苯PCB37单克隆抗体的杂交瘤细胞10d后豚鼠腹 部明显膨大，收集腹水，在3500r/min下离心20min，收集上清液得到淡黄色含抗多氯联苯 单体PCB37的单克隆抗体的腹水，-20°C保存备用。
[0071] 实施例2抗多氯联苯单体PCB37的单克降抗体的制备
[0072] (1)动物的免疫
[0073] 以PCB37半抗原-BSA为免疫原，采用颈背部皮下多点注射的方式免疫三只豚鼠， 免疫方案如表2所示，第一次免疫时将免疫原和完全弗氏佐剂进行等体积混合乳化，从第 二次免疫开始将免疫原和弗氏不完全佐剂进行等体积混合乳化，每次注射1〇〇yL，免疫剂 量为100yg，细胞融合前三天，进行一次冲刺免疫。从第三次免疫开始，每次免疫后隔一周， 由小鼠尾部采血，用间接ELISA测定抗血清效价。
[0074] 表2免疫方案 [00751
[0076] 注：CFA指弗式完全佐剂，IFA指弗氏不完全佐剂。
[0077] (2)细胞融合
[0078] 骨髓瘤细胞SP2/0的培养：将冻存的骨髓瘤细胞SP2/0迅速放入37°C的水浴中， 轻轻摇晃，lmin内使冻存液完全溶解。在超净台中，将骨髓瘤细胞SP2/0溶液转移至离心 管中，加入5mLRPMI1640培养液，在1000r/min下离心lOmin，弃上清液；再加入5mLRPMI 1640完全培养液，轻轻混匀后转移至细胞培养瓶中，在37°C，含5%C02的培养箱中继续培 养。根据细胞的生长状态及时换液，在细胞融合前，使细胞保持在对数生长期。
[0079] 准备含抗多氯联苯PCB37单克隆抗体的脾细胞：细胞融合前3天，对豚鼠进行冲刺 免疫，融合的当天通过断颈处死豚鼠，并浸泡于75%的乙醇溶液中5min。随后在超净台中 无菌操作打开豚鼠腹腔，取出脾脏并置于玻璃平皿中，用注射器向脾脏内注射RPMI1640培 养液，再用弯曲的针头多点刺破脾膜，随后用注射器吸取培养液反复吹打至脾脏完全变白。 在玻璃平皿中加满培养液，并将细胞悬液转移至离心管中，在1000r/min下离心5min，弃上 清液，用RPMI1640培养液重悬细胞，重复离心洗涤3次，最后用10mL基础培养液重悬细胞 备用。
[0080]PEG融合：取对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0,用基础培养液离心洗涤一次，并用 基础培养液重悬备用。将骨髓瘤细胞（2X10s)和脾细胞（IX107)混合，加入基础培养液离 心洗涤一次，轻轻敲击离心管底部，将细胞沉淀打散。在37°C的水浴中轻轻加入0. 8mL浓度 为50%的PEG1500溶液，静置90s，随后在5min内计入10mLRPMI1640培养液。在1000r/ min下离心10min，弃上清液，并用HAT培养液（在RPMI1640基础培养液中加入2%的HAT 培养基（50X)和20 %的胎牛血清）重悬细胞，混匀后以每孔100yL接种10块96孔细胞 培养板（前一天已加入饲养细胞），将细胞培养板置于37°C、C02浓度为5%的细胞培养箱 中培养。
[0081] (3)杂交瘤细胞的筛选和克隆化培养
[0082] 细胞融合4d后，观察细胞生长情况，分别用HAT培养液和HT培养液（在RPMI1640 基础培养液中加入1%的HT培养基（100X)和20%的胎牛血清）进行半换液，10d后采用 间接ELISA方法检测细胞上清液，筛选出特异性高，阳性强的含抗多氯联苯PCB37单克隆抗 体的杂交瘤细胞。
[0083] 采用有限稀释法对筛选到的阳性杂交瘤细胞进行克隆化培养。将杂交瘤细胞稀释 至80个/mL，40个/mL，20个/mL10个/mL，，每孔100yL接种到96孔培养板中，在细胞培 养箱中培养，共接种10块96孔细胞培养板。10d后，检测只有一个杂交瘤集落的孔，若为阳 性，再以同样的方法重复克隆。经统计，杂交瘤细胞生长孔位851孔；用间接ELISA筛选得 到的阳性孔为7孔；采用有限稀释法对7个阳性孔进行克隆化培养，经3次克隆，得到1株 阳性率达100%的单克隆细胞株即高特异性、效价高的含抗多氯联苯PCB37单克隆抗体细 胞株。阳性率达100 %的单克隆细胞株再经24孔培养板及小方瓶进行扩大培养，冻存备用。
[0084] (4)抗多氯联苯单体PCB37的单克隆抗体的大量制备
[0085] 采用腹水生产法制备抗多氯联苯单体PCB37的单克隆抗体。在豚鼠腹腔中注射 硅胶H，每只5mg。一周后在豚鼠腹腔接种含抗多氯联苯PCB37单克隆抗体的杂交瘤细胞， I X106/mL/只。豚鼠腹腔接种杂交瘤细胞10d后豚鼠腹部明显膨大，收集腹水，在3500r/ min下离心20min，收集上清液得到淡黄色含抗多氯联苯PCB37单克隆抗体的腹水，-20°C保 存备用。
[0086] 实施例4抗多氯联苯单体PCB37的单克降抗体的纯化
[0087] 采用辛酸-硫酸铵沉淀法和DEAE纤维素离子交换层析法结合纯化豚鼠含抗多氯 联苯PCB37单克隆抗体的腹水，具体步骤如下：取lmL腹水至小烧杯中，加入2mL0. 06mol/ L，pH为5. 0的醋酸缓冲液，再用lmol/L的盐酸调pH至4. 8 ;在室温下边搅拌边逐滴加入 II yL辛酸，轻轻振荡30min，在4°C低温条件下5000r/min离心30min，弃沉淀，收集上清 液，然后用lmol/L的氢氧化钠调pH至7左右；随后缓慢加入等量的饱和硫酸铵溶液，轻轻 混匀后在4°C下静置2h;再重复离心一次，弃上清液，将沉淀溶于lmLPBS中，转入透析袋， 以PBS为透析液透析3d，每天换液3-4次，直至全部NH4+被除去为止（有NH4+存在时，加入 奈氏试剂则产生黄色沉淀）。若透析后有少量不溶沉淀，则离心去除，最后得到纯化后的抗 多氯联苯PCB37单克隆抗体，分装保存于-20°C。
[0088] 实施例5抗多氯联苯单体PCB37的单克降抗体的表征
[0089] ⑴间接ELISA检测抗体效价
[0090] 具体实验步骤如下，将PCBs的包被原（PCB37半抗原-0VA)分别用CBS稀释至适当 浓度，加入96孔酶标板中，100yL/孔，4°C下包被过夜；包被后的酶标板中加入洗涤液以洗 去游离的包被原，200yL/孔，震荡3min后甩干，洗3遍，然后加入0. 5%的明胶封闭液（1 % 的BSA)，200yL/孔，37°C下封闭lh;倒掉封闭液，用洗涤液洗3遍甩干，加入100yL抗血 清，阴性对照孔中加入空白兔（小鼠）的抗血清，空白对照加入稀释液PBS，37°C下温育lh; 酶标板洗三遍后加入1:1000稀释的二抗羊抗兔IgG-HRP(羊抗小鼠IgG-HRP)，100yL/孔， 37°C下温育lh;用洗涤液洗板5次并甩干，加入新鲜配制的显色液，100yL/孔，室温下反应 15min;加入2molL1的硫酸终止液，50yL/孔，然后用酶标仪测定每孔在450nm和630nm 处的吸光度（0D值），以0D= 0D45Q-0D63。为最终读数；计算每孔的P/N值，P/N= (0D-0D空 eV(〇D_ _0Dse )，以P/N值大于或等于2. 1的孔所对应的抗血清最大稀释倍数为该抗血 清的效价。实际过程中测定抗多氯联苯单体PCB37的单克隆抗体的效价为1:640000。
[0091] (2)抗体蛋白含量的测定
[0092] 用752型紫外分光光度计测定盐析和除盐后所得抗体在280nm和260nm处的吸收 值A280和A260,采用A280nm和A260nm光吸收差法计算抗体IgG含量。透析后的溶液经过 冷冻干燥，分装低温保存。蛋白含量（mg/mL) = (1.45XA2S。一0. 74XA26。）。实际过程中测 定纯化后抗多氯联苯单体PCB37的单克隆抗体的蛋白浓度为5. 14mgmLi。
[0093] (3)抗体特异性分析
[0094] 为考察所获得的单克隆抗体的特异性，分别用苯，二氯苯，氯苯，PCB8,PCB12， PCB15，PCB28，PCB29，PCB37，PCB77，Aroclor1242,Aroclor1248,Aroclor1254,Aroclor 1260作为抗体与包被原的竞争物，用间接ELISA分别测定其对本发明制备的抗多氯联苯 PCB37单克隆抗体的交叉反应率。计算方法为，CR(%) = (1(：5/)八1(：5。8)\100，其中1(：5(^ 为PCBs的IC5。，IC5(]B为其他物质对应的IC5。。
[0095] 抗PCB37单克隆抗体的特异性如表3所示，抗体对以低氯联苯为主的Aroclor 1242,Aroclor1248交叉反应率较大，分别为5. 38%，4. 60%，对其他物质的交叉反应率均 低于5 %，这表明该抗体具有较好的特异性，且和抗PCB37多克隆抗体相比，该抗体的特异 性更强。
[0096] 表3抗PCB37单克隆抗体和抗PCB37多克隆抗体对其他物质的交叉反应率的对比 分析
[0097]
[0098] 实施例6抗多氯联苯单体PCB37的单克降抗体的应用
[0099] 本发明制备的抗多氯联苯单体PCB37的单克隆抗体，主要应用在环境中多氯联苯 单体PCB37的免疫检测中。它的主要用途之一，就是在此基础上建立基于实时荧光定量PCR 的间接竞争生物条形码方法测定多氯联苯单体PCB37的免疫测定方法。
[0100] 基于实时荧光定量PCR的间接竞争生物条形码方法测定多氯联苯单体PCB37的 具体步骤如下：为了增强PCR管的吸附性，用0. 8%的戊二醛对PCR管进行预处理，每孔加 入20yL戊二醛溶液，37°C下温育6h，然后用超纯水洗涤3次，甩干备用；用包被缓冲液将 PCB37包被原稀释至适当浓度，加入PCR管中进行包被，每孔20yL，4°C下包被过夜；倒掉包 被原，每孔加入200yL洗涤液进行洗涤，振荡3min后甩干，洗三遍后加入200yL封闭液， 37°C下温育lh;洗板三次，将抗体稀释至适当浓度，每孔加入10yL抗体及10yL样品，空 白对照孔中加入2〇1^?85,37°(：下温育111;洗板三次并甩干，用含5%脱脂奶粉的？85将 GNPs探针稀