背景技术：
现在完全确立了涉及自已有的内皮形成新血管的血管发生参与多种病症的发病机理。这些包括实体瘤和转移、动脉粥样硬化、晶状体后纤维组织增生、血管瘤、慢性炎症、眼内新血管综合征诸如增殖性视网膜病例如糖尿病性视网膜病、老年性黄斑变性(AMD)、新生血管性青光眼、移植角膜组织和其它组织的免疫排斥、类风湿性关节炎、和银屑病。Folkman et al. , J. Biol. Chem. , 267:10931-10934(1992);Klagsbrun et al. , Annu. Rev.Physiol.，53:217-239(1991);及 Garner A.，"Vascular diseases^, In:Pathobiology ofOcular Disease. A Dynamic Approach, Garner A. , Klintworth GK, eds. , 2nd Edition(Marcel Dekker, NY,1994), pp 1625-1710。在肿瘤生长的情况中，血管发生对于自增生至瘤形成的转换，及为肿瘤的生长和转移提供营养似乎是至关重要的。Folkman et al.，Nature, 339:58 (1989)。新血管形成(neovascularization)让肿瘤细胞获得了与正常细胞相比的生长优势和增殖自治。肿瘤通常开始于单个异常细胞， 由于与可利用毛细管床的距离，该细胞只能增殖至几立方毫米的尺寸，而且它能在较长的一段时间里保持“休眠”状态而不进一步生长和传播。有些肿瘤细胞然后转向血管发生表型以激活内皮细胞，所述内皮细胞增殖并成熟成新的毛细血管。这些新形成的血管不仅让原发性肿瘤继续生长，而且让转移性肿瘤细胞传播并再建群(recolonization)。因而，在肿瘤切片中的微血管密度与乳腺癌及数种其它肿瘤的患者存活之间观察到了相关性。Weidner et al. , N. Engl. J. Med, 324:1-6 (1991) ;Horak et al. , Lancet, 340:1120-1124(1992) ;Macchiarini et al.，Lancet, 340:145-146 (1992)。尚未完全了解控制血管发生转换的精确机制，但是认为肿瘤块的新血管形成源自众多血管发生刺激物与抑制物的净平衡(Folkman, 1995, Nat Med I (I) :27-31)。血管发育过程受到严密调节。迄今为止，多种分子，多为由周围细胞生成的分泌性因子，已显示出调节EC分化、增殖、迁移和接合成索样结构。例如，血管内皮生长因子(VEGF)已鉴定为涉及刺激血管发生和诱导血管通透性的关键因子。Ferrara etal.，Endocr. Rev.，18:4-25(1997)。甚至单个VEGF等位基因的遗失导致胚胎致死的发现指向此因子在血管系统的发育和分化中所发挥的不可代替的作用。此外，VEGF已显示为与肿瘤和眼内病症有关的新血管形成的关键介导物。Ferrara et al.，Endocr.Rev.,见上文。VEGF mRNA在多数所检查的人肿瘤中过表达。Berkman et al. , J. Clin.Invest.，91:153-159 (1993);Brown et a1. , Human Pathol.，26:86-91 (1995);Brownet al., Cancer Res.，53:4727-4735 (1993) ;Mattern et al., Brit. J. Cancer,73:931-934(1996);Dvorak et al.，Am. J. Pathol.，146:1029-1039(1995)。已经显示了 Bv8诱导肾上腺皮层毛细管内皮细胞的增殖、存活和迁移(LeCouter, J. et al. , Proc Natl Acad Sci USA 100,2685-2690(2003)) Bv8 和 EG-VEGF是两种高度相关的分泌蛋白，也称作prokineticin-Ι和-2,它们在结构上属于由五个二硫桥基序(称作共脂肪酶/辅脂肪酶折叠)限定的一个较大的肽类别(DeCouter，J.et al. , Nature 420,860-867(2002) ;LeCouter, J. et al.,Proc Natl Acad Sci USA100, 2685-2690(2003);Li,M.et al. , Mol Pharmacol 59，692-698 (2001))。Bv8 最初被鉴定为来自娃Bombina variegate皮肤的分泌蛋白(Mollay, C. et al. , Eur JPharmacol 374，189-196 (1999))。Bv8的克隆和表达记载于2003年3月13日公布的TO 03/020892。Bv8和EG-VEGF结合两种高度相关的G蛋白偶联受体(GPCR)，EG-VEGF/PKR-1(Rl)和 EG-VEGF/PKR-2(R2)(Masuda, Y et al. , Biochem Biophys ResCommun 293,496-402(2002);Lin, D. C. et al. , J Biol Chem 277,19276-19280(2002)) EG-VEGF和Bv8被表征为对特定内皮细胞类型选择性的丝裂原(LeCouter，J. etal. , Nature 412(6850):877-84(2001);LeCouter, J. et al. , Proc Natl Acad Sci USA100，2685-2690(2003))。已经将其它活性归于这个家族，包括伤害感受(Mo I lay，C. etal.,见上文)、胃肠道运动(Li，M.et al.,见上文)、昼夜节律运动节律的调节(Cheng, M.Y. , et al. , Nature 417，405-410 (2002))和嗅球神经发生(Matsumoto, S.，et al. , ProcNatl Acad Sci USA 103，4140-4145 (2006))。另外，Bv8在体外刺激粒细胞和单核细胞集落的生成(LeCouter, J. et al. , (2003),见上文;Dorsch, M. et al. , J. Leukoc Biol78 (2) ,426-34 (2005))。Bv8已经被表征为巨噬细胞的化学引诱物(LeCouter et al. , ProcNatl Acad Sci USA 101,16813-16919(2004))。鉴于血管发生在许多疾病和病症中的作用，希望有降低或抑制一种或多种引起这些过程的生物学效应的手段。通过述及完整收录本文中引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物。 发明概述本发明部分基于多种针对BvS的抗体。BvS作为一种重要且有利的治疗靶，而且本发明提供抗体，作为治疗剂和诊断剂，供靶向与BvS表达和/或活性有关的病理状况中使用。因而，本发明提供涉及BvS的方法、组合物、试剂盒和制品。在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中所述抗体包含可变域，该可变域包含至少一种、两种、三种、四种、五种或六种选自下组的高变区(HVR)序列⑴包含 KasqsX1X2YX3X4X5SYMN 的 HVR-L1，其中 X1 为 L 或 V ;X2 为 D 或 I ;X3 为 D、
F、G、S、W 或 Y ;X4 为 A、G、H 或 V ;且 X5 为 D、E 或 Y ;(ii)包含 AASX1X2EX3 的 HVR-L2，其中 X1 为 N 或 Y ;X2 为 L 或 R ;且 X3 为 S 或 T ;(iii)包含 QQINEDPFT 的 HVR-L3 ；(iv)包含 GYX1X2X3X4YDMH 的 HVR-Hl，其中 X1 为 S 或 T ;X2 为 F 或 L ;X3 为 F、M、P、T或 V ;X4 为 D、E、H、I 或 N ;(V)包含 YixiX2Yx3Gx4Tx5YNQKFKG 的 HVR-H2，其中 X1 为 H、S 或 T ;X2 为 C、S 或 T ；X3为 A、L、N、S 或T ;X4 为 A、E 或 S 表为1、L、S*TjP(vi)包含 Dx1NygeayamDy 的 hvr-h3，其中 X1 为 g 或 s。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体包含下述三种HVR序列⑴包含 KasqsX1X2YX3X4X5SYMN 的 HVR-L1，其中 X1 为 L 或 V ;X2 为 D 或 I ;X3 为 D、
F、G、S、W 或 Y ;X4 为 A、G、H 或 V ;且 X5 为 D、E 或 Y ;(ii)包含 AASX1X2EX3 的 HVR-L2，其中 X1 为 N 或 Y ;X2 为 L 或 R ;且 X3 为 S 或 T ;和(iii)包含 QQINEDPFT 的 HVR-L3 ;及人VL卡帕亚组IV共有框架序列SEQ ID NO :240。在某些实施方案中，该抗BvS抗体包含下述三种HVR序列⑴包含GYX1X2X3X4YDMH 的 HVR-Hl，其中 X1 为 S 或 T ;X2 为 F 或 L ;X3 为 F、M、P、T或 V ;X4 为 D、E、H、I 或 N ;(ii)包含 YixiX2Yx3Gx4Tx5YNQKFKG 的 HVR-H2，其中 X1 为 H、S 或 T ;X2 为 C、S 或 T ;X3 为 A、L、N、S 或T ;X4 为 A、E 或 S ;X5 为1、L、S*TjP(iii)包含 Dx1NygeayamDy 的 HVR-H3，其中 X1 为 G 或 s ;及人VH亚组I共有框架序列SEQ ID NO :241。在某些实施方案 中，提供了结合BvS的抗体或其片段，其中该抗体包含可变域，该可变域包含下述六种HVR序列⑴包含 KasqsX1X2YX3X4X5SYMN 的 HVR-L1，其中 X1 为 L 或 V ;X2 为 D 或 I ;X3 为 D、
F、G、S、W 或 Y ;X4 为 A、G、H 或 V ;且 X5 为 D、E 或 Y ;(ii)包含 AASX1X2EX3 的 HVR-L2，其中 X1 为 N 或 Y ;X2 为 L 或 R ;且 X3 为 S 或 T ;(iii)包含 QQINEDPFT 的 HVR-L3 ；(iv)包含 GYX1X2X3X4YDMH 的 HVR-Hl，其中 X1 为 S 或 T ;X2 为 F 或 L ;X3 为 F、M、P、T或 V ;X4 为 D、E、H、I 或 N ;(V)包含 YIX1X2YX3GX4T X5YNQKFKG 的 HVR-H2，其中 X1 为 H、S 或 T ;X2 为 C、S 或 T ;X3 为 A、L、N、S 或T ;X4 为 A、E 或 S ;X5 为1、L、S*TjP(vi)包含 Dx1NygeayamDy 的 HVR-H3，其中 X1 为 G 或 S。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体与鼠/嵌合抗Bv8抗体相比在VL位置28和29之一或二者处进一步包含突变。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体与鼠/嵌合抗Bv8抗体相比在VH位置52a处进一步包含突变。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体与鼠/嵌合抗Bv8抗体相比在VH位置54处进一步包含突变。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体与鼠/嵌合抗Bv8抗体相比在VH位置95和96之一或二者处进一步包含突变。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体与鼠/嵌合抗Bv8抗体相比(I)在VL位置28和29之一或二者处；和/或(2)在VH位置52a处；和/或⑶在VH位置54处；和/或⑷在VH位置95和96之一或二者处进一步包含突变。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体与鼠/嵌合抗Bv8抗体相比在VH位置96处进一步包含突变且在VH位置95处不含突变。在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段为，其中HVR-Ll包含选自SEQID NO :49、55、61、67、73、79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145 和 151 的氨基酸序列，HVR-L2 包含选自 SEQID NO :50、56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146 和 152 的氨基酸序列，HVR-L3 包含选自 SEQ ID NO :51、57、63、69、75、81、87、93、99、105、111、117、123、129、135、141、147 和 153 的氨基酸序列，HVR-Hl 包含选自 SEQID NO :52、58、64、70、76、82、88、94、100、106、112、118、124、130、136、142、148 和 154 的氨基酸序列，HVR-H2 包含选自 SEQ ID NO :53、59、65、71、77、83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、149 和 155 的氨基酸序列，且 HVR-H3 包含选自 SEQ ID NO :54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150 和 156 的氨基酸序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VL卡帕亚组IV共有框架序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VH亚组I共有框架序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VL卡帕亚组IV共有框架序列和人VH亚组I共有框架序列。在某些实施方案中，人VL卡帕亚组IV共有框架序列减去三个轻链HVR序列为SEQ IDN0:240。在某些实施方案中，VH亚组I共有框架序列减去三个重链HVR序列为SEQ ID NO:241。在某些实施方案中，提供了结合BvS的抗体或其片段，其中该抗体包含可变域，该可变域包含至少一种、两种、三种、四种、五种或六种选自下组的高变区(HVR)序列⑴包含 KasqsX1X2YX3X4X5SYMN 的 HVR-L1，其中 X1 为 L 或 V ;X2 为 D 或 I ;X3 为 F、
G、S、W 或 Y ;X4 为 A、G、H或 V ;且X5 为 D、E 或 Y ;(ii)包含 AASX1X2EX3 的 HVR-L2，其中 X1 为 N 或 Y ;X2 为 L 或 R ;且 X3 为 S 或 T ;(iii)包含 QQINEDPFT 的 HVR-L3 ；(iv)包含 GYX1X2X3X4YDMH 的 HVR-Hl，其中 X1 为 S 或 T ;X2 为 F 或 L ;X3 为 F、M、P、T或 V ;X4 为 D、E、H、I 或 N ;
(V)包含 YixiX2Yx3Gx4Tx5YNQKFKG 的 HVR-H2，其中 X1 为 H、S 或 T ;X2 为 S 或 T ;X3 为A、L、S 或T ;X4 为 A、E 或 S ;父5为1、L、S 或 T ;和(vi)包含 DSNYGEAYAMDY 的 HVR-H3。在某些实施方案中，该抗BvS抗体包含下述三种HVR序列⑴包含 KasqsX1X2YX3X4X5SYMN 的 HVR-L1，其中 X1 为 L 或 V ;X2 为 D 或 I ;X3 为 F、
G、S、W 或 Y ;X4 为 A、G、H或 V ;且X5 为 D、E 或 Y ;(ii)包含 AASX1X2EX3 的 HVR-L2，其中 X1 SN或 Y ;X2 SL或 R;且X3 为 S 或T;(iii)包含 QQINEDPFT 的 HVR-L3 ;及人VL卡帕亚组IV共有框架序列SEQ ID NO :240。 在某些实施方案中，该抗BvS抗体包含下述三种HVR序列⑴包含GYX1X2X3X4YDMH 的 HVR-Hl，其中 X1 为 S 或 T ;X2 为 F 或 L ;X3 为 F、M、P、T或 V ;X4 为 D、E、H、I 或 N ;(ii)包含 YixiX2Yx3Gx4Tx5YNQKFKG 的 HVR-H2，其中 X1 为 H、S 或 T ;X2 为 S 或 T ;X3为A、L、S或T ;X4为A、E或S ;父5为1、L、S或T ;和(iii)包含 DSNYGEAYAMDY 的 HVR-H3 ;及人VH亚组I共有框架序列SEQ ID NO :241。在某些实施方案中，提供了结合BvS的抗体或其片段，其中该抗体包含可变域，该可变域包含下述六种HVR序列⑴包含 KasqsX1X2YX3X4X5SYMN 的 HVR-L1，其中 X1 为 L 或 V ;X2 为 D 或 I ;X3 为 F、
G、S、W 或 Y ;X4 为 A、G、H或 V ;且X5 为 D、E 或 Y ;
(ii)包含 AASX1X2EX3 的 HVR-L2，其中 X1为N或Y;X2为L或R;且X3为S或T;(iii)包含 QQINEDPFT 的 HVR-L3 ；(iv)包含 GYX1X2X3X4YDMH 的 HVR-Hl，其中 X1 为 S 或 T ;X2 为 F 或 L ;X3 为 F、M、P、T或 V ;X4 为 D、E、H、I 或 N ;(V)包含 YIX1X2YX3GX4T X5YNQKFKG 的 HVR-H2，其中 X1 为 H、S 或 T ;X2 为 S 或 T ;X3为A、L、S或T ;X4为A、E或S ;父5为1、L、S或T ;和(vi)包含 DSNYGEAYAMDY 的 HVR-H3。在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中HVR-Ll包含选自SEQID NO :55、61、67、73、79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145 和 151 的氨基酸序列，HVR-L2 包含选自 SEQ ID NO :56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146 和 152 的氨基酸序列，HVR-L3 包含选自 SEQ ID NO :57、63、69、75、81、87、93、99、105、111、117、123、129、135、141、147 和 153 的氨基酸序列，HVR-Hl 包含选自 SEQ ID NO 58、64、70、76、82、88、94、100、106、112、118、124、130、136、142、148 和 154 的氨基酸序列，HVR-H2包含选自 SEQ ID NO :59、65、71、77、83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、149 和 155 的氨基酸序列，且 HVR-H3 包含选自 SEQ ID NO :60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150 和 156 的氨基酸序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VL卡帕亚组IV共有框架序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VH亚组I共有框架序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VL卡帕亚组IV共有框架序列和人VH亚组I共有框架序列。在某些实施方案中，人VL卡帕亚组IV共有框架序列减去三个轻链HVR序列为SEQ IDN0:240。在某些实施方案中，VH亚组I共有框架序列减去三个重链HVR序列为SEQ ID NO:241。 在另一个实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含(I)包含氨基酸序列 SEQ ID NO 61 的 HVR-Hl ；(2)包含氨基酸序列 SEQ ID NO 62 的 HVR-H2 ；(3)包含氨基酸序列 SEQ ID NO 63 的 HVR-H3 ；(4)包含氨基酸序列 SEQ ID NO 64 的 HVR-Ll ；(5)包含氨基酸序列SEQ ID NO 65的HVR-L2 ;和(6)包含氨基酸序列 SEQ ID NO 66 的 HVR-L3。在另一个实施方案中，提供了结合BvS的抗体或其片段，其中该抗体包含(I)包含氨基酸序列 SEQ ID NO 85 的 HVR-Hl ；(2)包含氨基酸序列 SEQ ID NO 86 的 HVR-H2 ；(3)包含氨基酸序列 SEQ ID NO 87 的 HVR-H3 ；(4)包含氨基酸序列 SEQ ID NO 88 的 HVR-Ll ；(5)包含氨基酸序列SEQ ID NO 89的HVR-L2 ;和(6)包含氨基酸序列 SEQ ID NO 90 的 HVR-L3。在另一个实施方案中，提供了结合BvS的抗体或其片段，其中该抗体包含(I)包含氨基酸序列 SEQ ID NO 91 的 HVR-Hl ；(2)包含氨基酸序列 SEQ ID NO 92 的 HVR-H2 ；
(3)包含氨基酸序列 SEQ ID NO 93 的 HVR-H3 ；(4)包含氨基酸序列 SEQ ID NO 94 的 HVR-Ll ；(5)包含氨基酸序列SEQ ID NO 95的HVR-L2 ;和(6)包含氨基酸序列 SEQ ID NO 96 的 HVR-L3。在另一个实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含(I)包含氨基酸序列 SEQ ID NO :121 的 HVR-Hl ；(2)包含氨基酸序列 SEQ ID NO :122 的 HVR-H2 ；(3)包含氨基酸序列 SEQ ID NO :123 的 HVR-H3 ；(4)包含氨基酸序列 SEQ ID NO :124 的 HVR-Ll ；(5)包含氨基酸序列SEQ ID NO :125的HVR-L2 ;和(6)包含氨基酸序列 SEQ ID NO :126 的 HVR-L3。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VL卡帕亚组IV共有框架序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VH亚组I共有框架序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VL卡帕亚组IV共有框架序列和人VH亚组I共有框架序列。在某些实施方案中，人VL卡帕亚组IV共有框架序列减去三个轻链HVR序列为SEQ IDN0:240。在某些实施方案中，VH亚组I共有框架序列减去三个重链HVR序列为SEQ ID NO:241。

在一个实施方案中，提供了结合BvS的抗体或其片段，其中该抗体包含轻链可变域和重链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO :7，该重链可变域包含SEQ ID NO :8。在另一个实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含轻链可变域和重链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO :9，该重链可变域包含SEQ ID NO :10。在另一个实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含轻链可变域和重链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO : 11，该重链可变域包含SEQ ID NO :12。在另一个实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含轻链可变域和重链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO : 13，该重链可变域包含SEQ ID NO :14。在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含与选自SEQID NO :3、5、7、9、11、13和15的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的轻链可变域。在某些实施方案中，提供了结合BvS的抗体或其片段，其中该抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含选自SEQ ID NO :3、5、7、9、11、13和15的氨基酸序列。在一个实施方案中，提供了结合BvS的抗体或其片段，其中该抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含氨基酸序列SEQ ID N0:7。在另一个实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含氨基酸序列SEQ ID N0:9。在另一个实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含氨基酸序列SEQ ID NO =Il0在另一个实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含氨基酸序列SEQ ID NO 130在某些实施方案中，提供了结合BvS的抗体或其片段，其中该抗体包含与选自SEQID NO :4、6、8、10、12、14和16的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的重链可变域。
在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含重链可变域，该重链可变域包含选自SEQ ID NO :4、6、8、10、12、14和16的氨基酸序列。在一个实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含重链可变域，该重链可变域包含氨基酸序列SEQ ID N0:8。在另一个实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含重链可变域，该重链可变域包含氨基酸序列SEQ ID NO 10o在另一个实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含重链可变域，该重链可变域包含氨基酸序列SEQ ID NO 120在另一个实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含重链可变域，该重链可变域包含氨基酸序列SEQ ID NO 140在某些实施方案中，提供了结合BvS的抗体或其片段，其中该抗体包含与选自SEQID NO :3、5、7、9、11、13和15的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的轻链可变域和与选自SEQ ID NO :4、6、8、10、12、14和16的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的重链可变域。在某些实施方案中，提供了结合BvS的抗体或其片段，其中该抗体包含轻链可变域和重链可变域，该轻链可变域包含选自SEQ ID NO :3、5、7、9、11、13和15的氨基酸序列，该重链可变域包含选自SEQ ID NO :4、6、8、10、12、14和16的氨基酸序列。在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗Bv8抗体以小于O. 02nM的Kd值结合人Bv8。在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗Bv8抗体以约O. OlnM或更小的Kd值结合人Bv8。

在某些实施方案中，提供了结合BvS的抗体或其片段，其中该抗BvS抗体结合人Bv8的紧密程度比嵌合2G9抗Bv8抗体高至少两倍。在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗Bv8抗体结合人Bv8的紧密程度比嵌合2G9抗Bv8抗体高至少五倍。在某些实施方案中，Kd值是使用表面等离振子共振测定法测量的。在某些实施方案中，Kd值是使用全长抗Bv8抗体测量的。在某些实施方案中，Kd值是使用Fab形式的抗BvS抗体测量的。在某些实施方案中，提供了结合BvS的抗体或其片段，其中该抗体包含至少一种、两种、三种、四种、五种或六种选自下组的高变区(HVR)序列⑴包含SASSXJFYMH 的 HVR-Ll，其中 X1 为 P 或 S ;(ii)包含 DTSX1LAS 的 HVR-L2，其中 X1 为 K或N;(iii)包含 QQffSX1X2PX3T 的 HVR-L3，其中 X1 为 F、S、W 或 Y ;X2 为 D 或 E ;X3 为1、L或M ;(iv)包含 GfxiX2STX3GMGVS 的 HVR-Hl，其中 X1 为 L 或 Y ;X2 为 I 或 L ;X3 为 P 或 S ;(V)包含 HIYWDDDTRYNPSLKS 的 HVR-H2 ;和(vi)包含 RdhGYYWFX1Y 的 HVR-H3，其中 X1 为 D 或 T。在某些实施方案中，提供了结合BvS的抗体或其片段，其中该抗体包含可变域，该可变域包含下述六种HVR序列⑴包含SASSXJFYMH 的 HVR-Ll，其中 X1 为 P 或 S ;
(ii)包含 DTSX1LAS 的 HVR-L2，其中 X1 为 K 或 N ;(iii)包含 QQffSX1X2PX3T 的 HVR-L3，其中 X1 为 F、S、W 或 Y ;X2 为 D 或 E ;X3 为1、L或M ;(iv)包含 GfxiX2STX3GMGVS 的 HVR-Hl，其中 X1 为 L 或 Y ;X2 为 I 或 L ;X3 为 P 或 S ;(V)包含 HIYWDDDTRYNPSLKS 的 HVR-H2 ;和(vi)包含 RdhGYYWFX1Y 的 HVR-H3，其中 X1 为 D 或 T。在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中HVR-Ll包含选自SEQID NO : 157、163、169、175、181、187 和 193 的氨基酸序列，HVR-L2 包含选自 SEQ ID NO: 158、164、170、176、182、188 和 194 的氨基酸序列，HVR-L3 包含选自 SEQ ID NO :159、165、171、177、183、189 和 195 的氨基酸序列，HVR-Hl 包含选自 SEQ ID NO :160、166、172、178、184、190 和 196 的氨基酸序列，HVR-H2 包含选自 SEQ ID NO : 161、167、173、179、185、191 和 197的氨基酸序列，且HVR-H3包含选自SEQ ID NO : 162、168、174、180、186、192和198的氨基酸序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VL卡帕亚组I共有框架序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VH亚组III共有框架序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VL卡帕亚组I共有框架序列和人VH亚组III共有框架序列。在某些实施方案中，提供了结合 BvS的抗体或其片段，其中该抗体包含至少一种、两种、三种、四种、五种或六种选自下组的高变区(HVR)序列⑴包含SASSXJFYMH 的 HVR-Ll，其中 X1 为 P 或 S ;(ii)包含 DTSX1LAS 的 HVR-L2，其中 X1 为 K 或 N ;(iii)包含 QQffSX1X2PX3T 的 HVR-L3，其中 X1 为 F、S、W 或 Y ;X2 为 D 或 E ;X3 为1、L或M ;(iv)包含 GfxiX2STX3GMGVS 的 HVR-Hl，其中 X1 为 L 或 Y ;X2 为 I 或 L ;X3 为 P 或 S ;(V)包含 HIYWDDDTRYNPSLKS 的 HVR-H2 ;和(vi)包含 RDHGYYWFDY 的 HVR-H3。在某些实施方案中，提供了结合BvS的抗体或其片段，其中该抗体包含下述六种HVR序列⑴包含SASSXJFYMH 的 HVR-Ll，其中 X1 为 P 或 S ;(ii)包含 DTSX1LAS 的 HVR-L2，其中 X1 为 K 或 N ;(iii)包含 QQffSX1X2PX3T 的 HVR-L3，其中 X1 为 F、S、W 或 Y ;X2 为 D 或 E ;X3 为1、L或M ;(iv)包含 GfxiX2STX3GMGVS 的 HVR-Hl，其中 X1 为 L 或 Y ;X2 为 I 或 L ;X3 为 P 或 S ;(V)包含 HIYWDDDTRYNPSLKS 的 HVR-H2 ;和(vi)包含 RDHGYYWFDY 的 HVR-H3。在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2 和 HVR-H3，该 HVR-Ll 包含选自 SEQ ID NO : 157、163、169、175、181、187 和 193 的氨基酸序列，该 HVR-L2 包含选自 SEQ ID NO : 158、164、170、176、182、188 和 194 的氨基酸序列，该 HVR-L3 包含选自 SEQ ID NO : 159、165、171、177、183、189 和 195的氨基酸序列，该HVR-Hl包含选自SEQ ID NO : 160、166、172、178、184、190和196的氨基酸序列，该HVR-H2包含选自SEQ ID NO :161、167、173、179、185、191和197的氨基酸序列，该HVR-H3包含选自EQ ID NO : 174、180、186、192和198的氨基酸序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VL卡帕亚组I共有框架序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VH亚组III共有框架序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VL卡帕亚组I共有框架序列和人VH亚组III共有框架序列。在另一个实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含轻链可变域和重链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO :23，该重链可变域包含SEQ ID NO :24。在某些实施方案中，提供了结合BvS的抗体或其片段，其中该抗体包含至少一种、两种、三种、四种、五种或六种选自下组的高变区(HVR)序列(i)包含 EASQSVDYDDDSYMN 的 HVR-Ll ；(ii)包含 ATSNLAS 的 HVR-L2 ；(iii)包含 QQSNEDPFT 的 HVR-L3 ；(iv)包含 GYTFTNSWMN 的 HVR-Hl ；(V)包含 RIDPSDSETHYNQKFKD 的 HVR-H2 ;和(vi)包含 DSSYDGFYAMDY 的 HVR-H3。在某些实施方案中，提供了结合BvS的抗体或其片段，其中该抗体包含下述六种HVR序列(i)包含 EASQSVDYDDDSYMN 的 HVR-Ll ；(ii)包含 ATSNLAS 的 HVR-L2 ；(iii)包含 QQSNEDPFT 的 HVR-L3 ；(iv)包含 GYTFTNSWMN 的 HVR-Hl ；(V)包含 RIDPSDSETHYNQKFKD 的 HVR-H2 ;和(vi)包含 DSSYDGFYAMDY 的 HVR-H3。在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含HVR-Ll、HVR-L2、HVR-L3、HVR-Hl、HVR-H2 和 HVR-H3,该 HVR-Ll 包含选自 SEQ ID NO :199 和 205 的氨基酸序列，该HVR-L2包含选自SEQ IDNO :200和206的氨基酸序列，该HVR-L3包含选自SEQ ID NO :201和207的氨基酸序列，该HVR-Hl包含选自SEQ ID NO :202和208的氨基酸序列，该HVR-H2包含选自SEQ ID NO :203和209的氨基酸序列，该HVR-H3包含选自SEQ IDNO :204和210的氨基酸序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VL卡帕亚组I共有框架序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VH亚组III共有框架序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VL卡帕亚组I共有框架序列和人VH亚组III共有框架序列。在某些实施方案中，提供了结合BvS的抗体或其片段，其中该抗体包含至少一种、两种、三种、四种、五种或六种选自下组的高变区(HVR)序列(i)包含 KSSEYVSNALS 的 HVR-Ll ； (ii)包含 GTNKLED 的 HVR-L2 ；
(iii)包含 QQGYDIPT 的 HVR-L3 ；(iv)包含 GFTFSDYFMG 的 HVR-Hl ；(V)包含 GIDTKSYNYATYYSGSVKG 的 HVR-H2 ;和(vi)包含 NYGNYGAFDS 的 HVR-H3。在某些实施方案中，提供了结合BvS的抗体或其片段，其中该抗体包含下述六种HVR序列(i)包含 KSSEYVSNALS 的 HVR-Ll ；(ii)包含 GTNKLED 的 HVR-L2 ；(iii)包含 QQGYDIPT 的 HVR-L3 ；(iv)包含 GFTFSDYFMG 的 HVR-Hl ；(V)包含 GIDTKSYNYATYYSGSVKG 的 HVR-H2 ;和(vi)包含 NYGNYGAFDS 的 HVR-H3。在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含HVR-Ll、HVR-L2、HVR-L3、HVR-Hl、HVR-H2 和 HVR-H3，该 HVR-Ll 包含氨基酸序列 SEQ ID NO :211，该HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO :212，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO :213，该HVR-Hl包含氨基酸序列SEQ ID NO :214，该HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO :215，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO :216。

在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VL卡帕亚组I共有框架序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VH亚组III共有框架序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VL卡帕亚组I共有框架序列和人VH亚组III共有框架序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体为单克隆抗体。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体为人源化的。在某些实施方案中，该抗BvS抗体为人的。在某些实施方案中，该抗BvS抗体的至少部分框架序列为人共有框架序列。在一个实施方案中，该抗体为选自Fab、Fab’_SH、Fv、scFv或(Fab’ )2片段的抗体片段。在某些实施方案中，提供了编码本文所述任何抗体的多核苷酸或核酸。在一个实施方案中，提供了包含该多核苷酸或核酸的载体。在一个实施方案中，该载体为表达载体。在一个实施方案中，提供了包含该载体的宿主细胞。在一个实施方案中，该宿主细胞为真核的。在一个实施方案中，该宿主细胞为原核的。在一个实施方案中，该宿主细胞为CHO细胞。在一个实施方案中，提供了制备抗Bv8抗体的方法，其中该方法包括在适合于编码抗体的多核苷酸表达的条件下培养该宿主细胞，并分离抗体。在某些实施方案中，本发明还涉及包含上述任何抗Bv8抗体的组合物。在某些实施方案中，本发明涉及包含与药学可接受载体混合的上述任何抗Bv8抗体的药物组合物。在某些实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，其用于预防或治疗肿瘤转移，包含与药学可接受载体混合的有效量的本文所述任何抗Bv8抗体。在某些实施方案中，提供了检测生物学样品中Bv8的存在的方法，该方法包括在允许抗体结合Bv8的条件下使生物学样品与本发明的抗Bv8抗体接触，并检测抗体和Bv8之间是否形成复合物。在某些实施方案中，提供了用于治疗肿瘤、癌症、或细胞增殖性病症的方法，包括对受试者施用有效量的本文所述任何抗BvS抗体。在某些实施方案中，该癌症选自下组乳腺癌，结肠直肠癌，肺癌，肾癌，成胶质细胞瘤，食管癌，黑素瘤，膀胱癌，卵巢癌，胰腺癌，和肝细胞癌。在某些实施方案中，该癌症为乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、肾癌、卵巢癌或成胶质细胞瘤。在本文中“定义”下提供了所涵盖的癌症的一个例示性和非限制性列表。在某些实施方案中，提供了用于在具有与血管发生有关的病理状况的受试者中降低或抑制血管发生的方法，包括对受试者施用有效量的本文所述任何抗BvS抗体。在某些实施方案中，该病理状况为新生物状况(neoplastic condition)。在某些实施方案中，该病理状况为非新生物状况。在本文中“定义”下提供了所涵盖的非新生物状况的一个例示性和非限制性列表。在某些实施方案中，该非新生物状况选自下组糖尿病性和其它增殖性视网膜病，早产儿视网膜病，新生血管性青光眼，老年性黄斑变性，糖尿病性黄斑水肿，角膜新血管形成，角膜移植片新血管形成，视网膜/脉络膜新血管形成和类风湿性关节炎。在某些实施方案中，提供了用于抑制内皮细胞增殖的方法，包括对受试者施用有效量的本文所述任何抗Bv8抗体。在某些实施方案中，该内皮细胞为肾上腺皮层内皮细胞。在某些实施方案中，提供了用于抑制嗜中性粒细胞迁移的方法，包括对受试者施用有效量的本文所述任何抗Bv8抗体。在某些实施方案中，提供了用于抑制肿瘤转移的方法，包括对受试者施用有效量的本文所述任何抗BvS抗体。在某些实施方案中，该转移在淋巴系统中。在某些实施方案中，该转移在远端器官中。在某些实施方案中，提供了用于治疗、预防或减轻疼痛的方法，包括对受试者施用有效量的本文所述任何抗Bv8抗体。在某些实施方案中，该疼痛为急性或慢性疼痛。在某些实施方案中，该疼痛为急性或慢性炎性疼痛。在某些实施方案中，提供了用于治疗类风湿性关节炎的方法，包括对受试者施用有效量的本文所述任何抗Bv8抗体。在某些实施方案中 ，本文和上文所述方法和进一步包括对受试者施用有效量的第二药物，其中该抗BvS抗体为第一药物。在某些实施方案中，该第二药物为另一种抗体、化疗剂、细胞毒剂、抗血管发生剂、免疫抑制剂、前药、细胞因子、细胞因子拮抗剂、细胞毒性放疗、皮质类固醇、止吐剂、癌症疫苗、止痛剂、或生长抑制剂。在某些实施方案中，该第二药物为抗血管发生剂。在某些实施方案中，该第二药物或抗血管发生剂为抗VEGF抗体。在某些实施方案中，该抗VEGF抗体为贝伐单抗(bevacizumab)。在某些实施方案中，该第二药物在施用抗BvS抗体之前或之后施用。在某些实施方案中，该第二药物与抗BvS抗体同时施用。在某些实施方案中，该方法进一步包括对受试者施用有效量的第三药物，其中该第三药物为化疗剂。在本文中“定义”下提供了所涵盖的化疗剂的一个例示性和非限制性列表。在某些实施方案中，该化疗剂选自下组帕利他赛(paclitaxel),卡钼(carboplatin),顺钼(cisplatin),吉西他滨(gemcitabine)和培美曲赛(pemetrexed)。在某些实施方案中，提供了用于在具有与血管发生有关的病理状况的受试者中增强抗血管发生剂的功效的方法，该方法包括对受试者施用与抗血管发生剂组合的有效量的本文所述任何抗BvS抗体，由此增强所述抗血管发生剂的抑制活性。在某些实施方案中，该与血管发生有关的病理状况为肿瘤、癌症或细胞增殖性病症。在某些实施方案中，该与血管发生有关的病理状况为非新生物状况。在某些实施方案中，该非新生物状况选自下组糖尿病性和其它增殖性视网膜病，早产儿视网膜病，新生血管性青光眼，老年性黄斑变性，糖尿病性黄斑水肿，角膜新血管形成，角膜移植片新血管形成，视网膜/脉络膜新血管形成和类风湿性关节炎。在某些实施方案中，该非新生物状况为类风湿性关节炎。在某些实施方案中，该受试者为人患者。在某些实施方案中，该受试者为人癌症患者。在某些实施方案中，该受试者为可已经诊断有转移或可处于发生转移的风险的人癌症患者。在某些实施方案中，该受试者为自VEGF拮抗剂复发的或对VEGF拮抗剂不应的。在某些实施方案中，该VEGF拮抗剂为抗VEGF抗体。在某些实施方案中，该抗VEGF抗体为贝伐单抗。在某些实施方案中，该抗血管发生剂在施用抗Bv8抗体之前或之后施用。在某些实施方案中，该抗血管发生剂与抗Bv8抗体同时施用。在某些实施方案中，该抗血管发生剂为抗VEGF剂。在某些实施方案中，该抗VEGF剂为抗VEGF抗体。在某些实施方案中，该抗VEGF抗体为贝伐单抗。本文所述任何实施方案或其任何组合适用于本文所述发明任何和所有抗BvS抗体和方法。附图简述

图1A-F -M Bv8抗体的轻链和重链HVR环序列。所述图显示了轻链HVR序列L1、L2、和L3及重链HVR序列H1、H2和H3。每种抗体的序列编号方式如下嵌合2G9 (HVR-Hl为 SEQ ID NO 49 ；HVR-H2 为 SEQ ID NO 50 ；HVR-H3 为 SEQ ID NO 51 ；HVR-Ll 为 SEQ IDNO 52 ；HVR-L2 为 SEQ IDNO 53 ；HVR-L3 为 SEQ ID NO 54)；h2G9. K4G1. Polish (HVR-LI 为SEQ IDNO :55 ；HVR-L2 为 SEQ ID NO :56 ；HVR-L3 为 SEQ ID NO :57 ；HVR-Hl 为 SEQ ID NO 58 ;HVR-H2 为 SEQ ID NO :59 ;HVR_H3 为 SEQ ID NO 60) ；h2G9. K4G1. vl9 (HVR-LI 为 SEQID NO 61 ；HVR-L2 为 SEQ ID NO :62 ；HVR-L3 为 SEQ ID NO :63 ；HVR-Hl 为 SEQ ID NO :64 ；HVR-H2 为 SEQ IDNO :65 ；HVR-H3 为 SEQ ID NO 66)；h2G9. K4G1. v25 (HVR-LI 为 SEQ IDNO 67 ；HVR-L2 为 SEQ ID NO :68 ；HVR-L3 为 SEQ ID NO :69 ；HVR-Hl 为 SEQ ID NO :70 ；HVR-H2为 SEQ ID NO 71 ；HVR-H3 为 SEQ ID NO :72) ；h2G9. K4G1. v27 (HVR-LI 为 SEQ ID NO :73 ；HVR-L2 为 SEQ ID NO :74 ；HVR-L3 为 SEQ ID NO :75 ；HVR-Hl 为 SEQ ID NO :76 ；HVR-H2 为SEQ IDNO 77 ；HVR-H3 为 SEQ ID NO 78)；h2G9. K4G1. v37 (HVR-LI 为 SEQ IDNO :79 ；HVR-L2为 SEQ ID NO 80 ；HVR-L3 为 SEQ ID NO :81 ；HVR-Hl 为 SEQ ID NO :82 ；HVR-H2 为 SEQ IDNO :83 ;HVR-H3 为 SEQ ID NO 84) ；h2G9. K4G1. v52 (HVR-LI 为 SEQ ID NO :85 ;HVR_L2 为SEQ ID NO 86 ；HVR-L3 为 SEQ ID NO :87 ；HVR-Hl 为 SEQ ID NO :88 ；HVR-H2 为 SEQ IDNO 89 ；HVR-H3 为 SEQ ID NO :90) ；h2G9. K4G1. v55 (HVR-LI 为 SEQ IDNO :91 ；HVR-L2 为 SEQID NO 92 ；HVR-L3 为 SEQ ID NO :93 ；HVR-Hl 为 SEQ ID NO :94 ；HVR-H2 为 SEQ ID NO :95 ；HVR-H3 为 SEQ ID NO 96) ；h2G9. K4G1. v63 (HVR-LI 为 SEQ ID NO :97 ;HVR_L2 为 SEQ IDNO 98 ；HVR-L3 为 SEQ ID NO :99 ；HVR-Hl 为 SEQ ID NO :100 ；HVR-H2 为 SEQ IDNO :101 ；HVR-H3 为 SEQ ID NO :102) ；h2G9. K4G1. v64 (HVR-LI 为 SEQ IDNO :103 ；HVR-L2 为 SEQ IDNO 104 ；HVR-L3 为 SEQ ID NO :105 ；HVR-Hl 为 SEQ ID NO :106 ；HVR-H2 为 SEQ ID NO :107 ；HVR-H3 为 SEQ ID NO 108)；h2G9. K4G1. v65 (HVR-LI 为 SEQ ID NO :109 ；HVR-L2 为 SEQ IDNO 110 ；HVR-L3 为 SEQ ID NO :111 ；HVR-Hl 为 SEQ ID NO :112 ；HVR-H2 为 SEQ ID NO :113 ;HVR-H3 为 SEQ ID NO 114)；h2G9. K4G1. v67 (HVR-LI 为 SEQ ID NO :115 ；HVR-L2 为 SEQ IDNO 116 ；HVR-L3 为 SEQ ID NO :117 ；HVR-Hl 为 SEQ ID NO :118 ；HVR-H2 为 SEQ ID NO :119 ;HVR-H3 为 SEQ ID NO 120)；h2G9. K4G1. v73 (HVR-LI 为 SEQ ID NO :121 ；HVR-L2 为 SEQ IDNO 122 ；HVR-L3 为 SEQ ID NO :123 ；HVR-Hl 为 SEQ ID NO :124 ；HVR-H2 为 SEQ ID NO :125 ；HVR-H3 为 SEQ ID NO 126)；h2G9. K4G1. v75 (HVR-LI 为 SEQ ID NO :127 ；HVR-L2 为 SEQ IDNO 128 ；HVR-L3 为 SEQ ID NO :129 ；HVR-Hl 为 SEQ ID NO :130 ；HVR-H2 为 SEQ IDNO :131 ；HVR-H3 为 SEQ ID NO :132) ；h2G9. K4G1. v77 (HVR-LI 为 SEQ IDNO :133 ；HVR-L2 为 SEQ IDNO 134 ；HVR-L3 为 SEQ ID NO :135 ；HVR-Hl 为 SEQ ID NO :136 ；HVR-H2 为 SEQ ID NO :137 ；HVR-H3 为 SEQ ID NO 138)；h2G9. K4G1. v80 (HVR-LI 为 SEQ ID NO :139 ；HVR-L2 为 SEQ IDNO 140 ；HVR-L3 为 SEQ ID NO :141 ；HVR-Hl 为 SEQ ID NO :142 ；HVR-H2 为 SEQ ID NO :143 ；HVR-H3 为 SEQ ID NO 144)；h2G9. K4G1. v92 (HVR-LI 为 SEQ ID NO :145 ；HVR-L2 为 SEQ IDNO 146 ；HVR-L3 为 SEQ ID NO :147 ；HVR-Hl 为 SEQ ID NO :148 ；HVR-H2 为 SEQ ID NO :149 ；HVR-H3 为 SEQ ID NO :150) ；h2G9. K4G1. vl9H/v55L (HVR-LI 为 SEQ ID NO :151 ；HVR-L2 为SEQ ID NO 152 ;HVR_L 3 为 SEQ ID NO :153 ;HVR-HI 为 SEQ IDNO :154 ;HVR_H2 为 SEQ ID NO 155 ；HVR-H3 为 SEQ ID NO :156);嵌合 2B9 (HVR-LI 为 SEQ ID NO :157 ；HVR-L2 为 SEQ IDNO 158 ；HVR-L3 为 SEQ ID NO :159 ；HVR-Hl 为 SEQ ID NO :160 ；HVR-H2 为 SEQ ID NO :161 ；HVR-H3 为 SEQ ID NO :162);h2B9. vl(HVR_Ll 为 SEQ ID NO :163 ;HVR_L2 为 SEQ ID NO :164;HVR-L3 为 SEQ ID NO :165 ；HVR-Hl 为 SEQ IDNO :166 ；HVR-H2 为 SEQ ID NO :167 ；HVR-H3 为SEQ ID NO 168)；h2B9. vlO (HVR-LI 为 SEQ ID NO :169 ；HVR-L2 为 SEQ ID NO :170 ；HVR-L3为 SEQID NO 171 ；HVR-Hl 为 SEQ ID NO :172 ；HVR-H2 为 SEQ ID NO :173 ；HVR-H3 为 SEQ IDNO 174) ；h2B9. v23 (HVR-LI 为 SEQ ID NO :175 ；HVR-L2 为 SEQ ID NO :176 ；HVR-L3 为 SEQID NO 177 ；HVR-Hl 为 SEQ ID NO :178 ；HVR-H2 为 SEQ ID NO :179 ；HVR-H3 为 SEQ ID NO 180) ；h2B9. v37 (HVR-LI 为 SEQ ID NO : 181 ;HVR_L2 为 SEQ ID NO : 182 ;HVR_L3 为 SEQIDNO 183 ；HVR-Hl 为 SEQ ID NO :184 ；HVR-H2 为 SEQ ID NO :185 ；HVR-H3 为 SEQ ID NO :186);h2B9. v56(HVR-Ll 为 SEQ ID NO :187 ;HVR_L2 为 SEQ ID NO :188 ;HVR_L3 为 SEQ ID NO :189 ;HVR-Hl 为 SEQ ID NO :190 ;HVR_H2 为 SEQ ID NO :191 ;HVR_H3 为 SEQ ID NO 192)；h2B9. v76(HVR-L1 为 SEQ ID NO :193 ;HVR_L2 为 SEQ ID NO : 194 ;HVR_L3 为 SEQID NO :195 ;HVR-HI 为SEQ ID NO 196 ；HVR-H2 为 SEQ ID NO :197 ；HVR-H3 为 SEQ ID NO :198);嵌合 3F1 (HVR-LI为 SEQ ID NO 199 ；HVR-L2 为 SEQ ID NO :200 ；HVR-L3 为 SEQ ID NO :201 ；HVR-Hl 为 SEQID NO 202 ；HVR-H2 为 SEQ ID NO :203 ；HVR-H3 为 SEQ ID NO 204)；h3Fl. vl (HVR-L1 为 SEQID NO 205 ；HVR-L2 为 SEQ ID NO :206 ；HVR-L3 为 SEQ ID NO :207 ；HVR-Hl 为 SEQ ID NO 208 ；HVR-H2 为 SEQ ID NO :209 ；HVR-H3 为 SEQ ID NO :210);和嵌合 2D3CHVR-L1 为 SEQ IDNO 211 ；HVR-L2 为 SEQ ID NO :212 ；HVR-L3 为 SEQ ID NO :213 ；HVR-Hl 为 SEQ IDNO :214 ；HVR-H2 为 SEQ ID NO :215 ；HVR-H3 为 SEQ ID NO :216)。氨基酸位置依照下文所述Kabat编号系统来编号。图1G。人VL卡帕(K )亚组IV共有框架序列减去Kabat轻链HVR序列显示于SEQID NO :240。人VH亚组I共有框架序列减去Kabat重链HVR序列显示于SEQ ID NO :241。图2A-B。抗BvS抗体2G9变体的㈧轻链可变域和⑶重链可变域的氨基酸序列。位置依照Kabat来编号且高变区以框示。图3A-B。抗BvS抗体2B9变体的㈧轻链可变域和⑶重链可变域的氨基酸序列。位置依照Kabat来编号且高变区以框示。图4A-B。抗BvS抗体3F1变体的(A)轻链可变域和(B)重链可变域的氨基酸序列。位置依照Kabat来编号且高变区以框示。图5A-B。抗BvS抗体2D3变体的㈧轻链可变域和⑶重链可变域的氨基酸序列。位置依照Kabat来编号且高变区以框示。图6A-B。人源化抗Bv8抗体2B9变体的(A)轻链可变域和(B)重链可变域的氨基酸序列。位置依照Kabat来编号且高变区以框示。图7。轻链可变域氨基酸序列，显示⑴小鼠2G9 (m2G9)框架序列和人共有卡帕I框架序列及(2)m2G9框架序列和人共有卡帕IV框架序列之间的差异。位置依照Kabat来编号且高变区以框示。图8。重链可变域氨基酸序列，显示(I)小鼠2G9(m2G9)框架序列和人共有亚组I(Gl)框架序列及(2)m2G9框架序列和人共有亚组III(G3)框架序列之间的差异。位置依照Kabat来编号且高变区以框示。图 9。抗Bv8 抗体h2G9. K4G1. Polish,h2G9. K4G1. v27、h2G9. K4G1. v52、h2G9. K4G1.v55、h2G9. K4G1. v63、h2G9. K4G1. v64、h2G9. K4G1. v67、h2G9. K4G1. v77 和 h2G9. K4G1. v80 的L1、L2和L3氨基酸序列。图 10。抗 Bv8 抗体 h2G9. K4G1. Polish、h2G9. K4G1. vl9、h2G9. K4G1. v25、h2G9.K4G1. v37、h2G9. K4G1. v65、h2G9. K4G1. v73、h2G9. K4G1. v75、h2G9. K4G1. v77、h2G9. K4G1.v92的Hl、H2和H3氨基酸序列。图11显示嵌合2D3抗体可具有与嵌合2B9以及嵌合3F1和嵌合2G9抗体不同的表位。ELISA竞争测定法显示嵌合3F1和嵌合2G9抗体与嵌合2B9竞争对人Bv8的结合。嵌合2D3仅仅部分地与嵌 合2B9抗体竞争对人Bv8的结合。图12显示小鼠2G9、嵌合2G9、小鼠2B9、嵌合2B9和嵌合3F1对人Bv8诱导的ACE细胞增殖的阻断。该测定法的结果显示嵌合2G9能够完全抑制人BvS诱导的ACE细胞增殖。图 13 显示嵌合 2G9、h2G9. K4Gl、h2G9. K4G3、h2G9. KlGl 和 h2G9. K1G3 抗 Bv8 抗体对人BvS诱导的ACE细胞增殖的阻断。该测定法的结果显示嵌合2G9抗BvS抗体在20 μ g/mL抗体浓度具有最高阻断活性。图14A-B描绘来自噬菌体竞争测定法的结果，证明h2G9.K4Gl变体(L1:D28E、D28S、G29A、G29S, H2 :C52aA、C52aS、N54A、N54S, H3 :D95E、D95S、G96A 和 G96S)针对人 Bv8
的结合。图15显示嵌合2G9和h2G9. K4G1. Polish抗Bv8抗体对人Bv8诱导的ACE细胞增殖的阻断。图16描绘来自噬菌体竞争测定法的结果，证明亲和力改善的h2G9.K4Gl. Polish变体(来自 L1/L2 软随机化文库的 h2G9. K4G1. v27、v52、v55、v63、v64、v67、v77、v80)针对人Bv8的结合。图17来自噬菌体竞争测定法的结果，证明亲和力改善的h2G9. K4G1. Polish变体(来自 H1/H2 软随机化文库的 h2G9. K4G1. vl9、v25、v37、v65、v73、v75、ν77· v92)针对人 Bv8
的结合。图18显示下述抗Bv8抗体(Fab)针对人Bv8的解离常数h2G9. K4G1. Polish，h2G9. K4G1. vl9, h2G9. K4G1. v52, h2G9. K4G1. v55 和 h2G9. K4G1. v73。图19 显示人源化抗 Bv8 抗体(Fab 和 IgG)h2G9. K4G1. vl9 和 h2G9. K4G1. v55 针对人Bv8和猕猴Bv8的解离常数。图20显示于25° C在人Bv8固定化BIAcore芯片上注射50nM抗Bv8 Fab抗体的
传感图，证明解离速率改善。图21显示下述抗BvS抗体(IgG)针对人BvS和猕猴BvS的解离常数嵌合2G9，h2G9. K4G1. vl9 和 h2G9. K4G1. v55。结果显示人源化抗 Bv8 抗体 h2G9. K4G1. vl9 和 h2G9.K4G1. v55的亲和力表现为比嵌合2G9抗Bv8抗体紧密至少两倍。图22显示人源化抗Bv8抗体阻断人Bv8对小鼠2G9抗体的结合。五种亲和力成熟的人源化抗 Bv8 抗体(h2G9. K4G1. vl9、h2G9. K4G1. v52、h2G9. K4G1. v55、h2G9. K4G1. v73和h2G9. K4G1. vl9H/v55L)具有与亲本改进型K4G1分子相比强大约5_8倍的阻断能力。图 23 显示嵌合 2G9, h2G9K4Gl. Polish, h2G9K4Gl. vl9, h2G9K4Gl. v52, h2G9K4Gl.v55和h2G9K4Gl. v73抗Bv8抗体在指定浓度(μ g/mL)对人Bv8诱导的ACE细胞增殖的阻断。人源化抗 Bv8 抗体 h2G9K4GL vl9、h2G9K4GL v52、h2G9K4GL v55 和 h2G9K4GL v73 显示阻断人Bv8诱导的ACE增殖方面的显著改善。图 24 显示 h2G9K4Gl. Polished、h2G9K4Gl. vl9、h2G9K4Gl. v55 和嵌合 2D3 抗 Bv8抗体在指定浓度(μ g/mL)对小鼠Bv8诱导的ACE细胞增殖的阻断。图25。嵌合3F1、嵌合2B9、嵌合2D3和嵌合2G9抗Bv8抗体在治疗HM7人结肠癌中的功效研究。 图26。嵌合3F1、嵌合2B9、嵌合2D3和嵌合2G9抗Bv8抗体在治疗A673人横纹肌肉瘤癌症中的功效研究。图27。嵌合3F1、嵌合2B9、嵌合2D3和嵌合2G9抗Bv8抗体在治疗HT55人结肠癌中的功效研究。图28。嵌合3F1、嵌合2B9、嵌合2D3和嵌合2G9抗Bv8抗体在治疗Calu-6人肺癌中的功效研究。图29。嵌合3F1、嵌合2B9、嵌合2D3和嵌合2G9抗Bv8抗体在治疗Colo-205人结肠癌中的功效研究。图30。嵌合3F1、嵌合2B9、嵌合2D3和嵌合2G9抗Bv8抗体在治疗HPAC人胰腺癌中的功效研究。图31。嵌合 2G9, h2G9. K4G1. vl9 和 h2G9. K4G1. v55 抗 Bv8 抗体在治疗 Calu-6 人肺癌中的功效研究。图 32。嵌合 2D3, h2G9. K4G1. Polish,h2G9. K4G1. vl9 和 h2G9. K4G1. v55 抗 Bv8 抗体在治疗HM7人结肠癌中的功效研究。图33。嵌合 2G9、h2G9. K4G1. vl9 和 h2G9. K4G1. v55 抗 Bv8 抗体在治疗 A673 人横纹肌肉瘤癌症中的功效研究。图34。嵌合 2G9、h2G9. K4G1. vl9 和 h2G9. K4G1. v55 抗 Bv8 抗体在治疗 HT55 人结肠癌中的功效研究。图35。嵌合 2G9、h2G9. K4G1. vl9 和 h2G9. K4G1. v55 抗 Bv8 抗体在治疗 Colo-205人结肠癌中的功效研究。
图 36。嵌合 2G9、h2G9. K4G1. vl9 和 h2G9. K4G1. v55 抗 Bv8 抗体在治疗 HPAC 人胰腺癌中的功效研究。图37。抗Bv8小鼠抗体(3F1和2B9)在有和无抗VEGF抗体下治疗LXFL529人肺非小细胞癌细胞中的功效研究。图38显示Lewis肺癌(LLC)同种异体移植物响应作为单一药剂或与抗VEGF抗体组合的抗Bv8抗体的生长抑制。图39显示HM7人结肠直肠癌异种移植物响应作为单一药剂或与抗VEGF抗体组合的抗Bv8抗体的生长抑制。图40显示H460人非小细胞肺癌异种移植物响应与抗VEGF抗体组合的抗Bv8抗体的生长抑制。图41显示携带H460人非小细胞肺癌异种移植物的小鼠响应与抗VEGF抗体组合的抗Bv8抗体的延长的存活。图42显示HT29人结肠直肠癌异种移植物响应单独的与抗VEGF抗体组合的抗Bv8抗体的生长抑制。图43显示携带HT29人结肠直肠癌异种移植物的小鼠响应单独的与抗VEGF抗体组合的抗Bv8抗体的延长的存活。发明详述本发明提供抗Bv8抗体的方法、组合物、试剂盒和制品。本文中提供这些方法、组合物、试剂盒和制品的详情。

通用技术本文中描述或提到的技术和规程一般得到了本领域技术人员的充分理解，而且通常利用常规方法得以采用，诸如例如下列文献中记载的广泛应用的方法SambiOOket al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3rd. edition(2001)Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y ;CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY(F. M. Ausubel, et al. eds. , (2003))；丛书 METHODS IN ENZYM0L0GY(AcademicPress, Inc.) : PCR2:A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Tayloreds. (1995)) ；Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, ALAB0RAT0RY MANUAL ;及 ANIMALCELL CULTURE (R.1. Freshney, ed. (1987))。定义术语“Bv8”、“Bv8同系物”、“起动蛋白原 _2”(也称作 “PK2”、“KAL4”、和 “MIT1”)在本文中可互换使用，指全长多肽和/或全长多肽的活性片段。天然序列BvS涵盖BvS的天然存在前原(prepro)、原(pro)和成熟形式和截短形式，天然存在变体形式(例如可变剪接形式和天然存在等位变体。在某些实施方案中，天然BvS氨基酸序列显示于SEQ ID N0:235 至 239。人和鼠 Bv8 序列也披露于例如 Wechselberger et al. (FEBSLett. 462:177-181(1999))及 Li et al. (Mol. Pharm. 59:692-698(2001))。“Bv8受体”指BvS结合的和介导BvS生物学特性的分子。因此，术语“Bv8受体”在其含义内包括 PKR1/GPR73/EG-VEGF 受体-1/PR0KR1 和 PKR2/GPR73L1/EG-VEGF 受体-2/PR0KR2(LeCouter et al. , 2003, Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 100:2685-2690;Lin etal. , 2002, J. Biol. Chem. , 277:19276-19280;Masuda et al. , 2002, Biochem. Biophys. Res.Commun. , 293:396-402)。术语“生物学活性”和“有生物学活性的”就多肽而言指分子特异性结合并调节细胞应答(例如增殖、迁移等)的能力。细胞应答还包括那些经由受体介导的，包括但不限于迁移和/或增殖。关于Bv8，为了本文中的目的，“有活性的”或“活性”指保留天然的或天然发生的BvS的生物学和/或免疫学活性的BvS形式，其中“生物学”活性指天然的或天然发生的BvS所拥有的，在诱导针对抗原性表位的抗体生成的能力以外，由天然的或天然发生的BvS引起的生物学功能(或是抑制性或是刺激性的)，而“免疫学”活性指天然的或天然发生的BvS所拥有的，诱导针对抗原性表位的抗体生成的能力。在某些实施方案中，BvS的生物学活性是调控髓样细胞动员、促进肿瘤血管发生和/或促进肿瘤转移的能力。术语“抗BvS抗体”或“结合BvS的抗体”指能够以足够亲和力结合Bv8，使得该抗体可用作靶向Bv8的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在某些实施方案中，结合Bv8的抗体具有彡I μ M、彡ΙΟΟηΜ、彡ΙΟηΜ、彡InM、彡O.1nM、或彡O. OlnM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗Bv8抗体结合在来自不同物种的Bv8之间保守的Bv8表位。在某些实施方案中，抗Bv8抗体与选自下组的抗体结合人Bv8上相同表位嵌合2G9，h2G9. K4G1. vl9，h2G9. K4G1.v52,h2G9. K4G1. v55,h2G9. K4G1. v73和嵌合2D3。在某些实施方案中，抗Bv8抗体与选自下组的抗体竞争对人 Bv8 的结合嵌合 2G9，h2G9. K4G1. vl9,h2G9. K4G1. v52，h2G9. K4G1. v55,h2G9. K4G1. v73 和嵌合 2D3。“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的。低亲和力抗体通常缓慢的结合抗原且趋于容易解离，而高亲和力抗体通常更快速的结合抗原且趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量结合亲和力的多种方法，其中任一种都可用于本发明的目的。下文描述了具体的示例性实施方案。在某些实施方案中，依照本发明的“Kd”或“Kd值”是通过如下测定法所述使用Fab型式的抗BvS抗体及其抗原进行的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的通过在存在未标记抗原的滴定系列的条件下，用最小浓度的125I标记抗原平衡，然后用抗Fab抗体包被的平板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(Chen，et al.，(1999) J. MolBiol 293:865-881)。为了确定测定 条件,用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5yg/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被微量滴定板(Dynex)过夜，随后用PBS中的2%(w/v)牛血清清蛋白在室温(约23° C)封闭2-5小时。在非吸附平板(Nunc #269620)中，将IOOpM或26pM[125I]_抗原与连续稀释的目的Fab混合(例如与Presta et al. , (1997)CancerRes. 57:4593-4599中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致)。然后将目的Fab保温过夜；不过，保温可持续更长时间(例如65个小时)以保证达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板以进行室温保温(例如I小时)。然后除去溶液，并用含O. 1% Tween -20的PBS洗板8次。平板干燥后，加入150 μ I/孔闪烁液(MicroScint _20; Packard),然后在TopCount伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20%的浓度用于竞争性结合测定法。依照另一实施方案，Kd或Kd值是通过表面等离振子共振测定法使用BIAcore -2000 或 BIAcore -3000 (BIAcore, Inc. , Piscataway, NJ)在 25° C 使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’ - (3- 二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。用IOmM乙酸钠pH 4. 8将抗原稀释至5 μ g/ml (约O. 2 μ Μ),然后以5 μ I/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入IM乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25° C以约25 μ I/分钟的流速注入在含O. 05% Tween -20的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(O. 78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcore EvaluationSoftware version 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(km)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率I^ffZXn计算。参见例如Chen，Y.，et al. , (1999) J. Mol.Biol. 293:865-881。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过10 -^那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(astop-flow equipped spectrophometer) (Aviv Instruments)或 8000 系列 SLM-Aminco 分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量,在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS，pH 7. 2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)在25° C的荧光发射强度(激发=295nm ;发射=340nm, 16nm带通)的升高或降低。“分离的”核酸分子指已经鉴定且与抗体核酸的天然来源中通常与之关联的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。分离的核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的核酸分子因此与存在于天然细胞中时的核酸分子有区别。然而，分离的核酸分子包括通常表达该抗体的细胞中所包含 的核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。术语“载体”在用于本文时意指能够运输与其连接的其它核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，指其中可连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。另一类载体是噬菌体载体。另一类载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)可在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，由此随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“重组载体”或“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用。“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶或者通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。如果有的话，对核苷酸结构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在合成后进一步修饰，诸如通过与标记物偶联。其它类型的修饰包括例如“帽”，将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物替代，核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷连接(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有带电荷连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰，含有悬垂模块(pendant moiety)诸如例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的修饰、具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰、含有烧化剂的修饰、具有经修饰连接(例如α端基异构核酸(anomeric nucleic acid)等)的修饰、以及未修饰形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖类中的任何羟基可以用例如膦酸(phosphonate)基团、磷酸(phosphate)基团替换,用标准保护基团保护，或活化以制备与别的核苷酸的别的连接，或者可偶联至固体和半固体支持物。5’和3’末端OH可磷酸化或者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团模块取代。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸还可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包括例如2’ -氧-甲基、2’ _氧-烯丙基、2’ -氟-或2’ -叠氮-核糖，碳环糖类似物，α -端基异构糖,差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、批喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，无环类似物及脱碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于以下实施方案，其中磷酸酯用P(O)S (“硫代酸酯”(thioate))、P(S)
S(“二硫代酸酯” (dithioate) )、(O)NR2 (“酰胺酯” (amidate) )、P (O) R、P (O) OR’、CO 或 CH2(“甲缩醛” (formacetal))替代，其中R或R’各自独立为H或者取代或未取代的烷基(1_20个C)，任选含有醚(-0-)连接、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。前述描述适用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和 DNA。“寡核苷酸”在用于本文时一般指短的多核苷酸，一般是单链，一般是合成的，长度一般但不是必需小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”与“多核苷酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述平等且完全适用于寡核苷酸。术语“抗体”和“免疫球蛋白”以最广义互换使用，包括单克隆抗体(例如全长或完整单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体，只要它们展现出期望的生物学活性)，而且还可以包括某些抗体片段(如本文中更为详细描述的)。抗体可以是人的、人源化的和/或亲和力成熟的。
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“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(I)根据Lowry法的测定，抗体重量超过95%，最优选重量超过99%，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用考马斯蓝或优选银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。“可变的”指可变域中的某些部分在抗体序列间差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作互补决定区或高变区(CDR或HVR，在本文中可互换使用)的三个区段。可变域中较保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取β_折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β_折叠片结构一部分的三个HVR连接。每条链中的HVR通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的HVR —起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.，序列of Proteinsof Immunological Interest,第 5 版，National Institute of Health, Bethesda, MD.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞的(细胞)毒性中抗体的参与。用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，及一个剩余的“Fe”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F (ab’)2片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。在双链Fv种类中，此区由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价相连，使得轻链和重链在与双链Fv种类类似的“二聚体”结构中相结合。正是在这种构造中，各可变域的三个HVR相互作用而在Vh-' 二聚体表面上确定了抗原结合位点。六个HVR共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或只包含对抗原特异的三个HVR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。Fab片段还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CHl)。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于重链CHl结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’ -SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab’的称谓。？(&13’)2抗体片段最初是作为在Fab’片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab’片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(K)和拉姆达(λ)。根据其重链恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类。免疫球蛋白有五大类IgA、IgD、IgE、Ig G和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、Y和μ。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的。“抗体片段”只包含完整抗体的一部分，其中所述部分优选保留该部分存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项、优选大多数或所有功能。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab' )2和？￥片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点，如此保留结合抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体片段，例如包含Fe区的抗体片段，保留通常与Fe区存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项生物学功能，诸如FcRn结合、抗体半衰期调控、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段是体内半衰期与完整抗体基本上相似的单价抗体。例如，这样的抗体片段可包含一个抗原结合臂且其与能够赋予该片段以体内稳定性的Fe序列相连。术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个HVR :三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3展示这六个HVR的最大多样性，而且认为特别是H3在赋予抗体以精密特异性中发挥独特作用。参见例如Xu etal. , Immunity 13:37-45 (2000);Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology248:1-25 (Lo, ed. , Human Press, Totowa, NJ, 2003)。事实上，仅由重链组成的天然存在camelid抗体在缺乏轻链时是有功能的且稳定的。参见例如Hamers-Casterman et al. , Nature363:446-448(1993);Sheriff et al. , Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)。本文中使用且涵盖许多HVR的叙述。Kabat互补决定区(OTR)是以序列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat et al·，序列 of Proteins of Immunological Interest, 5thEd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothia 改为指结构环的位置(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917(1987))。AbMHVR代表Kabat HVR与Chothia结构环之间的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触(contact)” HVR是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些HVR中每一个的残基。
权利要求
1.一种抗BvS抗体，其包含可变域，该可变域包含至少一种、两种、三种、四种、五种或六种选自下组的高变区(HVR)序列(i)包含KasqSX1X2YX3X4X5SYMN 的 HVR-Ll，其中 X1 为 L 或 V ;X2 为 D 或 I ;X3 为 D、F、G、S、W 或 Y ;X4 为 A、G、H 或 V ;且 X5 为 D、E 或 Y ; (ii)包含AASX1X2EX3的HVR-L2，其中X1为N或Y;X2为L或R ;且X3为S或T ;(iii)包含QQINEDPFT 的 HVR-L3 ；(iv)包含GYX1X2X3X4YDMH 的 HVR-H1，其中 X1 为 S 或 T ;X2 为 F 或 L ;X3 为 F、M、P、T 或V;且 X4 为 D、E、H、I 或 N ;(V)包含 YixiX2Yx3Gx4Tx5YNQKFKG 的 HVR-H2，其中 X1 为 H、S 或 T ;X2 为 C、S 或 T ;X3 为A、L、N、S或T ;X4 为 A、E或 S ;父5为1、L、S*T，^P (vi)包含 Dx1NygeayamDy 的 HVR-H3，其中 X1 为 G 或 S。
2.权利要求1的抗BvS抗体，其包含可变域，该可变域包含下述六种HVR序列(i)包含KasqSX1X2YX3X4X5SYMN 的 HVR-Ll，其中 X1 为 L 或 V ;X2 为 D 或 I ;X3 为 D、F、G、S、W 或 Y ;X4 为 A、G、H 或 V ;且 X5 为 D、E 或 Y ; (ii)包含AASX1X2EX3的HVR-L2，其中X1为N或Y;X2为L或R ;且X3为S或T ;(iii)包含QQINEDPFT 的 HVR-L3 ；(iv)包含GX1X2X3X4TYGX5S 的 HVR-Hl，其中 X1 为 S 或 T ;X2 为 F 或 L ;X3 为 F、M、P、T 或V;且 X4 为 D、E、H、I 或 N ;(V)包含 YixiX2Yx3Gx4Tx5YNQKFKG 的 HVR-H2，其中 X1 为 H、S 或 T ;X2 为 C、S 或 T ;X3 为A、L、N、S或T ;X4 为 A、E或 S ;父5为1、L、S*T，^P (vi)包含 Dx1NygeayamDy 的 HVR-H3，其中 X1 为 G 或 S。
3.权利要求2的抗Bv8抗体，其中HVR-Ll包含选自SEQID NO :49、55、61、67、73、79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145 和 151 的氨基酸序列，HVR-L2 包含选自 SEQID NO :50、56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146 和 152 的氨基酸序列，HVR-L3 包含选自 SEQ ID NO :51、57、63、69、75、81、87、93、99、105、111、117、123、129、135、141、147 和 153 的氨基酸序列，HVR-Hl 包含选自 SEQ ID NO :52、58、64、70、76、82、88、94、100、106、112、118、124、130、136、142、148 和 154 的氨基酸序列，HVR-H2 包含选自 SEQID NO :53、59、65、71、77、83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、149 和 155 的氨基酸序列，且 HVR-H3 包含选自 SEQ ID NO :54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150 和 156 的氨基酸序列。
4.权利要求1的抗BvS抗体，其包含可变域，该可变域包含至少一种、两种、三种、四种、五种或六种选自下组的高变区(HVR)序列(i)包含KasqSX1X2YX3X4X5SYMN 的 HVR-Ll，其中 X1 为 L 或 V ;X2 为 D 或 I ;X3 为 F、G、S、W 或 Y ;X4 为 A、G、H 或 V ;且 X5 为 D、E 或 Y ; (ii)包含AASX1X2EX3的HVR-L2，其中X1为N或Y;X2为L或R ;且X3为S或T ;(iii)包含QQINEDPFT 的 HVR-L3 ；(iv)包含GYX1X2X3X4YDMH 的 HVR-H1，其中 X1 为 S 或 T ;X2 为 F 或 L ;X3 为 F、M、P、T 或V;且 X4 为 D、E、H、I 或 N ;(V)包含 YixiX2Yx3Gx4Tx5YNQKFKG 的 HVR-H2，其中 X1 为 H、S 或 T ;X2 为 S 或 T ;X3 为 A、L、S 或T ;X4 为 A、E 或 S ;父5为1、L、S*T，^P (vi)包含 DSNYGEAYAMDY 的 HVR-H3。
5.权利要求4的抗BvS抗体，其包含可变域，该可变域包含下述六种HVR序列(i)包含KasqSX1X2YX3X4X5SYMN 的 HVR-Ll，其中 X1 为 L 或 V ;X2 为 D 或 I ;X3 为 F、G、S、W 或 Y ;X4 为 A、G、H 或 V ;且 X5 为 D、E 或 Y ; (ii)包含AASX1X2EX3的HVR-L2，其中X1为N或Y;X2为L或R ;且X3为S或T ;(iii)包含QQINEDPFT 的 HVR-L3 ；(iv)包含GYX1X2X3X4YDMH 的 HVR-H1，其中 X1 为 S 或 T ;X2 为 F 或 L ;X3 为 F、M、P、T 或V;X4 为 D、E、H、I，或N;(V)包含 YixiX2Yx3Gx4Tx5YNQKFKG 的 HVR-H2，其中 X1 为 H、S 或 T ;X2 为 S 或 T ;X3 为 A、L、S 或T ;X4 为 A、E 或 S ;父5为1、L、S*T，^P (vi)包含 DSNYGEAYAMDY 的 HVR-H3。
6.权利要求5的抗Bv8抗体，其中HVR-Ll包含选自SEQID NO :55、61、67、73、79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145 和 151 的氨基酸序列，HVR-L2 包含选自 SEQ IDNO :56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146 和 152 的氨基酸序列，HVR-L3 包含选自 SEQ ID NO :57、63、69、75、81、87、93、99、105、111、117、123、129、135、141、147 和 153 的氨基酸序列，HVR-Hl 包含选自 SEQ ID NO :58、64、70、76、82、88、94、100、106、112、118、124、130、136、142、148 和 154 的氨基酸序列，HVR-H2 包含选自 SEQ ID NO :59、65、71、77、83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、149 和 155 的氨基酸序列，且 HVR-H3包含选自 SEQ ID NO :60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150 和156的氨基酸序列。
7.权利要求1-6任一项的抗Bv8抗体，其中该抗体包含 (1)包含氨基酸序列SEQID NO 61的HVR-Hl ； (2)包含氨基酸序列SEQID NO 62的HVR-H2 ； (3)包含氨基酸序列SEQID NO 63的HVR-H3 ； (4)包含氨基酸序列SEQID NO 64的HVR-Ll ； (5)包含氨基酸序列SEQID NO 65的HVR-L2 ;和 (6)包含氨基酸序列SEQID NO 66的HVR-L3。
8.权利要求1-6任一项的抗Bv8抗体，其中该抗体包含 (1)包含氨基酸序列SEQID NO 85的HVR-Hl ； (2)包含氨基酸序列SEQID NO 86的HVR-H2 ； (3)包含氨基酸序列SEQID NO 87的HVR-H3 ； (4)包含氨基酸序列SEQID NO 88的HVR-Ll ； (5)包含氨基酸序列SEQID NO 89的HVR-L2 ;和 (6)包含氨基酸序列SEQID NO 90的HVR-L3。
9.权利要求1-6任一项的抗Bv8抗体，其中该抗体包含 (1)包含氨基酸序列SEQID NO 91的HVR-Hl ； (2)包含氨基酸序列SEQID NO 92的HVR-H2 ； (3)包含氨基酸序列SEQID NO 93的HVR-H3 ；(4)包含氨基酸序列SEQID NO 94的HVR-Ll ； (5)包含氨基酸序列SEQID NO 95的HVR-L2 ;和 (6)包含氨基酸序列SEQID NO 96的HVR-L3。
10.权利要求1-6任一项的抗Bv8抗体，其中该抗体包含 (1)包含氨基酸序列SEQID NO :121的HVR-Hl ； (2)包含氨基酸序列SEQID NO :122的HVR-H2 ； (3)包含氨基酸序列SEQID NO :123的HVR-H3 ； (4)包含氨基酸序列SEQID NO :124的HVR-Ll ； (5)包含氨基酸序列SEQID NO :125的HVR-L2 ;和 (6)包含氨基酸序列SEQID NO :126的HVR-L3。
11.权利要求1-10任一项的抗Bv8抗体，进一步包含人VLK亚组IV共有框架序列SEQ ID NO :240和人VO. OH亚组I共有框架序列SEQ ID NO :241。
12.权利要求1-6任一项的抗BvS抗体，包含轻链可变域和重链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO :7，该重链可变域包含SEQ ID NO :8。
13.权利要求1-6任一项的抗BvS抗体，包含轻链可变域和重链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO :9，该重链可变域包含SEQ ID NO :10。
14.权利要求1-6任一项的抗BvS抗体，包含轻链可变域和重链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO :11，该重链可变域包含SEQ ID NO 120
15.权利要求1-6任一项的抗BvS抗体，包含轻链可变域和重链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO : 13，该重链可变域包含SEQ ID NO 140
16.权利要求1-15任一项的抗Bv8抗体，其中该抗Bv8抗体以小于约O.02nM的Kd值结合人Bv8。
17.权利要求1-15任一项的抗Bv8抗体，其中该抗Bv8抗体结合人Bv8的紧密程度比嵌合2G9抗Bv8抗体高至少两倍。
18.—种结合BvS的抗体或其片段，其中该抗体包含可变域，该可变域包含下述六种HVR序列 (i)包含SASSXJFYMH 的 HVR-Ll，其中 X1 为 P 或 S ;(ii)包含DTSX1LAS 的 HVR-L2，其中 X1 为 K 或 N ;(iii)包含QQffSX1X2PX3T 的 HVR-L3，其中 X1 为 F、S、W 或 Y ;X2 为 D 或 E ;X3 为1、L 或 M ;(iv)包含GfxiX2STX3GMGVS 的 HVR-Hl，其中 X1 为 L 或 Y ;X2 为 I 或 L ;X3 为 P 或 S ; (V)包含 HIYWDDDTRYNPSLKS 的 HVR-H2，和 (vi)包含 RDHGYYWFDY 的 HVR-H3。
19.权利要求18的抗Bv8抗体，其中HVR-Ll包含选自SEQID NO : 169、175、181、187和193的氨基酸序列，HVR-L2包含选自SEQ ID NO : 170、176、182、188和194的氨基酸序列，HVR-L3包含选自SEQ ID NO :171、177、183、189和195的氨基酸序列，HVR-Hl包含选自SEQID NO : 172、178、184、190 和 196 的氨基酸序列，HVR-H2 包含选自 SEQ ID NO : 173、179、185、191和197的氨基酸序列，且HVR-H3包含选自SEQ ID NO : 174、180、186、192和198的氨基酸序列。
20.编码权利要求1-19任一项的抗体的核酸。
21.包含权利要求20的核酸的载体。
22.权利要求21的载体，其中该载体为表达载体。
23.包含权利要求21或22的载体的宿主细胞。
24.包含权利要求1-19任一项的抗体的组合物。
25.权利要求24的组合物，其中该组合物包含载体。
26.权利要求24或25的组合物，其为药物组合物。
27.—种用于制备抗Bv8抗体的方法,所述方法包括(a)在合适宿主细胞中表达权利要求21或22的载体，并(b)回收该抗体。
28.权利要求27的方法，其中该宿主细胞是原核的。
29.权利要求27的方法，其中该宿主细胞是真核的。
30.一种用于治疗肿瘤、癌症、或细胞增殖性病症的方法，该方法包括对受试者施用有效量的权利要求1-19任一项的抗Bv8抗体。
31.权利要求30的方法，其中该癌症选自下组乳腺癌，结肠直肠癌，肺癌，肾癌，成胶质细胞瘤，食管癌，黑素瘤，膀胱癌，卵巢癌，胰腺癌，和肝细胞癌。
32.权利要求31的方法，其中该癌症为乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、肾癌、卵巢癌或成胶质细胞瘤。
33.一种在具有与血管发生有关的病理状况的受试者中降低或抑制血管发生的方法，包括对受试者施用有效量的权利要求1-19任一项的抗BvS抗体，由此降低或抑制受试者中的血管发生。
34.权利要求33的方法，其中所述病理状况为新生物状况。
35.一种用于抑制内皮细胞增殖的方法，包括对受试者施用有效量的权利要求1-19任一项的抗体。
36.权利要求30-35任一项的方法，进一步包括对受试者施用有效量的第二药物，其中抗Bv8抗体为第一药物。
37.权利要求36的方法，其中该第二药物为另一种抗体、化疗剂、细胞毒剂、抗血管发生剂、免疫抑制剂、前药、细胞因子、细胞因子拮抗剂、细胞毒性放疗剂、皮质类固醇、止吐剂、癌症疫苗、止痛剂、或生长抑制剂。
38.权利要求37的方法，其中该第二药物为抗血管发生剂。
39.权利要求38的方法，其中该抗血管发生剂为抗VEGF抗体。
40.权利要求39的方法,其中该抗VEGF抗体为贝伐单抗(bevacizumab)。
41.权利要求36-40任一项的方法，其中该第二药物在施用抗Bv8抗体之前或之后施用。
42.权利要求36-40任一项的方法，其中该第二药物与抗Bv8抗体同时施用。
43.权利要求30-40任一项的方法，进一步包括对受试者施用有效量的化疗剂。
全文摘要
本发明关注针对Bv8的抗体及其用途。
文档编号C07K16/24GK103068849SQ201080064579
公开日2013年4月24日 申请日期2010年12月22日 优先权日2009年12月23日
发明者X.吴, L.俞, W-C.梁, Y-J.G.孟, J.蒂恩, 吴雁, N.费拉拉 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司