一种多氯联苯同系物的单克隆抗体的制备及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种单克隆抗体的制备方法，特别涉及一种水体和土壤沉积物中环境 激素多氯联苯PCB37的免疫检测的多氯联苯同系物的单克隆抗体的制备方法。
【背景技术】
[0002] 多氯联苯（PCBs)作为一种具有持久性危害的痕量有机污染物，得到了世界性的 广泛关注。不同的国家对PCBs的命名的方式不同，除了化学上的标准命名法外，我国习惯 上按联苯上被氯取代的个数（不论其取代位置）将PCBs分为三氯联苯（PCB3)、四氯联苯 (PCB4)、五氯联苯（PCB5)、六氯联苯（PCB6)。据估计，全世界已生产和应用的多氯联苯近100 万t，其在各类环境中的累积量估计达25万-30万t。PCBs具有较低的水溶解性和高的辛 醇-水体系分配系数，因此很容易就进入生态循环，通过食物链的被富集，对人类产生毒 害作用。同时由于其化学降解过程和生物降解过程相当缓慢，使得此类物质对环境造成长 期的污染，以致多次出现二次污染。
[0003] 多氯联苯（PCBs)作为一种受到世界各国环境工作者广泛关注的环境激素类污染 物，其检测方法的研究成为一个研究热点。当前，以酶联免疫法（ELISA)为代表的免疫检测 方法作为一种快速，特异性强、灵敏度高、简便、快速等优点，近年来备受人们的关注。美国 国家环保局（EPA)也已经在2003年就把此类方法作为标准方法公布出来，应用于土壤沉积 物中多氯联苯的检测。当前市场上已经有多氯联苯免疫检测试剂盒的产品。
[0004] 然而，建立免疫分析方法的关键是获取效价高、选择性好的抗体。虽然目前已经有 关于针对PCB12,PCB37,PCB77的抗体的报导，但它们对目标分子的效价较低，选择性相对 较差，影响了检测方法的灵敏度和选择性。
[0005] 在对环境中多氯联苯PCB37的检测研究中，对样品中多氯联苯单个有代表性的毒 性较强的单体如PCB37污染物的检测具有非常重要的意义。虽然目前已建立的酶联免疫吸 附分析法、仪器色谱分析能够准确检测环境样品中的PCBs，但其灵敏度相对较低，对于一些 所含PCBs以痕量存在的样品，往往需要通过浓缩才能对其实现分析检测，甚至不能检出， 从而降低了方法的准确度，不适合环境中痕量PCBs的分析检测。但是，2003年，美国西北 大学的ChadMirkin课题组提出了一种超灵敏的基于纳米粒子的生物条形码技术来检测 蛋白分子，该方法主要通过抗原抗体的特异性结合及磁分离来实现对目标分子的识别和分 离；利用修饰在金纳米颗粒（goldnanoparticles，GNPs)表面的DNA作为检测信号，并将 此DNA形象地称为条形码DNA(barcodeDNA)或者信号DNA(signalDNA)。GNPs表面可以 修饰数百条条形码DNA，这使得检测信号得到有效的放大，经过金标银染增强技术进一步放 大信号，用平板扫描仪进行分析检测，其灵敏度可达10lsmolLi。该方法不用酶标记或者催 化底物放大信号，而单纯的用纳米材料表面可以修饰大量信号探针的放大效应，并利用纯 物理的手段来检测，这也使得生物条形码技术成为目前已报导的唯一一种不用酶催化放大 就能和PCR技术相媲美的方法。此外，该方法以DNA作为检测探针，而现有DNA检测方法的 多样化也为生物条形码技术的发展和应用提供了广阔的空间。目前，该方法已成为生物大 分子、环境污染物等分析检测方面的研究热点。
[0006] 此外，近年来，随着生物条形码技术与其他分析检测方法的结合，形成了多种基于 生物条形码技术的分析方法。其中，荧光定量PCR生物条形码方法是在体系的检测阶段，以 条形码DNA为模板DNA，利用实时荧光定量PCR对条形码DNA进行扩增和分析来定量分析检 测目标分子；和原有的方法相比，该方法具有更好的特异性，能够有效的避免与相似蛋白的 交叉反应，以实时荧光定量PCR作为检测手段也避免了常规PCR中假阳性的出现。当前，基 于实时荧光定量PCR的间接竞争生物条形码方法主要用于生物学与医学研究领域，用来对 一些致病细菌或蛋白质进行检测，在环境监测领域，此技术也只是用于对环境中一些病毒 或蛋白质的检测。目前还没见到此技术用于PCBs类尤其是PCB37环境污染物的检测报道。
[0007] 现有技术中，专利申请号为CN201310246024. 0,名称为"一种多氯联苯单克隆抗体 的制备方法"，公开了一种多氯联苯单克隆抗体的制备方法，但是该方法制备的是混合型单 克隆抗体，其专一性不是很强，容易产生交叉反应，最终导致免疫方法检测多氯联苯时浓度 偏高的现象发生。
【发明内容】
[0008] 针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种抗多氯联苯PCB37单克隆抗体 的制备方法，该方法制备的单克隆抗体特异性更强，效价更高，提高了抗体对多氯联苯单体 的亲和性，为满足多氯联苯类污染物的免疫检测技术发展的需要提供技术支持。
[0009] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0010] 本发明提供了一种抗多氯联苯单体3, 4, 4'-三氯联苯PCB37单克隆抗体的制备方 法，所述方法包括以下步骤：
[0011] 通过PCB37半抗原合成免疫原；
[0012] 将合成的免疫原通过采用动物免疫方法及杂交瘤抗体技术制备得到抗多氯联苯 PCB37单克隆抗体。
[0013] 优选地，所述的通过PCB37半抗原合成免疫原具体包括以下步骤：
[0014] A1、将PCB37半抗原加入非质子有机溶剂a使其溶解，得溶液a;
[0015] A2、将N，N-二环己基酰亚胺和N-羟基丁二酰亚胺，加入非质子有机溶剂b使其溶 解，得溶液b;
[0016] A3、将所述溶液b加入所述的溶液a中，搅拌反应；反应完后取上清液；
[0017] A4、将牛血清蛋白BSA溶液加入到所述的上清液中反应，得PCB37半抗原-BSA结 合物，即免疫原。
[0018] 优选地，所述步骤A1中，所述PCB37半抗原为三氯联苯半抗原，所得溶液a中 PCB37半抗原的浓度为1~3mmol/mL;所述步骤A2中，N,N-二环己基酰亚胺和N-羟基丁二 酰亚胺的重量比为1:1. 6~1. 8,所得溶液b中N,N-二环己基酰亚胺的浓度为80~83mg/ mL〇
[0019] 优选地，所述步骤A3中，所述溶液b与溶液a的体积比为3~5 : 4，反应时间为 8~10h;所述步骤A4中，BSA溶液为牛血清蛋白BSA溶于碳酸盐缓冲溶液所得，BSA溶液 的浓度为16mg/mL，冰浴条件下反应时间为6~8h。
[0020] 优选地，所述非质子有机溶液a和非质子有机溶液b独立地选自N，N-二甲基甲酰 胺或二甲亚砜。
[0021] 优选地，所述PCB37半抗原为三氯联苯半抗原
熔点为162~164°C。
[0022] 优选地，所述的将合成的免疫原通过动物免疫方法及杂交瘤抗体技术制备得到抗 多氯联苯PCB37单克隆抗体包括以下步骤：
[0023]S1、用已纯化的免疫原和完全佐剂混合后充分乳化，然后对动物进行首次免疫注 射，再以不完全佐剂进行追加强化反应，使动物体内产生抗多氯联苯PCB37单克隆抗体；
[0024]S2、将步骤S1中体内产生抗多氯联苯PCB37单克隆抗体的动物，取其含有抗多氯 联苯PCB37单克隆抗体的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，获得含有抗多氯联苯PCB37 单克隆抗体的杂交瘤细胞。
[0025] 优选地，所述方法还包括采用腹水生产法将步骤S2获得的杂交瘤细胞接种至动 物腹腔，收集腹水，离心、纯化，获得纯化后的抗多氯联苯PCB37单克隆抗体的步骤。
[0026] 优选地，所述纯化采用硫酸铵盐析法、辛酸盐析法、辛酸-硫酸铵沉淀法、DEAE纤 维素离子交换层析法、QAE纤维素离子交换层析法或亲和层析法中的一种或多种结合。
[0027] 优选地，所述纯化采用辛酸-硫酸铵沉淀法和DEAE纤维素离子交换层析法结合。 该方法纯化效率高，操作简单，比较适合单克隆抗体的纯化。
[0028] 优选地，所述方法还包括在步骤S2的细胞融合前三天，对动物进行一次冲刺免 疫。
[0029] 优选地，还包括将步骤S2获得的杂交瘤细胞进行克隆化扩大培养获得含有抗多 氯联苯PCB37单克隆抗体的杂交瘤细胞株的步骤。
[0030] 优选地，步骤S1中，所述的首次免疫注射采用等量的免疫原和完全佐剂充分乳 化，免疫原的用量为40~100yg/只。
[0031] 优选地，所述的弗氏完全佐剂，包括液体石蜡和羊毛脂的混合物（体积比1~5 : 1)、免疫原和含结核分歧杆菌的细胞壁成分（即卡介苗）；弗氏不完全佐剂，包括液体石蜡 和羊毛脂的混合物（体积比1~5 :1)、免疫原组成的油包水的乳浊液，佐剂活性来自于油 滴中免疫原的持续释放，并刺激局部免疫反应。
[0032] 优选地，所述动物为哺乳动物或禽类，哺乳动物包括家兔、羊、马、豚鼠、猪或猴，优 选兔或豚鼠；禽类包括鸡、鸭、鹅或鹤鹑，优选鸡；上述动物为适龄、健壮、无感染的动物，优 选雄性动物，动物的年龄应是青壮年，优选月龄3个月的成年豚鼠。
[0033] 优选地，步骤S1中，所述追加强化反应，第一次加强选择首次免疫后2~3周，以 后的加强选择上一次免疫后2~4周，所述的追加强化反应所用的免疫原的用量为首次免 疫原用量的〇. 5~1. 5倍。免疫应答需要时间，首次免疫后必须要间隔2~3周给动物一 个适应的过程再加强免疫，防止动物不适应外界刺激而死亡的现象发生，以后的加强免疫 选择2~4周的间隔期，也是为了动物体的生物免疫应答不对动物造成过多过大的伤害，如 死亡等。后期的追加强化反应的免疫剂量的选定应考虑抗原性强弱、分子量大小和免疫时 间。抗原需量多，时间间隔长，剂量可适当加大。大动物抗原剂量（以蛋白抗原为准）约 0. 5~lmg/只，小动物约0. 1~0. 6mg/只，豚鼠属于小动物。择因为剂量加大极易造成免 疫耐受（免疫抑制）而遭失败。免疫相关文献已有证明，几微克的蛋白质