使用notch途径抑制剂治疗癌症的方法

专利名称：使用notch途径抑制剂治疗癌症的方法
使用NOTCH途径抑制剂治疗癌症的方法发明背景 发明领域本发明总体上涉及癌症，更具体地，涉及影响Notch途径的试剂。发明背景 Notch基因编码进化上保守的、大的、单次跨膜蛋白，该蛋白调节细胞命运决定。在 果蝇属(Drosophila)、线虫(Caenorhabditis elegans)和哺乳动物细胞培养的工作中显 示，Notch通过2个下游途径担任DSL( δ、Serrate, Lag-2)家族配体的受体和信号。一个 下游途径是通过转录因子CSL(CBF1、Hairless的抑制子、Lag-I)家族，另一个是通过胞浆 衔接蛋白Deltex。在哺乳动物中，Notch信号转导途径诱导4个受体(Notch 1-4)和5个 配体(δ-样1、3和4&Jagged 1和2)。在这些基因中的突变导致人类的显著的发育影响， 提示Notch信号转导存在于多种遗传性疾病(例如带有皮质下梗死和白质脑病的脑常染色 体显性动脉病(CADASIL)、Alagille综合征和脊椎肋骨发育不全(SOTO))和癌症(例如白 血病、皮肤癌、宫颈癌、肺癌、前列腺癌、神经母细胞瘤和乳腺癌)中。Notch信号转导的负调控物包括Numb、SEL-IO和Su (dx)。相比之下，Sanpodo, Neuralized, Mind bomb、LNX、Siahl 和 Mdm2 是 Notch 信号转导途径的正调节物。Numb 是 含有PTB结构域的胞浆衔接蛋白，它通过与胞内结构域的相互作用担任Notch的负调节物。 Numb-Notch联合促进Notchl的泛素化。研究表明，Numb与E3连接酶Itch的细胞溶质的 HECT结构域相互作用，以及Numb和Itch协同作用促进Notchl的泛素化。另一方面，Numb 可通过改变Sanpodo的功能来抑制Notch信号转导，Sanpodo是途径的正调节物。Sandopo 编码4次跨膜蛋白，它与细胞表面上的全长Notch受体物理上相互作用。Numb与Sanpodo 物理上相互作用，抑制Sanpodo的膜定位，从而阻止其与Notch联合。哺乳动物的肌动蛋白 相关蛋白原肌球调节蛋白控制肌动蛋白丝的长度，它是Sanpodo的同源物。Numb和Sanpodo 是发育过程中Notch途径的关键调节物。Deltex(Su(dx))的抑制物是另一个最初在果蝇属中鉴定的蛋白，它担任Notch信 号转导途径的负调节物。Su(dx)的过表达能阻断内源性Notch信号转导，导致异位的静脉 分化，失去翼边缘。相比之下，Su(dx)的下调显示翼的静脉缝隙与Notch过表达的表型相 似。Itch是Su(dx)的小鼠同源物，之所以这样命名，是因为小鼠突变体显示出随同免疫缺 陷一起的瘙痒行为。与SEL-IO不同，Itch含有磷脂结合基序，基序将Itch对准胞浆膜，4 个Wff基序和HECT结构域，其起到E3泛素连接酶的作用。Itch通过其Wff基序结合到NI⑶ 的N-末端部分，并通过其HECT结构域促进OTCD泛素化。在哺乳动物细胞中，这种相互作 用下调Notch信号转导。Notch信号转导途径可在乳腺的肿瘤发展中发挥作用的首次指征来自Czech II 小鼠中小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)Notch4基因的共有插入位点。这种插入导致截短的转录 物的表达，该转录物编码Notch4的细胞内结构域，该蛋白的表达活化信号转导途径。特异 地在乳腺中表达该蛋白的转基因小鼠显示了 Notch信号转导在肿瘤发展中的因果作用。这些转基因小鼠在12个月内发生了乳腺肿瘤。而且，细胞培养实验显示Notchl或Notch4胞 内结构域的过表达转化小鼠乳房上皮细胞系，从而导致软琼脂中无贴壁依赖的生长。Notch信号转导在宽范围的人乳腺癌中被异常地活化。这通过Numb的丧失和 Notchl胞内结构域(Ni⑶)的积聚以及靶基因Hesl和Heyl的上调最清楚地得到了证明， NI⑶由在Notch信号转导期间全长蛋白的切割产生并转换Notch信号。而且，途径成分的 改变可证明是有用的预兆标记物。例如，Notchl和配体Jaggedl的升高的转录水平与不良 预后相关，Numb的蛋白体降解主要在高等级的肿瘤中见到。最后，由于抑制Notch信号转 导途径可逆转乳腺癌细胞系转化的表型，阻止原发肿瘤细胞的生长，所以Notch信号转导 的增加在乳腺癌的病因学中发挥重要的作用。尽管改变的Notch信号转导与包括癌症在内的人类疾病相关，但是尚未发现 Notch实质上参与人类肿瘤的证据。在机制上，Numb起到肿瘤抑制因子的作用，因为它在 Numb-阴性肿瘤而非Numb-阳性肿瘤细胞中的异位表达抑制增殖。在Numb-阴性的肿瘤中 观察到增加的Notch信号转导，但是在实施Numb的表达后，Notch信号恢复到基态水平。 相反地，Numb沉默增加正常的乳腺细胞和Numb-阳性乳腺肿瘤中Notch信号转导。Numb/ Notch的生物学拮抗作用与正常的乳腺实质的稳态相关。因此，就需要一种诊断和治疗由 Notch途径的异常信号转导引起的癌症的方法。
发明摘要本发明基于有创意的发现，即一些人类乳腺癌包含Notch途径的上调。特别地，这 些癌症特征在于具有增加的Notch信号转导和降低的Numb表达，Numb为Notch途径的负 调节物。 在一个实施方式中，本发明提供一种治疗癌症的方法，包括用图3A或3B中显示的 构建物接触癌细胞。本发明的方法还包括用化学治疗剂接触癌细胞。在另一个实施方式中，本发明提供一种测定癌细胞对Notch途径抑制剂的治疗是 否有反应的方法，该方法包括测定细胞中Notch 1的水平，其中，与正常细胞中的Notch 1 水平相比，Notch 1的较高水平表示细胞对Notch途径抑制剂的治疗有反应。图3A或3B显 示了例证性的Notch途径抑制剂。一方面，该方法包括进一步地测定细胞中Numb表达的水平，其中，与正常细胞中 的Numb水平相比，Numb表达的低水平表示细胞对Notch途径抑制剂或增加细胞中Numb表 达的药剂的治疗有反应。本发明还提供图3A和图3B所示的特异的构建物。在另一个实施方式中，本发明提供一种治疗癌症的方法，包括用含有显性负性 Mastermind同种型的构建物接触癌细胞。一方面，癌症是例如乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前 列腺癌、肺癌、血癌或胰腺癌。在一个另外的实施方式中，还可以用化学治疗剂接触癌细胞。 在另一个实施方式中，可以用触角核酸或蛋白接触细胞。(触角同源结构域是来自黑腹果蝇 生物体的序列特异的转录因子。该蛋白由触角(antp)基因编码。Antp是调节系统的成员， 它在生物体的前-后轴上给予细胞特异性位置。这样，Antp辅助果蝇属中胸节段的细胞发 育的控制。)(参见例子 Y.-Q. Qian 等，The Structure ofthe Antennapedia Homeodomain Determined by NMR Spectroscopy in Solution !Comparison With ProkaryoticRepressors, Cell 59:573(1989))。在另一个实施方式中，本发明提供治疗癌症的方法，包括用含有Numb同种型的构 建物接触癌细胞。在一个另外的实施方式中，还可以用化学治疗剂接触癌细胞。在另一个 实施方式中，可以用触角核酸或蛋白接触细胞。在一个实施方式中，描述了测定癌细胞对Notch途径抑制剂的治疗是否有反应的 方法，该方法包括测定细胞中Notch 1的水平，其中，与正常细胞中的Notch 1水平相比， Notch 1的较高水平表示细胞对Notch途径抑制剂的治疗有反应。一方面，Notch途径抑制 剂包括显性负性Mastermind同种型。在另一个实施方式中，Notch途径抑制剂包括Numb 同种型。在另一个实施方式中，该方法包括测定细胞中Numb表达的水平，其中，与正常细胞 中的Numb水平相比，Numb表达的低水平表示细胞对Notch途径抑制剂的治疗有细胞反应。 在一个另外的实施方式中，癌细胞是乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞或胰腺癌细胞。在本发明的另一个实施方式中，描述了监测治疗患有癌症或濒临患有癌症危险的 受试者的治疗计划的方法，该方法包括测定一个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的 活性或表达。一方面，涉及Notch信号转导途径的基因选自Jaggedl、Jagged2 S -样4、E_钙 粘着蛋白、Numb、NICD Notch 3、Heyl、Hes5 或其组合。在一个实施方式中，描述了诊断患有癌症或濒临患有癌症危险的受试者的方法， 该方法包括测定一个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的活性或表达，其中，与正常 细胞的水平相比，一个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的活性或表达的改变被诊断 为受试者患有癌症或濒临患有癌症的危险。在另一个实施方式中，涉及该Notch途径的基 因选自 Jaggedl、Jagged2 S -样 4、E_ 钙粘着蛋白、Numb、NICD Notch3、Heyl、Hes5 或其组
口 O在本发明的另一个实施方式中，描述了鉴定试剂的方法，该试剂调节一个或多个 涉及Notch信号转导途径的基因的活性或表达，该方法包括将测试试剂与显示表达一个或 多个涉及Notch信号转导途径的基因的细胞相接触，并检测一个或多个涉及Notch信号转 导途径的基因的活性或表达的变化，由此鉴定这种测试试剂为调节一个或多个涉及Notch 信号转导途径的基因的活性或表达的试剂。在一个实施方式中，涉及Notch信号转导途径 的基因选自 Jaggedl、Jagged2 S -样 4、E-钙粘着蛋白、Numb、NICD Notch 3、Heyl、Hes5 或 其组合。在另一个实施方式中，细胞是癌细胞。一方面，癌细胞是乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、 结肠癌细胞或胰腺癌细胞。在一个实施方式中，试剂是化合物、蛋白质或核酸。在一个实施方式中，描述了将化合物递送给细胞的方法，该方法包括将融合至触 角或其功能部分的化合物接触细胞。一方面，化合物是化学品、蛋白质或核酸，触角足是核 酸或氨基酸序列。


图1A是果蝇属Notch受体和4个已知哺乳动物受体的图示。图1B描述了果蝇属和哺乳动物Notch受体的跨膜DSL配体(Delta、Serrate、LAG 2)。图1C是哺乳动物F3和接触蛋白配体的示意结构。图1D是CBF1依赖的Notch信号转导途径的示意图。
图2A是描述MCF7细胞在软琼脂中形成的集落的数量的条形图，MCF7细胞为来自 亲本、载体对照和MCF7/Numb转染的细胞。图2B是描述MCF7细胞在软琼脂中形成的集落的数量的条形图，MCF7细胞为来自 亲本、载体对照和MDA-MB231/Numb转染的细胞。图 3A 说明 pSecTagNC/ANTP/NUMB(SEQ ID NO. :1)。图 3B 说明 pSecTagNC/ANTP/DN-MAML(SEQ ID NO. :2)。图4是描述用ANTP/DN-MAML融合蛋白治疗的动物的肿瘤体积(4A)和用ANTP/ DN-MAML融合蛋白治疗后的动物存活(4B)的条形图。详细描述本发明基于Notch信号转导途径与癌症相关的发现。调节Notch信号转导途径中 的蛋白的表达和/或活性能用于诊断和治疗受试者的癌症。果蝇属Notch受体是大的、含有2703个氨基酸(aa)的单次跨膜的糖蛋白，它含有 几个不同的结构域(图1A)。Notch蛋白以异二聚体表达在细胞表面上，该异二聚体由非共 价地与胞内结构域连接的大的胞外结构域组成。胞外结构域由36个串联的表皮生长因子 (EGF)样的重复序列(每个大约38个aa)和3个富含半胱氨酸的Lmi2/Notch (LNR)重复序 列组成。Notch胞内结构域含有结合CSL转录因子的RAM23结构域；2个核定位序列(NLS1 和2)；蛋白-蛋白相互作用必需的7个串联⑶ClO/锚蛋白(ANK)重复序列；Notch细胞因 子反应(NCR)区、转录活化结构域(TAD) ^PPEST (SEQ ID NO 7)(脯氨酸(P)、谷氨酰胺(E)、 丝氨酸(S)、苏氨酸(T))序列。PEST序列是以快速降解的蛋白为特点的。有4个已知的哺乳动物Notch受体(Notch 1-4)(图1A)。哺乳动物Notch 1和 Notch 2含有36个EGF样重复序列，而Notch 3和Notch 4分别含有34个和29个EGF样 重复序列。所有4个哺乳动物Notch受体都含有RAM、NLSl、ANK和PEST结构域。但是，只 在Notch 1和Notch 2中发现TAD，Notch 4缺少NLS2和NCR基序。Notch受体之间的最高 度同源性在锚蛋白重复序列内，而最高度的多样性在C末端PEST系列内。哺乳动物Notch 1和Notch2蛋白被弗林样转化酶在转运高尔基氏体(残基1655)内切割(也被称为SI切 割)；Notch 3和Notch 4可被同样地切割。长的胞外结构域通过非共价的Ca2+依赖的相互 作用结合到跨膜结构域。异二聚体是细胞表面受体的主要形式。现已表明，EGF样重复序 列11和12对Notch DSL配体与Notch相互作用是必需的(图1A)。在果蝇属，Delta和Serrate是Notch受体的主要配体。同Notch —样，这些蛋白 是大的单次跨膜蛋白，在其胞外结构域内有数量不等的EGF样重复序列。Delta和Serrate 分别含有9个和17个EGF样重复序列。它们通过在N-末端的称作DSL (Delta、Serrate, (果蝇属)Lag_2(线虫(C.elegans))区域的保守的富含半胱氨酸的结构域与Notch相互作 用。除了这些基序，Serrate在EGF样重复序列和区分于Delta的跨膜结构域之间含有第三 个富含半胱氨酸(CR)的结构域。在哺乳动物中有5个Delta和Serrate同源物，Jaggedl 和2以及Delta-样1、3和4(图1B)。与Notch大的胞内结构域相比，DSL配体具有很短的 胞内结构域。最近显示，F3/接触蛋白和F3/接触蛋白家族的成员NB_3在小鼠少突胶质细胞成 熟过程中充当另外的Notch配体(图1C)。F3是属于免疫球蛋白家族的糖基-磷脂酰肌醇 (GPI)连接的神经粘附分子。F3和接触蛋白属于一组含有N末端信号肽、连接至4个纤连蛋白III型重复序列的6个免疫球蛋白结构域和GPI锚定结构域的糖蛋白。与F3相比，接触 蛋白具有另外的跨膜和短的胞浆结构域。已经显示，F3和NB-3在小鼠Notchl受体的EGF 样重复序列1-12和22-34内结合。 Notch受体在高尔基体中被弗林转化酶切割，(称作Sl切割的过程)，这导致了细 胞表面非共价连接的异二聚体Notch受体的表达(图1D)。在缺少Notch配体的相互作用 时，Numb直接与Notch的胞浆结构域相互作用，抑制其切割。在这些条件下，CSL结合至少 4个辅阻遏物(SMRT、HDAC、SKIP和kyoT2)并抑制转录。随着配体结合，发生2次连续的切 害I]。一次称作S2切割，由ADAM蛋白酶TACE(肿瘤坏死因子α -转化酶)介导，发生在靠近 跨膜结构域的1771aa处，另一次切割称作S3切割，由Y -分泌酶在跨膜结构域内1744aa处 介导。这个S3切割释放Notch的胞内结构域(Ni⑶)，允许其核转位，并在核内结合CBFl， 通过置换4个辅阻遏物将其由转录抑制因子转化成转录激活因子。与Mastermind(MAM)、 NI⑶和CBFl —起形成一个大的转录激活复合体，招募辅激活因子诸如p300。活化的CBFl 然后能够转录其靶基因，靶基因包括发状分裂相关增强子(Hairy of enhancer of split, Hes)和Hey家族的成员。其它的靶诸如p21 (角质形成细胞的靶点)是组织特异的。Numb 的稳定性是由E3连接酶诸如Mdm2、LNX和Shia调节的。在哺乳动物中，Notch信号转导引起OTCD的切割，接着易位到细胞核并结合 CBFl (也称作RBP-Jk)转录因子。这是Notch信号转导途径的初级的核效应物，而且这是双 功能的。缺少NI⑶时，CBFl结合至少4个辅阻遏物，视网膜和甲状腺激素受体的沉默介质 (SMRT)、组蛋白去乙酰化酶(HDACl)、KyoT2和Ski相互作用蛋白(SKIP)，并抑制转录(图 1D)。相比之下，CBFl与NI⑶的RAM23和ANK重复序列的相互作用置换这些抑制因子，产 生转录激活因子复合体。核蛋白Mastermind样(MAML)也与这个复合体相互作用，进一步 增加转录(图1D)。但是，MAMLl的显性负性(DN)形式由MAML末端的一个具有62个氨基 酸的肽组成，它特异地结合到CBF1/NI⑶转录复合体上，通过所有4个哺乳动物Notch受体 抑制Notch信号转导的活化。在哺乳动物中，Notch和其DSL配体之间的相互作用包括Notch细胞外部分的EGF 样重复序列11和12 (图1D)。配体/受体相互作用引起Notch蛋白内2次另外的蛋白酶 切割，从细胞膜释放NICD ；第一次切割发生在Sl位点Notch的成熟过程中。在细胞表面， 通过TNF-α转化酶(TACE)和ADAM17金属蛋白酶的蛋白酶切割(也称为S2切割)发生 在胞外(残基1711)，产生膜束缚片段(NEXT)。这是瞬时中间体，它通过Y-分泌酶(它 含有早老蛋白和呆蛋白)再次切割(S3切割)。这发生在跨膜结构域内(残基1744)，并引 起NICD释放到胞浆中。OTCD含有2个将其靶向细胞核的NLS结构域。在细胞核中，OTCD 的RAM和ANK结构域结合CBF1，与MAM联合将CBFl由转录抑制因子转化成转录激活因子。 NI⑶/CBF1/MAM复合体上调Notch信号转导的初级靶基因的表达，这些靶基因包括基本的 螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子诸如split 1和5的发状分裂相关增强子(Hesl和5)和 Hes相关转录因子1-3 (HRT1-3,也称作Heyl-3)。所有的Hes成员共享C-末端YRPW(SEQ ID NO 6)四肽基序，该基序招募转录辅阻 遏物诸如Groucho，起到转录抑制物的作用。途径的其它靶标是组织特异的，诸如p21和心 血管螺旋-环-螺旋因子1和2 (CHF1-2)，它们分别表达在角质形成细胞和心血管发育中。 除了活化Notch信号转导，包括Numb和E3泛素连接酶SEL-IO和Itch在内的多个蛋白能通过促进Notch分子的泛素化和溶酶体降解终止Notch信号转导。也已发现，CBF1和Notch 的锚蛋白重复序列或单纯疱疹病毒(HSV)VP16的转录活性结构域之间的融合产生CBF1的 组成型活性形式。4 个哺乳动物 Notch 受体(Notch 1-4)和 5 个配体(Jaggedl 和 _2 ； S -样 1、-3、 和-4)都含有跨膜结构域，这样在邻近细胞之间产生配体/受体信号转导。配体-受体 的结合触发、分泌酶依赖的切割，释放Notch的胞内结构域到细胞核，促进与转录因子 CBF-1(也称作RBP-Jk或CSL)的联合。随后的辅激活物、mastermind样(MAML)蛋白的招募 促进下游效应物诸如转录因子的发状分裂相关增强子(HES)和HES-相关阻遏蛋白(HERP) 家族的转录激活。在描述本发明的组合物和方法之前，应当理解的是本发明并不限于描述的特定的 组合物、方法和实验条件，因为这样的组合物、方法和条件可以改变。还应当理解的是，这里 用到的术语只为描述特定的实施方式，而非意图是限制性的，因为本发明的范围只由所附 的权利要求限定。如本说明书和所附权利要求所用，除非上下文明确指明，否则单数形式“一(a)”、 “一(an)”、“所述(the)”包括复数的指示物。因此，例如，提及“所述方法”包括一个或更多 的方法，和/或这里描述的类型的步骤，当阅读本公开时，这对本领域技术人员是显而易见 的。除非另有定义的，否则这里用到的所有技术和科学术语具有同本发明所属领域的 普通技术人员通常理解的相同意义。尽管与这里描述的方法和材料相似或等同的任何方法 和材料能用于实施或测试本发明，但是现在描述的是优选的方法和材料。在此所用的术语“受试者”是指对其实施受试方法的任何个体或患者。虽然如本 领域技术人员所理解的，受试者可以是动物，但是通常受试者是人。这样，其它的动物，包括 哺乳动物诸如啮齿类动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔子、包括牛、马、山羊、 绵羊、猪等在内的农场动物和灵长类动物(包括猴子、黑猩猩、类人猿和大猩猩)也包括在 受试者的定义中。在此所用的“正常的细胞”或“正常的样品”是指来自受试者的细胞或样品，它们 与检测的细胞都来自同一器官并且细胞类型相同。一方面，相应的正常细胞包括从健康个 体——未患癌症——获得的细胞样品。这样的相应的正常细胞可以但不必来自与提供检测 的细胞的个体年龄相一致和/或性别相同的个体。在此所用的术语“样品，，和“生物样品，，是指适合本发明提供的方法的任何样品。 细胞样品可以是任何样品，包括，例如从患有肿瘤的受试者的活组织检查获得的肿瘤样品 或手术(例如去除和/或消胀肿瘤的手术操作)获得的肿瘤样品。这样，在一个实施方式 中，本发明的生物样品是组织样品，例如活检标本诸如针吸活组织检查的样品。例如，样品 可包括血样、尿样、组织样品或任何生物学流体。术语“细胞增殖性疾病”或“细胞的增殖性疾病”是指受影响的细胞的增殖能力与 未受影响的细胞的正常增殖能力不同的任何疾病。一个细胞增殖性疾病的例子是瘤形成。 恶性细胞(例如癌症)的形成是多步骤过程的结果。术语“恶性”可以指不再处于正常细 胞生长控制下的肿瘤或造血系统疾病。在此所提到的术语“癌细胞”包括被在此所提到的任何一个癌性状况困扰的细胞。术语“癌”是指由趋于侵入周围组织并引起转移的上皮细胞构成的恶性新生长。在此所描述的细胞增殖性疾病可以是赘生物(瘤)。这种赘生物是良性或恶性的。 术语“赘生物”是指细胞的新的、异常生长或较正常细胞增殖快的异常细胞的生长。赘生物 产生无结构的肿块(肿瘤)，该肿块(肿瘤)可能是良性或恶性的。术语“良性的”是指肿 瘤是非癌性的，例如它的细胞不增殖或侵入周围组织。术语“递送”或“给予”被定义为包括将本发明的化合物或药物组合物提供给需要 治疗的受试者的行为。这些术语包括肠道和局部给药，通常通过注射，包括但不限于静脉内 的、肌肉的、动脉内的、鞘内的、囊内的、眶内的、心内的、真皮内的、腹膜内的、经气管的、皮 下的、表皮下的、关节内的、囊下的、蛛网膜下腔的、椎管内的和胸骨内的注射和输注。这里用到的术语“蛋白质”是指至少2个共价结合的氨基酸，包括蛋白质、多肽、寡 肽和肽。蛋白质可由天然存在的氨基酸和肽键或合成的肽模拟结构构成。因此，这里所用 的“氨基酸”或“肽残基”是天然存在的和合成的氨基酸。例如，为了本发明的目的，同型苯 丙氨酸、瓜氨酸和正亮氨酸被认为是氨基酸。“氨基酸”还包括亚氨基酸残基诸如脯氨酸和 羟脯氨酸。侧链可以是(R)或⑶构型。术语“融合蛋白”是指与另一个分子或化合物融合的蛋白。分子或化合物可以是 蛋白、化学品或核酸。这里使用的术语“核酸”指DNA、RNA、单链、双链或三链及其任何化学修饰。实 际上核酸的任何修饰都被考虑。“核酸”可以是几乎任何长度，长度从10、20、30、40、 50、60、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400、500、600、700、800、900、1000、 1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10，000、15，000、 20，000,30, 000,40,000,50,000,75,000,100,000,150,000,200,000,500,000,1,000，000、 1，500, 000,2, 000, 000,5, 000, 000或甚至更多的碱基，直到全长的染色体DNA分子。对于分 析基因的表达的方法，从样品中分离的核酸典型地是RNA。本发明基于有创意的发现，即一些癌症显示Notch途径中的基因表达的异常水 平。例如，这些癌症都具有升高水平的Notch和降低水平的Numb，Numb是Notch途径的负 调节物。本发明提供一种治疗癌症的方法，该方法包括用融合蛋白诸如，例如图3A或3B显 示的构建物接触癌细胞。本发明的方法进一步包括用化学治疗剂接触癌细胞。可以用任何方式给予药剂，典型的是用于治疗特定类型癌症的药剂或在促进药剂 与靶肿瘤细胞接触的条件下，并且如果适当的话，进入细胞。多核苷酸药剂进入细胞，例如， 可通过将多核苷酸整合到能感染细胞的病毒载体中得以促进。如果不能得到对细胞类型特 异的病毒载体，可将载体进行修饰，使其表达对靶细胞上表达的配体(或受体)特异的受 体(或配体)，或可将载体包入到脂质体中，该脂质体也可被修饰成包括这样的配体(或受 体)。可用多种方法将肽药剂引入到细胞中，包括，例如通过对肽进行工程改造，使其含有蛋 白转导结构域诸如人免疫缺陷病毒TAT蛋白转导结构域，这能促进肽易位到细胞中。一般 地，将药剂配制成适于给予受试者的组合物(例如药物组合物)。如此配制的药剂作为治疗 遭受黑素瘤或非黑素瘤皮肤癌痛苦的受试者的药物是有用的。因此，根据正被治疗的癌症 的类型，鉴定的药剂将具有组织特异性的反应。候选药剂包括数目众多的化学类别，尽管典型地它们是有机分子，而且常常是分子量大于100小于约2500道尔顿的小的有机化合物(即小分子)。候选药剂包括与蛋白质发生结构相互作用必需的官能团，特别是氢键合，而且典型地包括至少一个胺、羰基、羟基 或羧基基团，优选至少2个官能化学基团。候选药剂经常包括环状碳或杂环结构和/或芳 香或多芳香结构，它们被一个或多个上面提到的官能团取代。也在包括肽、糖类、脂肪酸类、 类固醇类、嘌呤类、嘧啶类、衍生物、结构类似物或其组合在内的生物分子中找到候选药剂。可从包括合成的或天然的化合物库的品种多样的来源获得候选药剂。例如，可用 很多种方法随机和定向地合成品种多样的有机化合物和生物分子，包括随机的寡核苷酸的 表达。可选地，已获得或容易地产生了以细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物 的库。此外，通过常规的化学、物理和生物学方法容易地修饰天然或合成产生的库和化合 物。已知的药理学药剂可经受定向的或随机的化学修饰，诸如酰化作用、烷化作用、酯化作 用、酰氨化作用来产生结构类似物。在另一个实施方式中，本发明提供一种测定癌细胞对Notch途径抑制剂的治疗是 否有反应的方法，该方法包括测定细胞中Notch 1的水平，其中，与正常细胞中的Notch 1 水平相比，Notch 1的较高水平预示着细胞对Notch途径抑制剂的治疗有反应。图3A或3B 显示了例证性的Notch途径抑制剂。术语“抑制剂”、“激活剂”和“调节剂”用来指激活、抑制或调节分子。抑制剂是例 如结合、部分或全部阻断活性、降低、阻止、延迟活化、灭活、减敏或下调Notch信号转导途 径的一个或多个基因的活性或表达的化合物。“激活剂”是增加、打开、活化、促进、增强活 化、敏化、激动或上调Notch信号转导途径的一个或多个基因的化合物。抑制剂、激活剂或 调节剂也包括Notch信号转导途径的一个或多个基因的遗传上的修饰版本，例如活性改变 的版本、以及天然存在和合成的配体、底物、拮抗剂、激动剂、抗体、肽、环肽类、核酸、反义分 子、核酶、RNAi、小的化学分子等等。抑制剂可以是例如图3A和3B以及4A和4B显示的融 合蛋白ο在一个实施方式中，本发明的方法包括进一步地测定细胞中Numb表达的水平，其 中，与正常细胞中的Numb水平相比，Numb表达的低水平预示着细胞对Notch途径抑制剂的 治疗有反应。这里使用的术语“改善”或“治疗”是由于执行的作用而使与癌症相关的临床体 征和/或症状被减轻。被监测的体征或症状是特定的癌症的特征，熟练的临床医生对这些 体征或症状及监测体征和病症的方法都非常了解。例如，熟练的临床医生知道可用典型地 用于特定肿瘤的诊断成像方法监测肿瘤的大小或生长速率(例如用超声或核磁共振成像 (MRI)来监测肿瘤)。治疗癌症的所有方法可进一步包括将药剂与药学上可接受的载体缔合的步骤，药 学上可接受的载体构成一种或多种辅助成分。可用于配制给予受试者的药剂的药学上可接 受的载体是本领域熟知的，这些载体包括例如水溶液诸如水或生理缓冲盐水或其他溶剂或 运载体诸如二醇类、甘油、油类诸如橄榄油或可注射的有机酯。药学上可接受的载体可含有 生理学可接受的化合物，它们起例如，稳定和增加结合物的吸收的作用。这些生理学可接受 的化合物包括，例如碳水化合物诸如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖、抗氧化剂诸如抗坏血酸或谷胱 甘肽、螯合剂、低分子量蛋白质或其它的稳定剂或赋形剂。本领域的技术人员知道，根据例 如治疗剂的物理化学特性和组合物的给药途径选择包括生理学可接受的化合物在内的药学上可接受的载体，给药途径可以是例如经口的或胃肠外的诸如静脉内的，通过注射、插管 或本领域人员知道的其它类似方法。药学组合物也可含有第二(或更多的)化合物(一种 或多种)诸如诊断试剂、营养物质、毒素或治疗剂，例如癌症化疗剂和/或维生素(一种或 多种)。含有本发明的药剂的组合物的给药途径将部分地取决于分子的化学结构。例如， 当经口给予多肽和多核苷酸时，它们不是特别有用，因为它们能在消化道被降解。但是，化 学修饰多核苷酸和多肽例如以使它们分别对内源性核酸酶或蛋白酶的降解变得不敏感或 通过消化道更加可吸收的方法是本领域熟知的(参见，例如，Blondelle等，Trends Anal. Chem. 14 :83_92，1995 ；Ecker 和 Crook, BioTechnology, 13 :351_360，1995)。例如，肽试剂 可用D-氨基酸制备，或者可含有一个或多个基于肽模拟物的结构域——肽模拟物是模拟肽 结构域结构的有机分子；或者基于拟肽诸如插烯物拟肽的结构域。抑制剂是小的有机分子 诸如留体生物碱时，它能以在身体内期望的位置释放活性剂的形式给药，或通过注射到血 管中给药，这样抑制剂循环到靶细胞。实施本发明的方法时，给予的化合物或组合物的总量可以以单次剂量给予受试 者，或作为大丸药(bolus)或通过输注在相对短的时间段里给药，或可以使用分次的治疗 方案给药，其中在延长的时间段里给予多次剂量。本领域技术人员将知道，调节Notch信号 转导途径中的一个或多个基因的活性或表达以治疗受试者癌症的药剂的量取决于许多因 素，包括受试者的年龄和一般健康情况及给药途径和给予的治疗的数目。考虑到这些因素， 技术人员将按需要调节特定的剂量。一般而言，最初，用I期或II期临床试验确定药物组 合物的配制和给药途径和给药频率。本发明提供一种治疗癌症的方法，包括用含有显性负性Mastermind同种型的构 建物接触癌细胞。癌细胞可以是例如乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞或胰腺癌细胞。 还可用化学治疗剂接触癌细胞。此外，可用触角足(Antermapedia，ANTP)接触细胞。ANTP同源域是来自黑腹果蝇有机体的序列特异的转录因子。该蛋白由触角 (antp)基因编码。Antp是调节系统的成员，它在有机体的前-后轴上给细胞特异的位置。 这样，Antp辅助果蝇属中胸节段的细胞发育的控制。本发明还提供治疗癌症的方法，包括用含有Numb同种型的构建物接触癌细胞。癌 细胞可以是例如乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞或胰腺癌细胞。还可用化学治疗剂接 触癌细胞。此外，可用触角足(ANTP)接触细胞。在一个实施方式中，描述了测定癌细胞对Notch途径抑制剂的治疗是否有反应的 方法，该方法包括测定细胞中Notch 1的水平，其中，与正常细胞中的Notch 1水平相比， Notch 1的较高水平预示着细胞对Notch途径抑制剂的治疗有反应。Notch途径抑制剂可 以是例如显性负性Mastermind同种型或Numb同种型。在另一个实施方式中，该方法包括 测定细胞中Numb表达的水平，其中，与正常细胞中的Numb水平相比，Numb表达的低水平预 示着细胞对Notch途径抑制剂的治疗有细胞反应。癌细胞可以是例如乳腺癌细胞、卵巢癌 细胞、结肠癌细胞或胰腺癌细胞。在本发明的另一个实施方式中，描述了监测治疗患有癌症或濒临患有癌症危险的 受试者的治疗计划的方法，该方法包括测定一个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的 活性或表达。涉及Notch信号转导途径的基因可以是例如Jaggedl、Jagged2 6 -样4、E_钙粘着蛋白、Numb、NICD Notch 3、Heyl 或 Hes5。在一个实施方式中，描述了诊断患有癌症或濒临患有癌症危险的受试者的方法， 该方法包括测定一个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的活性或表达，其中，与正常 细胞相比，一个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的活性或表达的改变诊断出患有癌 症或濒临患有癌症危险的受试者。涉及Notch信号转导途径的基因可以是例如Jaggedl、 Jagged2 S -样 4、E-钙粘着蛋白、Numb、NICD Notch 3、Heyl 或 Hes5。在本发明的另一个实施方式中，描述了鉴定一种试剂的方法，该试剂调节一个或 多个涉及Notch信号转导途径的基因的活性或表达，该方法包括将测试试剂与显示表达一 个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的细胞相接触，检测一个或多个涉及Notch信号 转导途径的基因的活性或表达的变化，由此鉴定这种测试试剂是否是调节一个或多个涉 及Notch信号转导途径的基因的活性或表达的试剂。涉及Notch途径的基因可以是例如 Jaggedl、Jagged2 S-样 4、E-钙粘着蛋白、Numb、NICD Notch 3、Heyl 或 Hes5。细胞可以 是癌细胞，且可以是例如乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞或胰腺癌细胞。试剂可以是 例如化学化合物、蛋白质或核酸。本发明包括将化合物递送给细胞的方法，该方法包括将融合至触角足或其功能部 分的化合物接触细胞。化合物可以是例如化学品、蛋白质或核酸。可通过离体例如在细胞培养基中或在固体载体上接触细胞的样品来实施本发明 的方法。替代地，或此外，可例如通过将癌细胞样品移植到试验动物(例如裸鼠)并给予试 验动物测试试剂或组合物来体内实施本发明的方法。体内试验的优点是可在活体动物中评 价测试试剂的效果，这样更接近模拟临床情况。由于体内试验一般费用更高，在用体外方法 鉴定了 “线索”试剂(“leacTagent)后，体内试验作为二次筛选可特别有用。当以高通量(或超高通量)的形式实施本发明的方法时，可在固体载体(例如微 孔板、硅晶片或载玻片)上进行，其中细胞样品和/或感兴趣的基因的位置便于每个相互之 间画出轮廓(例如在孔中)。根据使用的特定载体，可使用这样的方法平行检测任何数量的 样品(例如96、1024、10，000、100，000或更多)。样品以阵列(例如确定的模式)放置的情 况下，通过样品的位置(例如使用x_y轴)可确定阵列中的每个样品，这样为每个样品提供 一个“地址”。使用可设定地址的阵列模式的优点是该方法可以全部或部分地自动化，这样 细胞样品、试剂、感兴趣的基因等可在期望的时间被分配到特异的位置(或从特异的位置 去除)，可监测样品(或等分试样)，例如以获得一个或多个与Notch信号转导途径相关的 基因的活性或表达。可与在此所描述的药剂联合使用的化学治疗剂的例子包括但不限于抗癌药诸如 柔红霉素、更生霉素、多柔比星、博来霉素、丝裂霉素、氮芥、苯丁酸氮芥、美法仑、环磷酰胺、 6_巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷(CA)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(5_FUdR)、甲 氨蝶呤(MTX)、秋水仙碱、长春新碱、长春碱、依托泊甙、替尼泊甙、顺钼和二乙基己烯雌酚 (DES)。抗炎药也可与在此所描述的药剂联合使用，包括但不限于非类固醇类抗炎药和皮质 类固醇类，抗病毒药，包括但不限于利巴韦林、阿糖腺苷、阿昔洛韦和更昔洛韦，也可与本发 明的组合物和方法联合使用。两种或更多的结合的化合物可一起或依次使用。提供下面的例子来进一步说明本发明的优点和特点，但并不是要限制本发明的范 围。虽然这些例子是可能使用的例子中典型的例子，但是可选择地使用本领域技术人员知道的其它的操作、方法或技术。 实施例实施例1|H常人样品和乳腺癌人样品中Notch成分的检测 本试验是为了阐明人乳腺癌中Notch信号转导的性质。为了 Notch表达分析，获得 2个正常的(A和B)和20个乳腺癌样品(组C、D、E、F、G)(表2. 1)。所有的样品都伴有病 理学报告。根据在肿瘤中ER、PR、erbB2, EGFR的表达，乳腺癌样品被分成5个组(表1，组 C、D、E、F、G)，这些基因与预后和临床结果相关。此外，每组内，肿瘤具有各种类型(小叶的 或导管的)和等级(I、II、III)。I级肿瘤的细胞通常是分化良好的，而且多数时间具有正 常的结构和功能。II级乳腺肿瘤具有开始看上去异常的细胞。另一方面，III级乳腺肿瘤的 细胞通常是分化不良的或未分化的，不具有特化的结构，并且趋于更侵略性地生长和扩展。 在所有其它的乳腺癌类型中，带有ER/PR阳性肿瘤的乳腺癌患者具有最好的预后和临床结 果。70%的ER/ra阳性肿瘤对激素治疗有反应，而不到10%的ER/ra阴性和大约40%的ER 阳性/PR阴性乳腺肿瘤有反应。ErbB2-阳性肿瘤是典型的侵略性癌，其临床结果不好。具 有ErbB2-阳性肿瘤的患者的5年存活率只有40%，而具有ErbB2_阴性肿瘤的患者的5年 存活率超过80%。ER阴性、ErbB2-阳性患者预后很差，而且这种肿瘤类型的治疗策略较任 何其它乳腺癌肿瘤类型的治疗策略都少。已经显示，erbB2/ER阳性肿瘤较ErbB2_阳性、ER 阴性肿瘤对激素治疗具有更好的反应。在20个样品中，13个是导管癌，7个是小叶癌。在 13个导管癌样品中，1个是I级，4个是II级，6个是111级，1个是原位导管癌(DCIS)。任 何小叶癌样品的等级是未知的。将22个样品(2个正常的，20个发生肿瘤样品)称重，分成 2半进行蛋白质印迹分析和免疫组织学分析。正常乳腺样品 乳腺癌样品* 表2. 1乳腺组织样品无ER或I3R表达，50% 中等的ER或I3R表达，100% 强的ER或PR表达，2+ 中等的erbB2表达，3+ 强的erbB2表达，2/3 中等的EGFR表达。小 叶的病变在小叶中发现，导管的病变在导管中发现，DCIS 原位导管癌。I级、II级和III 级分别指低度、中度和高度的核分化。N/A 未得到，-阴性的。此外，3个正常的(MCF-10A、MTSV1-7HB4A)和8个发生肿瘤的(Hs578T、 MDA-MB468、MCF7、ZR75T、CAL51、MDA-MB231、SK-BR3、和 PMC42)人乳房上皮细胞系用于蛋 白质印迹分析。表2. 2显示的是在3个正常MCF-10A、MTSV1-7HB4A和9个肿瘤Hs578T、 MDA-MB468、MCF7、ZR75T、CAL51、MBA-MB231、SK BR3、PMC42 人乳房上皮细胞系中 ER、PR、 ErbB2和EGFR的表达。ER PR erbB2 EGFR 恶性 肿瘤发生MCF-10A -正常 没有MTSV1-7 -正常 没有
HB4AHs578TMDA MB468MCF7ZR75TCAL51MDA MB231SK BR3PMC42表2. 2乳房上皮细胞系.ER 雌二醇受体，PR 孕酮受体，EGFR 表皮生长因子受 体，+ :阳性，阴性，N/A:未得到为了确定是否Notch信号转导在乳腺肿瘤内改变了，通过蛋白质印迹在2个正常 和20个乳腺癌组织样品中分析了正常组织中检测的Notch受体和配体的表达。此外，检查 了 NI⑶蛋白水平和Numb的表达。Numb是与Notch的胞内结构域相互作用的胞浆衔接蛋 白。由于它是NICD活性的泛素化和下调所必需的，所以它起到途径的负调节物的作用。与正常组织相比，Jagged2在7个ER+/PR+/erbB2_类别的肿瘤样品的5个、7个 ER+/PR-/erbB2-类别的肿瘤样品中的2个、3个ER+/erbB2+类别的肿瘤样品的2个中被下 调，而在ER-/erbB2+和ER-/EGFR+样品中保持不变。所有乳腺癌样品中的Numb的表达都 被停止。相反，当与2个正常样品相比时，所有乳腺癌样品中的NI⑶的表达被上调。此外， 在几个乳腺癌样品中观察到截短的、低分子量的NICD，这提示乳腺癌中Notch受体可能被 突变。通过对从ER+/ER+/erbB2-(Cl-C7)乳腺癌样品、正常乳房组织样品(A和B)、4个 导管癌和3个小叶癌提取的蛋白进行的蛋白质分析确定Jagged2的下调。样品用SDS-PAGE 分离，并用Numb、切割的Notchl (NICD)、Notchl、Jagged2、S -样4和E_钙粘蛋白一抗探测。 与2个正常样品相比，所有7个癌症样品中Numb被下调。相反，Notch的活化形式在所有7 个乳腺癌样品中被上调。Jagged2在4个导管癌中的3个(C1、C3和C4)和3个小叶型乳腺 癌样品中的2个(C5和C6)被下调。样4在4个导管癌中的2个和所有3个小叶型乳 腺癌样品中被下调。E-钙粘蛋白在所有肿瘤样品都被下调。在C2号样品中有另外低分子 量形式的切割的Notch。在C2、C4、C6、和C7号样品中有另外的低分子量形式的Jagged2。此外，对从ER+/PR-/erbB2-(Dl_D7)乳腺癌样品提取的蛋白进行蛋白质分析。从2 个正常的(A和B)、4个导管型和3个小叶型ER+/PR-/erbB2-乳腺肿瘤样品中分离全部的裂 解物，用 SDS-PAGE 分离蛋白质，并用 Numb、切割的 Notchl (NICD)、Notchl、Jagged2、S -样 4和E-钙粘蛋白一抗探测。与2个正常样品相比，Numb在所有7个癌症样品中被下调。相 反，Notch的活化形式在所有7个样品中被上调。Jagged2在4个导管癌中的3个和所有3 个小叶癌样品中被下调。S-样4在4个导管癌中的3个和所有3个小叶型肿瘤样品中被 下调。E-钙粘蛋白在4个导管癌中的2个和所有小叶型乳腺癌样品中被下调。在D1和D2 号样品中有另外低分子量形式的Jagged2。上皮细胞标记物Desmoplakin用于使每个样品 内的上皮细胞标准化。
没有
正常
管癌没有
有 有 有 有 有 有 有
癌 癌
管癌
管癌
癌 癌
导 腺 腺 导 导 腺 腺 癌
+ +
+
+
+
N/A N/A N/A
+
+ +
N/A N/A
+
+ +
+
对从ER+/erbB2+(El-E3)、ER-/erbB2+(Fl)、ER-/EGFR+(G1 和 G2)乳腺癌样品提 取的蛋白进行蛋白质分析。从2个正常的(A和B)、3个ER+/erbB2+、l个ER-/erbB2+和 2个ER-/EGFR+乳腺肿瘤样品中提取全部的细胞裂解物，通过SDS-PAGE分离裂解物，并用 Numb、切割的Notchl (NICD)、Jagged2、δ -样4和E-钙粘蛋白一抗探测。与2个正常样品 相比，Numb在所有7个癌症样品中被下调，而Notch的活化形式在所有7个乳腺癌样品中 被上调。Jagged2在3个ER+/erbB2+癌症样品中的2个癌样品中被下调。δ -样4在所有 ER+/erbB2+样品中被下调。E-钙粘蛋白在7个样品中的4个样品中被下调。多个样品中 存在有另外的切割的Notch和Jagged2的低分子量形式。上皮细胞标记物Desmoplakin用 于使每个样品内的上皮细胞标准化。 在几个乳腺癌样品中观察到截短的、低分子量的Jagged2。但是，还不清楚这种同 种型的关联性。S-样4的表达在正常样品和乳腺癌样品中是不同的，但是总的来说，当与 正常样品相比时，它在乳腺癌样品中被下调。E-钙粘蛋白在若干个样品中被下调。由于蛋白质分析不能区分上皮和间质组织，所以对上述乳房组织样品进行了免疫 组化分析以确定Notchl过表达在肿瘤内的定位。通过乳房上皮细胞标记物Mucl鉴定的上 皮细胞内强的Notchl (Ni⑶)染色与Numb的下调相伴。此外，检测到上皮细胞内强的Notch3 染色。Jaggedl和Jagged2的表达局限于上皮细胞。这些数据证明，Notch途径在乳腺癌的 发展和进展中被上调。实施例2lH常和乳腺癌细胞系中Notch成分的检测为了支持乳腺癌样品的蛋白质印迹和免疫组化结果，对3个正常的(MCF-10A、 MTSV1-7 HB4A)和 8 个发生肿瘤的(Hs578T、MDA-MB468、MCF7、ZR75T、CAL51、MDA-MB231、 SK-BR3和PMC42)人乳腺上皮细胞系进行了蛋白质印迹分析。其结果与从组织样品中得到
的结果一致。用Numb、切割的 Notchl (NICD)、Notchl、Notch3、Jagged2、δ -样 4、Ε-钙粘蛋白、 Heyl和Hes5 —抗探测蛋白质印迹。与3个正常细胞系相比，Numb在所有9个癌细胞系 中被下调。相反，Notch的活化形式在所有9个癌细胞系中被上调。在5个肿瘤细胞系中 观察到Notch活化形式的截短形式。此外，Hey2和Hes5的表达在所有乳腺癌细胞中被上 调，这证明了 NI⑶的积累与Notch信号转导的增加相关。Notch3在9个细胞系中的6个 (Hs578T、MDA MB468、MCF7、ZR75T、CAL51、SK BR3)中被上调，Jaggedl 在 9 个细胞系中的 7 个(Hs578T、MDA MB468、ZR75T、MDAMB231、SK BR3、MDA MB435、PMC42)中被上调。这些结果 共同表明，Notch信号转导在所有分析的乳腺癌细胞系中被活化。相反，Jagged2在9个测 试的肿瘤细胞系中的7个中被下调，在多个肿瘤细胞系中检测到了 Jagged2的较高分子量 形式。S-样4在9个肿瘤细胞系中的3个(Hs578T、ZR75T、SK BR3)中被下调。E-钙粘蛋 白在9个肿瘤细胞系中的5个(Hs578T、ZR75T、MDA MB23USK BR3、PMC42)中被下调。该分析的结果强烈地表明Notch信号转导在乳腺癌的进展期间被增加。Notch信 号转导途径的成分在所有检测的乳腺癌组织样品和细胞系中被过表达。而且，负调节物 Numb的表达在所有分析的样品中一致地被下调。但是，更重要的是看到的NI⑶的积累是 Notch信号转导的直接生化指示。与此一致的是，在乳腺癌细胞系中靶基因Hes5和Heyl的 表达被上调。
在多个乳腺癌样品和乳房上皮细胞系中还已经观察到截短的NI⑶分子的积累。 在T细胞急性淋巴母细胞白血病中已检测到相似的截短形式，现已表明这缘于突变，突变 产生了 Notchl的PEST序列内的移码或早熟终止密码子。由于PEST结构域含有对NI⑶降 解重要的序列，所以所得的Notchl蛋白更加稳定。结果，这些突变导致Notch信号转导的 增加。在分析的人乳腺癌样品中的截短的Notchl (NICD)分子的存在提示，在乳腺癌中可能 发生相似的活化突变。最后，对与预后标记物(PR、ER、erbB2、EGFR)相关的Notch表达的分析显示，在 乳腺癌样品或细胞系中均没有显著的相关性。该分析的结果提供了强有力的证据，这就是 Notch途径在人乳腺癌中被改变。实施例3抑制Notch信号转导逆转人乳腺癌细胞系MDA-B231和MCF7的转化表型来自乳腺癌患者和细胞系分析的结果显示Notch信号转导在所有分析的20个人 乳腺癌样品和8个发生肿瘤的乳房上皮细胞系中被活化。为了确定Notch信号转导的增加 是否参与肿瘤的发展，在2个不同的乳腺癌细胞系中通过过表达Numb来抑制Notch信号转 导。本实验选择的2个细胞系是MDA-MB-231和MCF7。MDA-MB231细胞系来自不表达ER、 ra、EGFR和E-钙粘蛋白但强烈地表达erbB2的腺癌(见表2)。也有报道，当它被注射到裸 鼠体内，它是高度转移性的。相反，MCF7细胞系是ER、PR、E-钙粘蛋白阳性和erbB2、EGFR 阴性的(见表2. 1)，它也来自腺癌，但是当它被注射到裸鼠体内时，不转移。为了研究Numb在细胞转化中的潜在的作用，产生了稳定表达Numb的MCF7和 MDA-MB231细胞系。用编码Numb蛋白和携带新霉素抗性盒的pcDNA3. 1表达载体转染这两个 细胞系。用遗传霉素挑选携带载体稳定整合的细胞。也产生了携带空pcDNA3. 1载体的MCF7 和MDA-MB231细胞系作为对照。蛋白质印迹鉴定，与亲本细胞和载体对照细胞相比，MCF7/ Numb和MDA-MB231/Numb细胞系中Numb的表达水平升高了。Numb的过表达伴随着NICD和 Heyl的下调。在MCF7/Numb细胞中还观察到E-钙粘蛋白的上调，但是在MDA_MB231/Numb 细胞中未观察到。为了评价Numb对细胞形态学的影响，分析了亲本细胞、载体对照细胞和MCF7/ Numb或MDA-MB231/Numb细胞。亲本细胞和载体对照MCF7细胞显示致瘤的、纺锤体样的表 型。相反，MCF7/Numb细胞的表型变成了正常的上皮细胞鹅卵石样的形态学。此外，与亲本 细胞和载体对照细胞系的无组织生长相比，MCF7/Numb细胞在有组织的相互紧密接触的细 胞岛中生长。相反，MCF7/Numb细胞显示与正常细胞系相似的鹅卵石样上皮细胞形态学。这 种形态学上的改变提示MCF7/Numb细胞系已失去了其转化的表型。但是，为了更严格地检 测这种变化并检测MDA-MB231/Numb细胞系，将这两个细胞系铺板到软琼脂上。与亲本细胞 和载体对照细胞形成的集落数相比，MCF7/Numb和MDA-MB231/Numb细胞形成的集落数分别 降到5%和0% (图2A和2B)。这个结果强有力地提示，在MCF7和MDA-MB231细胞中需要 Notch信号转导来维持其转化的表型。这些数据提示，Notch信号转导的活化是乳房上皮细胞转化的重要事件。在MCF7 细胞中，Numb对Notch途径的失活上调E-钙粘蛋白的表达，恢复正常上皮细胞的形态学。 这种形态学上的改变或许是由于粘附连接的恢复。MCF7/Numb和MDA_MB231/Numb细胞在软 琼脂中形成集落的能力降低，这提示Numb阻断了这两个细胞系的不依赖于贴壁的增殖。
另外，使用Numb减弱notch信号转导途径抑制免疫缺陷的裸鼠的肿瘤形成。将稳 定表达Numb或空载体的5X IO5细胞分别注射到免疫缺陷的裸鼠的右侧腹或左侧腹。只在 注射了表达空载体细胞的左侧腹肿瘤生长得到支持，注射了表达Notch抑制剂Numb的细胞 的右侧腹肿瘤生长得不到支持。实施例4抗Notch活化的Tr3和Tr4产物低生物膜通透性通常是抗癌多肽部分输送的一个障碍并限制了抗癌多肽部分的 治疗价值。肽越过生物膜的易位可不通过经典的胞吞途径，而是通过好像不需能量的机制 的实证揭开了生物医学研究的新的可能性。本发明的方法利用特洛伊肽触角足(Trojan peptide Antenapedia(ANTP))的细 胞易位能力来治疗癌症。“特洛伊木马”肽是小的蛋白或蛋白区域，另外被称作蛋白转导结 构域(PTDs)，具有以不依赖温度、受体和转运体的方式有效地穿越包括血脑屏障在内的生 物膜的能力。它们巨大的治疗潜力在于这些肽能运载与其融合的任何药物化合物(化学 品、蛋白质、DNA)，而不论其物理性质如何。果蝇属同源异型转录因子ANTP就是一个这样的 肽。ANTP同源结构域是来自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)生物体的序列特异的 转录因子。这个蛋白由触角足(antp)基因编码。Antp是调节系统的成员，它在有机体的 前_后轴上给细胞特异的位置。因此，Antp辅助果蝇属中胸节段的细胞发育的控制。同源异形盒结构域或同源结构域是通过螺旋_转角-螺旋结构基序结合DNA的结 构域。含有同源异形盒结构域的蛋白质通常在发育中发挥作用，它们许多是序列特异的转 录因子。ANTP同源结构域为60个氨基酸残基长，含有4个α螺旋。这种基序与在原核阻 遏蛋白中发现的基序相似。融合蛋白是遗传改造的，由触角足-Numb (Tr3产物)组成，检测它体内靶向肿瘤细 胞的能力(图3A)。SEQ ID N0. 1列出了 Tr3融合蛋白的序列。Numb序列单独列在SEQ ID N0. 3 中。实施例5ANTP/DN-MAML的实验室产生和特性Mastermind-样(MAML)是一个富含谷氨酰胺的核蛋白，它是Notch信号转导活化 所必需的。MAML是所有4个Notch受体的辅激活物。Mastermind与活化的Notch (NICD)的 胞内部分、转录因子CBFl和DNA形成复合体。这导致了 Notch靶基因Hes和Hey的活化， Hes和Hey构成转录抑制物家族。但是，能够维持与复合体缔合的MAML的截短形式以显性 负性(DN)的形式发挥作用，并抑制Notch活化。DN-MAML由62个氨基酸扭结的α -螺旋组 成，它通过与CBFl和Notchl的锚蛋白重复序列相接触形成稳定的三元复合体，但是它缺少 负责Notch活化的MAMLl的C-末端部分。构建了由ANTP/DN-MAML(TR4)组成的融合蛋白(图 3B) (SEQ ID N0. 2)。检测了 这个结构构建物介导核易位、抑制Notch信号转导活化、在动物中的生物分布和靶向乳房 肿瘤的外_、中-和内核的能力。产生在细菌表达系统(大肠杆菌E Coli))中产生ANTP/DN-MAML融合蛋白。用含有融 合基因的载体转化细菌表达株，诱导表达，裂解细菌。诱导后3小时ANTP/DN-MAML融合蛋白的表达为最大，达到2. 5mg/L培养物。在具有盐酸胍和尿素的变性条件下，在镍螯合琼脂 糖柱上利用金属亲和层析分离融合蛋白产物。然后用Tris缓冲盐水使融合蛋白产物再次 折叠，之后用PBS透析2次以获得最终有功能的产物。不正确折叠的蛋白是无功能的，从溶 液中沉淀析出。获得的最终产量是每升培养物0. 8-lmg活性化合物。配制和储存融合蛋白以0. 25mg/mL的浓度在PBS中冷冻。使用之前，将融合蛋白浓缩10倍至 2. 5mg/mL。表征和检测ANTP/DN-MAML 是一个 14. 18KDa 的融合蛋白a) 60个氨基酸的触角足同源结构域，分子量为6. 6KDa (SWISSPR0T = P02833) (R K RGRQTYTRYQTLELEKEFHFNRYLTRRRRIEIAHALCLTE RQIKIWFQNRRMKWKKEN) (SEQ ID NO. 4)b) 62 个氨基酸的 DN/MAML 序列(SWISSPR0T = Q92585 (MAML1-HUMAN,氨基酸 13-74))，分子量为 6. 8KDa (LPRHSAVMERLRRRIELCRRHHSTCEAR YEAVSPERLELERQHTFALHQRCIQAKAKRAGKH) (SEQ ID NO. 5)c)用于纯化的五组氨酸标记，分子量为0. 775KDa从亲和柱纯化的ANTP/DN-MAML融合蛋白部分通过SDS-PAGE检测，用考马斯亮蓝 染色，并用抗五组氨酸抗体及过氧化物酶结合的抗体进行免疫印迹。实施例6ANTP/DN-MAML介导的核转导为了测定ANTP/DN-MAML (TR4)融合蛋白的细胞定位，进行了人乳房上皮乳腺癌 MDA-MB231细胞的免疫染色。在37°C、含有10 %小牛血清的DMEM培养基(Dulbecco ‘ s modified Eagle' s medium)中培养MDA-MB231细胞至亚汇合。洗附着有细胞的盖玻片， 将其与浓度为50 ii M的ANTP/DN-MAML纯化的融合蛋白在无血清培养基中温育2小时。洗 细胞3次，将细胞用4%的福尔马林固定15分钟。简单洗涤后，将盖玻片与封闭液、接下来 与抗His —抗和FITC结合的二抗温育。用ZeissAxioscope 40荧光显微镜观察荧光。结果显示ANTP/DN-MAML在粘附细胞中有核定位。这种定位令人感兴趣，因为人癌 症乳房上皮细胞系MDA-MB231是较难转染的细胞之一。实施例7ANTP/DN-MAML-介导的 Notch 抑制为了研究ANTP/DN-MAML抑制Notch信号转导活化的潜在的作用，高度转移的乳 房上皮细胞系MDA-MB231细胞系用ANTP/DN-MAML融合蛋白处理2个小时。用SDS缓冲液 从细胞中提取总蛋白。使用BCA蛋白分析试剂盒测定总蛋白的浓度。用5X样品缓冲液 (250M Tris-HCl pH 6. 8、500mM 二硫苏糖醇、10% SDS、0. 5%溴酚蓝、50%甘油)稀释总蛋 白(10-50g)，100°C加热，用SDS-PAGE分析。在电泳缓冲液(25mM Tris HCl、250mM甘氨 酸、0.1% SDS)中进行电泳60分钟或直到溴酚蓝跑出凝胶。在冰冷的转移缓冲液(39mM 甘氨酸、48mM Tris HC1)中100V电泳90分钟将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜。用在 山羊一抗中产生的抗小鼠IgG过氧化物酶(Sigma A9917)在封闭缓冲液中4°C过夜用一抗进行蛋白质印迹。在TBS-T缓冲液中洗硝酸纤维素膜4次，每次5分钟。用封闭缓冲液以 1 10，000稀释多克隆兔抗山羊的二抗，室温温育60分钟，然后TBS-T缓冲液中洗4次，每 次5分钟。用2ml Super Signalffest Pico化学荧光底物试剂(PIERCE)检测特异性结合， 将信号捕获在Kodak XAR-5膜上。在用ANTP/DN-MAML转染的细胞中，ANTP/DN-MAML的表达伴随有活化的 Notch(NICD)的下调，但在ANTP转染的细胞或亲本(未转染的)细胞中则不这样。在用 ANTP/DN-MAML融合蛋白处理的细胞中，Notch活化的下调发生，但在用ANTP单独处理的细 胞中则不发生。这些结果表明，ANTP/DN-MAML可用于阻断Notch活化。实施例8ANTP/DN-MAML 牛物分布为了测定触角足是否能用于在体内递送DN-MAML，通过尾静脉给⑶1裸鼠静脉内 注射4mg/kg的ANTP/DN-MAML融合蛋白。小鼠用磷酸盐缓冲盐水灌注5分钟，注射后2小 时将其处死。通过蛋白质印迹分析来测定每个器官中ANTP/DN-MAML的表达。与注射PBS 的对照小鼠相比，来自ANTP/DN-MAML注射小鼠肝脏、肾脏、心脏、肺、脾脏和脑的组织样品 展示了显著的信号。令人感兴趣地是，在动物的脑中也检测到ANTP/DN-MAML，这提示ANTP/ DN-MAML能穿越血脑屏障。这样，本发明的靶向递送系统在将治疗蛋白给予中枢神经系统中 可具有广阔的应用。实施例9ANTP/DN-MAML穿诱乳房肿瘤的外、中和内核通过尾静脉给用MDA-MB231人乳房上皮乳腺癌细胞系异种移植的CD1裸鼠注射纯 化的ANTP/DN-MAML融合蛋白。用磷酸盐缓冲盐水灌注小鼠5分钟，并在注射后2小时将其 处死。将肿瘤取出，在立体镜下切开，分离肿瘤的外、中和内核。用蛋白质印迹测定肿瘤的 每个核中的ANTP/DN-MAML。在注射了 ANTP/DN-MAML的动物的肿瘤的外、中和内核中检测到 了 ANTP/DN-MAML的表达，但在注射了 PBS的对照动物中则未检测到。为了建立ANTP/DN-MAML在肿瘤内的定位，进行了上述乳腺癌样品的免疫组化检 查。观察到乳腺癌细胞的核内有强的ANTP/DN-MAML染色。这些数据表明，ANTP/DN-MAML融 合蛋白介导体内的核定位。实施例10触角足-显性负性Mastermind引起的体内肿瘤减小在小鼠中建立乳腺癌异种移植物。将小鼠分成2组，每2天给小鼠注射作为对照 的PBS或4mg/kg ANTP/DN-MAML融合蛋白(n = 6每组)(图4A)。用PBS处理的对照小鼠 快速发展出生长的肿瘤。20天后，将对照小鼠处死。32天后，用ANTP/DN-MAML处理的小鼠 的肿瘤体积没有增大，这提示ANTP/DN-MAML阻止或抑制肿瘤生长(图4B)。实施例11毒理学和免疫原性研究为研究ANTP/DN-MAML在肿瘤模型中的安全性、免疫原性和有效性，进行了下面的 体内试验。免疫原性是对治疗药物产生免疫反应的量度。这与治疗性蛋白药物的使用相关， 因为抗药抗体的发展可引起变态反应或过敏反应，药物的有效性的减低和/或自身免疫的 诱导。
在免疫活性小鼠中研究ANTP/DN-MAML的免疫原性。用ANTP/DN-MAML (0. 2ml， 2. 5mg/ml)静脉内免疫动物，不加佐剂，每天1次，共5天。在4个月的时间里每周采血一 次，用ELISA监测免疫反应。用PBS以1 10、1 100和1 1000稀释血样，用ELISA在 天然的ANTP/DN-MAML (50 u g/ml包被)上监测免疫反应，并用抗小鼠的抗体检测。结果显 示，在每周剂量为2. 5mg的免疫活性小鼠中，ANTP/DN-MAML并没有引起免疫反应。这个剂 量相当于人中的100mg/kg。实施例12体内最大耐警剂量研究当小鼠达到12周龄时开始尾静脉给予ANTP/DN-MAML。连续地监测小鼠低血糖休 克的征象或药物副作用，如果体重减轻超过15%，就将小鼠处死。检测从4mg/kg/天开始的 各种剂量。发现57mg/kg/天的ANTP/DN-MAML是最大耐受剂量。在这个剂量下，小鼠食欲 缺乏，体重减轻和血糖过低。注射后3天处死动物，终止试验。实施例13卵巢癌、结肠癌和胰腺癌樽型结肠癌细胞中有高水平的Notch表达。给予带有异种移植的Colo205肿瘤的雌性 裸鼠ANTP/DN-MAML。每隔一天给小鼠注射0. 2ml的4mg/ml ANTP/DN-MAML蛋白。这个剂量 相当于每个患者2g ANTP/DN-MAML融合蛋白。结果显示，给予ANTP/DN-MAML降低了体内结 肠癌细胞的生长。尽管参考上述实施例描述了本发明，但是应理解的是各种修改和变化包含在本发 明的精神和范围内。因此，本发明只受所附权利要求的限制。
权利要求
一种治疗癌症的方法，包括用图3A(SEQ ID NO1)或3B(SEQ ID NO2)中显示的构建物接触癌细胞足够的时间，使得所述构建物得到表达，从而治疗所述癌症。
2.权利要求1所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
3.权利要求1所述的方法，还包括用化学治疗剂接触所述癌细胞。
4.一种测定癌细胞对Notch途径抑制剂治疗的反应性的方法，包括测定细胞中的 Notch 1水平，其中，与正常细胞中的Notch 1水平相比，Notch 1的较高水平表示细胞对 Notch途径抑制剂治疗有反应。
5.权利要求4所述的方法，其中图3A或3B显示了Notch途径抑制剂。
6.权利要求4所述的方法，还包括测定细胞中Numb表达的水平，其中与正常细胞中的 Numb水平相比，Numb表达的低水平表示细胞对Notch途径抑制剂治疗有反应。
7.权利要求4所述的方法，其中所述癌细胞是乳腺癌细胞。
8.构建物，如图3A或SEQID NO :1中所显示。
9.构建物，如图3B或SEQID NO :2中所显示。
10.一种治疗癌症的方法，包括用显性负Mastermind同种型或Numb同种型接触癌细胞。
11.权利要求10所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌、前列腺 癌、血癌或胰腺癌。
12.权利要求10所述的方法，还包括用化学治疗剂接触所述癌细胞。
13.权利要求10所述的方法，还包括用触角足接触所述细胞。
14.一种测定癌细胞对Notch途径抑制剂的治疗是否有反应的方法，该方法包括测定 细胞中的Notch 1水平，其中，与正常细胞中的Notch 1水平相比，Notch 1的较高水平表 示细胞对Notch途径抑制剂的治疗有反应。
15.权利要求14所述的方法，其中所述Notch途径抑制剂包括显性负Mastermind同种 型或Numb同种型。
16.权利要求14所述的方法，还包括测定细胞中Numb表达的水平，其中，与正常细胞中 的Numb表达水平相比，Numb表达的低水平表示细胞对Notch途径抑制剂的治疗有反应。
17.权利要求14所述的方法，其中所述癌细胞是乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细 胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞、造血细胞或胰腺癌细胞。
18.—种监测治疗患有癌症或处于患有癌症危险的受试者的治疗计划的方法，该方法 包括测定一个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的活性或表达。
19.权利要求18所述的方法，其中所述涉及Notch信号转导途径的基因选自Jaggedl、 Jagged2 S -样 4、E_ 钙粘着蛋白、Numb、NICD Notch 3、Heyl、Hes5 或其组合。
20.一种诊断患有癌症或处于患癌症危险的受试者的方法，该方法包括测定一个或多 个涉及Notch信号转导途径的基因的活性或表达，其中，与正常细胞的水平相比，一个或多 个涉及Notch信号转导途径的基因的活性或表达的改变诊断出患有癌症或处于患癌症危 险的受试者。
21.权利要求20所述的方法，其中所述涉及Notch途径的基因选自Jaggedl、 Jagged2 S -样 4、E_ 钙粘着蛋白、Numb、NICD Notch 3、Heyl、Hes5 或其组合。
22.一种鉴定试剂的方法，该试剂调节一个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的活性或表达，该方法包括将测试试剂与显示表达一个或多个涉及Notch信号转导途径的基 因的细胞相接触，检测一个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的活性或表达的变化， 由此鉴定所述测试试剂为调节一个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的活性或表达 的试剂。
23.权利要求22所述的方法，其中所述涉及Notch信号转导途径的基因选自Jaggedl、 扭886(12 3-样4』-钙粘着蛋白、灿11113、肌0) Notch 3、Heyl、Hes5或其组合。
24.权利要求22所述的方法，其中所述细胞是癌细胞。
25.权利要求24所述的方法，其中所述癌细胞是乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细 胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞、造血细胞或胰腺癌细胞。
26.权利要求22所述的方法，其中所述试剂是化学化合物、蛋白质或核酸。
27.权利要求26所述的方法，其中所述试剂是反义或RNAi分子。
28.一种将化合物递送给细胞的方法，该方法包括用融合到触角足或其功能部分的化 合物接触所述细胞。
29.权利要求3或12所述的方法，其中所述化学治疗剂选自柔红霉素、更生霉素、多柔 比星、博来霉素、丝裂霉素、氮芥、苯丁酸氮芥、美法仑、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌 呤、阿糖胞苷(CA)、5_氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤(MTX)、秋水仙碱、长春 新碱、长春碱、依托泊甙、替尼泊甙、顺钼或二乙基己烯雌酚(DES)或其组合。
全文摘要
本发明基于Notch信号转导途径与癌症相关的发现。相应地，本发明提供了治疗癌症的方法和组合物。还提供了用于对受试者诊断和治疗癌症的调节Notch信号转导途径中的蛋白的表达和/或活性的方法。
文档编号C07K14/435GK101878223SQ200880118402
公开日2010年11月3日 申请日期2008年10月6日 优先权日2007年10月5日
发明者S·斯蒂利亚诺 申请人:特洛伊科技有限公司