Cd33抗体及其在治疗癌症中的用图
【专利说明】CD33抗体及其在治疗癌症中的用途
[0001] 交叉申请案的交互参照
[0002] 本申请是US13/804, 227 (2013年3月14日提出申请）的延续申请，并且主张美国 临时申请号为61/649, 110 (2012年5月18日提出申请）的优先权。
【背景技术】
[0003] CD33是67kDa的质膜蛋白，其与唾液酸结合并且是唾液酸结合免疫球蛋白样凝集 素蛋白（sialic acid-binding Ig-related lectin，SIGLEC)家族中的一员。CD33 已知在 骨髓细胞中表达。⑶33在大量的恶性细胞中的表达也已有报道。虽然⑶33已被定位用于 癌症（如急性髓性白血病）的治疗，但目前市场上没有有效的CD33靶向治疗方法。本发明 解决这些和其他问题。
【发明内容】
[0004] 此处提供了与人类CD33蛋白特异性结合的单克隆抗体及使用单克隆抗体治疗癌 症（表达⑶33蛋白）的方法。单克隆抗体包含SEQ ID NOs: 19, 20和21在重链可变区的互 补性决定区（⑶Rs)和SEQ ID N0s:22, 23和24在轻链可变区的⑶Rs。在一些实施例中，至 少一个CDR具有一个保守的氨基酸取代（conserved amino acid substitution)。在一些 实施例中，分别源自SEQ ID NOS: 18和SEQ ID NOS: 8的成熟重链可变区的CDRs和成熟轻 链可变区的CDRs的任何差异位于位点H60-H65。单克隆抗体可以是鼠科动物抗体、嵌合抗 体或人源化抗体。优选的人源化抗体是h2H12抗体，如此处所公开。一方面，本发明是人源 化抗体，其包括在重链可变区的SEQ ID NOs: 19, 20和21的⑶Rs以及在轻链可变区的SEQ ID NOs: 22, 23和24的CDRs并且另外具有一个成熟重链可变区和一个成熟轻链可变区，其 中所述成熟重链可变区与SEQ ID NO: 18具有至少90%的一致性，所述成熟轻链可变区与 SEQ ID N0:8具有至少90%的一致性。此外，所述重链的以下氨基酸残基被保持：位点H48 被I取代，位点H66被K取代，位点H67被A取代，位点H69被L取代，位点H71被A取代， H94被S取代；并且所述轻链的以下氨基酸残基被保持：L22被N取代，L46被T取代，L69被 Q取代，L71被Y取代。在进一步的实施例中，所述人源化抗体包括在重链可变区的SEQ ID NOs: 19, 20和21的CDRs以及在轻链可变区的SEQ ID N0s:22, 23和24的CDRs并且另外具 有一个成熟重链可变区和一个成熟轻链可变区，其中所述成熟重链可变区与SEQ ID N0:18 具有至少95%的一致性，所述成熟轻链可变区与SEQ ID N0:8具有至少95%的一致性。
[0005] 在另一个实施例中，所述人源化2H12抗体具有成熟重链和成熟轻链，所述成熟重 链与重链恒定区融合，且所述成熟轻链与轻链恒定区融合。在进一步的实施例中，所述重链 恒定区是天然人恒定区的突变形式，且相比于所述天然人恒定区，所述天然人恒定区的突 变形式与Fcy受体的结合减少。在另一个实施例中，所述重链恒定区是IgGl同种型。示 例性的重链恒定区氨基酸序列包括SEQ ID NO: 27和SEQ ID NO: 29,其为位点239的半胱 氨酸被丝氨酸取代（S239C)的重链恒定区。示例性的轻链恒定区氨基酸序列包括SEQ ID N0:25〇
[0006] 在一个实施例中，所述人源化抗体包括成熟重链可变区和成熟轻链可变区，所述 成熟重链可变区具有SEQ ID NO: 18的氨基酸序列，且所述成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
[0007] 在一个实施例中，所述人源化抗体与细胞毒性剂（cytotoxic agent)或细胞抑制 剂（cytostatic agent，也称细胞静止素）共轭。在更进一步的实施例中，所述人源化抗体 与细胞毒性剂共轭。细胞毒性剂可以是，如DNA小沟结合剂。吡咯[1，4]苯二氮（PBD)是 细胞毒性剂的一个例子，它是与此处公开的所述人源化CD33抗体共轭的DNA小沟结合剂。 在一个实施例中，PBD与CD33抗体通过可酶切连接子共轭。在另一个实施例中，细胞毒性 剂具有分子式：
[0009] 其中波浪线显示了连接子的连接位点。
[0010] 在一个实施例中，所述人源化抗体与人或食蟹猴的CD33的结合常数为0. 5x109M_1 至 2x IO9M'
[0011] 一方面，本发明提供了治疗患有癌症（表达CD33)或有患癌风险的病患的方 法，即通过向患者施用此处公开的人源化抗体CD33的有效给药方案。CD33表达癌症 (⑶33-expressing cancers)包括急性髓性白血病（AML)，骨髓增生异常综合征（MDS)，急 性早幼粒细胞白血病（APL)，慢性髓细胞性白血病（CML)，慢性粒单核细胞白血病（CMML)， 慢性骨髓增生性疾病，前体B细胞急性淋巴细胞白血病（preB-ALL)，前体T细胞急性淋巴细 胞白血病（preT-ALL)，多发性骨髓瘤（MM)，肥大细胞病和骨髓肉瘤。一方面，本发明提供了 一种药物组合物，其包含人源化或嵌合抗体，该人源化或嵌合抗体包含在重链可变区的SEQ ID NOs: 19, 20和21的互补性决定区（CDRs)和在轻链可变区的N0s:22, 23和24的CDRs。
[0012] 一方面，本发明提供了一种人源化抗体，其具有成熟重链可变区和成熟轻链可变 区，所述成熟重链可变区与HI (具有SEQ ID NO: 18的氨基酸序列）具有至少90%的一致 性，所述成熟轻链可变区与LG(SEQ ID N0:8的氨基酸序列）具有至少90%的一致性。在另 一个实施例中，所述人源化抗体具有成熟重链可变区和成熟轻链可变区，所述成熟重链可 变区与SEQ ID NO: 18具有至少95%的一致性，所述成熟轻链可变区与SEQ ID N0:8具有 至少95%的一致性。在另一个实施例中，所述重链可变区的位点H48, H66, H67, H69, H71和 H94由I，K，A，L，A和S占据，且所述成熟轻链可变区的位点L22，L46，L69和L71由N，T，Q和 Y占据。在一些实施例中，分别源自SEQ ID N0S: 18和SEQ ID N0S:8的成熟重链可变区的 ⑶Rs和成熟轻链可变区的⑶Rs的任意区别位于位点H60-H65。
[0013] 在另一个实施例中，所述人源化抗体具有所述成熟重链可变区的CDRs和所述成 熟轻链可变区的⑶Rs，所述成熟重链可变区的⑶Rs与SEQ ID NO: 18的⑶Rs -致，所述成 熟轻链可变区的⑶Rs与SEQ ID N0:8的⑶Rs-致。在一个实施例中，所述人源化抗体包 括具有SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的成熟重链可变区和具有SEQ ID N0:8的氨基酸序列 的成熟轻链可变区。
[0014] 在一个实施例中，人源化抗体与细胞毒性剂或细胞抑制剂共轭。在一个实施例中， 人源化抗体与细胞毒性剂或细胞抑制剂共轭。在更进一步的实施例中，所述人源化抗体与 细胞毒性剂共轭。细胞毒性剂可以是，如DNA小沟结合剂。吡咯[1，4]苯二氮（PBD)是细 胞毒性剂的一个例子，它是与此处公开的所述人源化CD33抗体共轭的DNA小沟结合剂。在 一个实施例中，PBD与所述CD33抗体通过可酶切连接子共轭。在另一个实施例中，细胞毒 性剂具有分子式：
[0016] 其中波浪线显示了连接子的连接位点。
[0017] 在另一个实施例中，所述人源化抗体与人或食蟹猴的CD33的结合常数为0. 5x IO9IT1 至 2x IO9M'
[0018] 在另一个实施例中，所述人源化抗体具有成熟重链和成熟轻链，所述成熟重链与 重链恒定区融合，且所述成熟轻链与轻链恒定区融合。在进一步的实施例中，所述重链恒定 区是天然人恒定区的突变形式，且相比于所述天然人恒定区，所述天然人恒定区的突变形 式与Fcy受体的结合减少。在另一个实施例中，所述重链恒定区是IgGl同种型。示例性 的重链恒定区氨基酸序列包括SEQ ID NO: 27和SEQ ID NO: 29 (S239C)。示例性的轻链恒定 区氨基酸序列包括SEQ ID NO:25。
[0019] 另一方面，本发明提供了编码此处描述的任意成熟重链可变区或轻链可变区的核 酸。编码重链可变区的示例性的核酸包括SEQ ID N0s:39-47;编码轻链可变区的示例性的 核酸包括 SEQ ID NOs: 32-38。
[0020] 一方面，本发明提供了治疗患有癌症（表达CD33)或有患癌风险的病患的方 法，即通过向患者施用此处公开的人源化抗体CD33的有效给药方案。CD33表达癌症 (⑶33-expressing cancers)包括急性髓性白血病（AML)，骨髓增生异常综合征（MDS)，急 性早幼粒细胞白血病（APL)，慢性髓细胞性白血病（CML)，慢性粒单核细胞白血病（CMML)， 慢性骨髓增生性疾病，前体B细胞急性淋巴细胞白血病（preB-ALL)，前体T细胞急性淋巴 细胞白血病（preT-ALL)，多发性骨髓瘤（MM)，肥大细胞病和骨髓肉瘤。所述人源化抗体优 选地以药学上合适的组合物被施用。在一些实施例中，所述施用的人源化抗体与细胞毒性 剂或细胞抑制剂共轭。在一个实施例中，施用的人源化抗体与细胞毒性剂或细胞抑制剂共 轭。在更进一步的实施例中，所述施用的人源化抗体与细胞毒性剂共轭。细胞毒性剂可以 是，如DNA小沟结合剂。吡咯[1，4]苯二氮（PBD)是细胞毒性剂的一个例子，它是与此处公 开的人源化CD33抗体共轭的DNA小沟结合剂。在一个实施例中，PBD与施用的CD33抗体 通过可酶切连接子共轭。在另一个实施例中，细胞毒性剂具有分子式：
[0021]
[0022] 其中波浪线显示了连接子的连接位点。
【附图说明】
[0023] 图IA和IB显示了母体鼠科动物单克隆抗体（指m2H12)与人源化2H12重链可变 区（图1A)和轻链可变区（图1B)的氨基酸序列的对比。
[0024] 图2显示了测试2H12源抗体-药物共轭物（ADC)对抗⑶33阳性AML细胞 系HL-60和HEL 92. 1.7的活性的活体外（in vitro)细胞毒性试验的结果。h2H12d与 S⑶-1910共轭；m2H12和h2H12与S⑶-1269共轭。测试非结合对照ADC (hOOd-S⑶-1910和 h00-S⑶-1269)作为抗原特异性的对照。MYL0TARG? (吉妥珠单抗奥唑米星（gemtuzumab ozogamicn))是一个被很好地描述了的CD33定向（CD33-directed)抗体药物共轭物并进行 了测试，其包含抗-⑶33抗体hP67. 6, hP67. 6连接在细胞毒性药物卡奇霉素上。
[0025] 定义
[0026] 本发明提供了，特别是特异性地结合于人CD33蛋白及其共轭物上的单克隆抗体。 所述抗体可用于治疗和诊断表达CD33的癌症，也用于检测CD33蛋白。
[0027] "分离"的抗体是指已被识别并且从其天然环境的组分中分离和/或回收的抗体， 和/或重组产生的抗体。"纯化的抗体"通常具有至少50% w/w的纯度，其不含源自其制备 或纯化过程中的干扰蛋白质及其它污染物，但不排除该单克隆抗体与额外的制药上可接受 的载体（carrier)或其他媒介（vehicle)组合以利于其使用的可能性。干扰蛋白质及其它 污染物可以包括，例如，细胞（抗体从其中分离或重组生产）的细胞成分。有时单克隆抗体 具有至少60 % ,70% ,80% ,90%，95或99 % w/w不含源自其制备或纯化过程中的干扰蛋 白质及其它污染物的纯度。此处描述的抗体，包括以分离/或纯化形式提供的鼠科动物抗 体、嵌合抗体和人源化抗体。
[0028] 此处使用的术语"单克隆抗体"是指从实质上同种的抗体群中得到的抗体，即包 含所述抗体群的独立抗体（individual antibodies)是一致的，除了可能天然发生的突变 (可少量的存在）。修饰词"单克隆"表明了抗体是从实质上同种的抗体群得到的抗体的特 征，并且不应被解释为需要通过任何特殊方法生产抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗 体可以通过杂交瘤细胞方法（首次被Kohler et al. (1975)Nature 256:495描述）制备，或 通过重组DNA方法制备（参见，例如，专利号为4816567的美国专利）。例如，"单克隆抗体" 也可使用在 Clackson et al.(1991)Nature, 352:624-628 和 Marks et al. (1991) J.Mol. Biol.，222:581-597中描述的技术从噬菌体抗体库中分离或可通过其他方法制备。此处描 述的抗体是单克隆抗体。
[0029] 单克隆抗体与其靶标抗原的特异性结合是指至少106, 107, 108, IO9或10 wM4的亲 和性。相比于与至少一种不相关靶标的非特异性结合，特异性结合可在一个更高的数量级 上被检测出，并且可与所述的非特异性结合区分。特异性结合可以是特定官能团之间形成 键或特定空间契合（例如锁和钥匙类型）的结果，然而非特异性结合是范德华力（van der Waals forces)的结果。
[0030] 基本的抗体单位是亚基的四聚体。每个四聚体包括两对相同的多肽链，每一对多 肽链具有一条"轻链"（约25千道尔顿）及一条"重链"（约50至70千道尔顿）。每条链 的末端包括约100-110个或更多氨基酸的可变区，该可变区主要负责识别抗原。此可变区 在刚被表达时与一个可切割的信号肽（cleavable signal peptide)连接。不具有该信号 肽的可变区有时被称为成熟可变区。因此，举例来说，轻链成熟可变区是指不具有轻链信号 肽的轻链可变区。每一个条链的羧基末端部分定义了主要负责效应功能的恒定区。
[0031] 轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ、ε，并定义对应抗体的同种型 (isotype)分别为IgG, IgM, IgA, IgD和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过一个约 12或12个以上的氨基酸的"J"区连接，同时重链也包括一个约10个或更多个氨基酸"D"区 (一般见 Fundamental Immunology (Paul, W.，ed.，2nd ed. Raven Press, N. Y.，1989, Ch. 7， 以参考方式整体纳入以符合所有目的）。
[0032] 每个轻/重链对的成熟可变区可形成抗体的结合位点。因此，一个完整的抗体具有 2个结合位点。除双功能抗体或双特异性抗体外，所述两个结合位点是相同的。所述的链都 表现出相同的通用结构或相对保守的骨架区（FR)，其通过3个高变区连接，所述的高变区 也叫互补决定区或CDRs。源自每个轻/重链对的两条链的CDRs是由框架区对准，以结合到 特定的抗原表位。从N-末端至C-末端，轻链和重链均包括结构域FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、 ⑶R3和FR4。每个结构域的氨基酸分配与Kabat《免疫学重要的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)(国立卫生研宄院，Bethesda, MD, 1987 和 1991)中的定义或 Chothia&Lesk，J.Mol.Biol. 196:901-917(1987) ;Chothia 等，Nature 342:878-883(1989)的定义是一致的。Kabat还提供了一种广泛使用的编号惯例（Kabat编 号），其中，不同重链之间或不同轻链之间的相应残基被分配了相同的编号。
[0033] 术语"抗体"包括完整的抗体和其所结合的片段。通常情况下，片段与产生 它们的完整的抗体竞争结合特定的靶标，包括单独的重链和轻链Fab、Fab'、F(ab'）2、 F(ab)c、Dabs、纳米体和Fv。片段可以产生自重组DNA技术，或完整的免疫球蛋白的 酶分离或化学分离。术语"抗体"还包括双特异性抗体（同型二聚体Fv片段）或迷 你抗体（minibody) (VL-VH-CH3)、双特异性抗体或类似物。双特异性抗体或双功能抗 体是具有两个不同的重/轻链对和两个不同结合位点的人工杂交抗体。（参见，例 如，Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Tmmunol. , 79:315-321 (1990) ；Kostelny et al.,J. Tmmunol. , 148:1547-53(1992)) 〇
[0034] 术语"抗体"包括抗体本身（裸抗体）或与细胞毒性药物或细胞抑制性药物共轭 的（conjugated)抗体。
[0035] 术语"抗原表位"是指位于抗原上的能与抗体结合的位点。抗原表位可由一个或多 个蛋白三级折叠的并列的连续的氨基酸或不连续的氨基酸形成。由连续氨基酸形成的抗原 表位通常暴露于变性剂后不受影响，而由三级折叠形成的抗原表位通常经变性剂处理后消 失。抗原表位的独特空间构象中通常包括至少为3个，更通常为5个或8-10个氨基酸。抗原 表位的空间构象的测定方法包括，例如，X-射线结晶学和二维核磁共振，参见，例如Ep i tope Mapping Protocols,in Methods in Molecular Biology, Vol. 66,Glenn E. Morris,Ed. (1996)〇
[0036] 识别相同或重叠抗原表位的抗体可被简单的免疫分析法鉴定，该免疫分析法显示 一个抗体相对于另一个抗体竞争结合靶抗原的能力。抗体的对应抗原表位也可以是确定的 结合于抗原的抗体的X-射线晶体学（以鉴定接触残基）。或者，如果可减少或消除一种抗 体结合的抗原所有氨基酸突变类型也可减少或消除另一种抗体的结合，则这两种抗体具有 相同的抗原表位。如果可减少或消除一种抗体结合的抗原某些氨基酸突变类型也可减少或 消除另一种抗体的结合，则这两种抗体具有重叠的抗原表位。抗体间的竞争由试验分析来 确定，其中被测的抗体抑制参照抗体与共有抗原的特异结合（见，如Junghans等，Cancer Res. 50:1495, 1990)。在竞争性结合试验分析中，若过量的被测试抗体（例如，至少2x、5x、 10x、20x或IOOx)抑制至少50 %，但优选为75 %、90 %或99 %参照抗体的结合，则被测试抗 体与参照抗体竞争。由竞争法确定的抗体（竞争性抗体）包括与参照抗体具有相同结合抗 原表位的抗体，及与毗邻抗原表位（由于空间位阻发生，该毗邻抗原表位充分接近与参照 抗体结合的抗原表位）结合的抗体。与h2H12竞争以结合人CD33蛋白的抗体包括在本公 开中。
[0037] A2H12抗体是一种与人⑶33蛋白特异性结合的抗体，并且包括三个重链互补性决 定区（hCDRs):重链CDR1，例如SEQ ID NO: 19或实质上与SEQ ID NO: 19-致的序列；重链 CDR2,例如SEQ ID NO: 20或实质上与SEQ ID NO: 20-致的序列，和重链CDR3,例如SEQ ID N0:21或实质上与SEQ ID N0:21-致的序列；所述抗体还包括三个轻链⑶Rs:轻链⑶R1， 例如SEQ ID NO:22或实质上与SEQ ID NO:22-致的序列；轻链CDR2,例如SEQ ID NO:23 或实质上与SEQ ID N0:23-致的序列；和轻链CDR3,例如SEQ ID N0:24或实质上与SEQ 10勵:24-致的序列。2!112抗体包括鼠科动物2!112(1112!112)抗体和衍生自鼠科2!112抗体 的嵌合或人源化抗体。
[0038] 术语"患者"包括接受预防或治疗处理的人类和其他哺乳动物测试体。
[0039] 为了对氨基酸替换的保守性和非保守性进行分类，氨基酸分组如下：组I (疏水性 侧链）：甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸亮，氨酸、异亮氨酸；组II (中性亲水性侧链）：半胱氨酸、 丝氨酸、苏氨酸；组ΠΙ(酸性侧链）：天冬氨酸、谷氨酸；组IV(基本侧链）：天冬酰胺、谷氨 酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸；组V(影响链定位的残基）：甘氨酸、脯氨酸；组VI (芳香侧 链）：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。保守的替换涉及同一类氨基酸之间的替换，非保守替换由 以下情况构成，即一类氨基酸的成员被另一类氨基酸的成员替换。
[0040] 序列一致性百分率根据Kabat编号法则对抗体序列进行最大比对。如果受试抗体 区域（如一条轻链或一条重链的完整的成熟可变区）与一个参照抗体的相同序列比对，比 对后，受试抗体与参照抗体相同序列百分率为受试抗体与参照抗体中占据相同位置的氨基 酸数量除以两个区域的比对位置的总数，缺口不算在内，乘以100以转换成百分率。
[0041] "包括"一个或多个例举元素的组合物或方法还囊括其它没有特别例