检测呋喃唑酮代谢物的单抗、elisa方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽药残留分析技术领域，具体涉及一种检测呋喃唑酮代谢物的单克隆 抗体（单抗），ELISA(酶联免疫）方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 呋喃唑酮属于硝基呋喃类药物，因其内服后难吸收，肠中浓度高而血中浓度低，故 适用于各种肠道感染的治疗。该类药物对畜禽有一定毒性，大剂量或长期连续使用，易出现 毒性反应，表现为厌食、腹泻、胃肠出血、周围神经炎、兴奋、惊厥、瘫痪等，中毒严重时可引 起动物死亡。呋喃唑酮在体内代谢迅速，其代谢产物3-氨基-2-恶唑烷酮（A0Z)能与蛋白 质结合，形成比原药化合物更稳定的蛋白结合物。这些代谢物可以在弱酸性条件下从蛋白 质中释放出来，因此当人类吃了含有硝基呋喃类抗生素残留的食品，这些代谢物就可以在 人类胃液的酸性条件下从蛋白质中释放出来被人体吸收而对人类健康造成危害。欧盟已于 1995年禁止在食用动物中使用硝基呋喃类抗生素，我国也于2002年颁布了禁止使用硝基 呋喃类抗生素的禁令。
[0003] 为确保动物源性食品的安全和对外出口贸易的发展，建立准确可靠，灵敏度高的 定性定量方法是十分必要的。在最初的时候多数国家对呋喃唑酮的监控是通过检测原形药 物的残留，由于原形药物的不稳定性和检测监控的困难，研究员开始着手研究和寻找能够 代替原形药物进行检测的残留标示物。2000年，欧委会提出了要要发展两种不同类型的筛 选试验和一种确证试验来提高欧盟各药残实验室的检测和监控能力。于是，酶联免疫吸附 试验（ELISA)方法诞生，并以其高通量、高灵敏度、低检测限、操作简单、耗费少的诸多优点 被普及到残留检测的筛选工作。
[0004] 2004年，Cooper等设计出A0Z半抗原，得到第一株多克隆抗体，采用直接ELISA 方法对衍生物进行特异性检测，最低检测限为0. 1yg/kg，定量限0. 4yg/kg。2005年， Diblikova等用相同的半抗原免疫小鼠，获得A0Z特异性单克隆抗体，用于动物组织中AOZ 残留的检测，检测限为0. 3yg/kg，与LC-MS/MS对A0Z的检测结果有高度相关性。2008 年，常超等对鱼、猪、鸡组织用苯甲醛作为衍生介质，将A0Z衍生成为N-苯亚甲基-3-氨 基-2-噁唑烷酮，用间接ELISA方法进行检测，用磷酸盐缓冲液做标准曲线进行回归分析， 得到组织检测限均小于0. 5yg/kg。
[0005] 呋喃唑酮残留检测的仪器方法日臻成熟，LC-MS/MS的应用大大提高了检测灵敏 度，通常将其作为确证手段。ELISA试剂盒基于抗原抗体的特异性结合反应，具有常规理化 分析技术无可比拟的高选择性和高灵敏度等特点，非常适于基质复杂、痕量残留的分析，是 理想的残留筛选分析方法之一，是目前世界各国推行并实施的高通量筛选方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种能识别呋喃唑酮代谢物的单克 隆抗体，利用该单克隆抗体，建立一种能呋喃唑酮代谢物（A0Z)残留检测的ELISA(酶联免 疫方法）及试剂盒与应用。
[0007] 本发明通过以下技术方案实现：
[0008] 申请人通过制备，得到一种能够识别呋喃唑酮代谢物（A0Z)的单克隆抗体，它是 由保藏号为CCTCCNO:C2015129的杂交瘤细胞株SC20150701A所分泌的，该杂交瘤细胞株 被命名为杂交瘤细胞株SC20150701A，于2015年7月20日送交中国.武汉.武汉大学中国 典型培养物保藏中心（CCTCC)保藏，保藏号为CCTCCN0:C2015129。
[0009] 进一步，本发明提出了一种适用于呋喃唑酮代谢物（A0Z)残留检测的酶联免疫方 法（ELISA)，该方法包括半抗原、免疫原、包被原和抗体的制备以及样品的处理和检测等步 骤，本发明的具体步骤如下所述：
[0010] ⑴将呋喃唑酮代谢物（A0Z)进行衍生制备得到半抗原CNPA0Z和CPA0Z;
[0011] ⑵将半抗原CNPA0Z与血蓝蛋白（KLH购于sigma公司）偶联得到免疫原；
[0012] ⑶将半抗原CPA0Z与牛血清白蛋白（BSA)偶联得到包被原；
[0013] ⑷利用步骤⑵所述的免疫原制备能分泌识别呋喃唑酮代谢物的单克隆抗体的抗 A0Z杂交瘤细胞SC20150701A;
[0014] ⑶用步骤（3)的包被原包被固相载体（即，酶标板）；
[0015] (6)将待检的样品前进行处理后得到待测物并进行酶联免疫检测。
[0016] 基于上述检测方法，本发明提供了一种包含保藏号为CCTCCNO:C2015129的抗 A0Z杂交瘤细胞SC20150701A所分泌的单克隆抗体的ELISA试剂盒。
[0017] 所述的试剂盒是检测水产品中呋喃唑酮代谢物的ELISA试剂盒。
[0018] 发明人以上述单克隆抗体和包被原作为核心试剂与常规的其他试剂，对酶联免疫 方法进行了验证，实现了本发明的目的，从而完成了本发明。
[0019] 本发明制备的单克隆抗体可在制备检测水产品中呋喃唑酮代谢物的ELISA试剂 盒中应用。
[0020] 本发明制备的的杂交瘤细胞SC20150701A可在制备检测水产品中呋喃唑酮代谢 物的ELISA试剂盒中应用。
[0021 ] 本发明制备的试剂盒可在检测水产品中呋喃唑酮代谢物残留分析中应用。
[0022] 本发明的主要优点是：
[0023] (1)本发明制备的单克隆抗体亲和力高，特异性强。
[0024] (2)本发明建立的酶联免疫方法（ELISA)简便，易操作，而且灵敏度高，准确度和 精密度好。
[0025] 更详细的技术方案如实施例所述。
【附图说明】
[0026] 图1 :本发明制备的CNPA0Z-KLH免疫原的紫外扫描图谱。
[0027] 图2 :本发明制备的CPA0Z-BSA包被原的紫外扫描图谱。
[0028] 图3 :以A0Z为标准品建立的间接竞争ELISA反应标准曲线图，附图标记说明：X轴 为A0Z标准溶液浓度对数值，Y轴为A0Z标准品溶液的光密度值除以"零"孔光密度值（B/ B0) 〇
【具体实施方式】
[0029] 下面通过实施例对本发明作进一步说明。
[0030] 实施例1免疫原和包被原的制备
[0031] 取lg呋喃唑酮代谢物（A0Z)、1.65g5-羟基-2硝基-苯甲醛，用无水乙醇使之 溶解，室温下搅拌反应5h，4°C冰箱静置过夜，过滤，用N，N-二甲基甲酰胺（DMF)溶解，加入 100mg的NaOH，缓慢滴加4-溴丁酸乙酯600mg;待反应结束后，加入7K，用乙酸乙酯萃取，合 并有机相，过滤，滤液蒸干后加入少量的DMF使之溶解之后，加入INNaOH40mL，室温下搅 拌反应2h，将反应液用HCL调pH= 3,过滤，即得半抗原CNPA0Z，其结构式如下所示：
[0032]
[0033] 取0. 2gA0Z，用2mL左右的甲醇于室温下搅拌使之溶解；取0. 15g3-羧基苯甲醛， 用2mL甲醇使之溶解，在搅拌下缓慢滴入上述A0Z溶液中，室温下搅拌反应5h，过滤，烘干滤 渣即得CPA0Z，其结构式如下所示：
[0034]
[0035] 取半抗原CNPAOZ10mg，二环己基碳二亚胺（DCC) 8mg，N-羟基丁二酰亚胺 (NHS) 5mg，DMFlmL使之溶解，室温搅拌反应24h，之后离心取上清缓慢滴加到KLH溶液（5mg 血蓝蛋白溶解于5mL蒸馏水中）中4°C反应24h。磷酸盐缓冲液（简称PBS，配制方法：准 确称取NaCl8. 00g，KH2P04 0? 20g，Na2HP04 ? 12H20 2. 90g，KC1 0? 20g，少量去离子水溶解， 定容至lOOOmL)透析5d即得免疫原CNPA0Z-KLH。
[0036] 取半抗原CPA0Z8mg，DCC8mg，NHS5mg，DMFlmL使之溶解，室温搅拌反应24h，之 后离心取上清缓慢滴加到20mg的牛血清白蛋白（BSA)溶液中于4°C反应24h。用磷酸盐缓 冲液透析5d即得包被原CPA0Z-BSA。
[0037] 实施例2单克隆抗体的制备
[0038] 2.1小鼠免疫
[0039] 以实施例1制备的CNPA0Z-KLH偶联物为免疫原，免疫Balb/C雌性小鼠（购自湖 北省疾病预防控制中心）。首次免疫时用与等体积的弗氏完全佐剂乳化的含50yg免疫原 的蛋白乳液注射于小鼠的颈背部皮下进行基础免疫，以后每隔15天用弗氏不完全佐剂乳 化的含50yg免疫原的蛋白乳液加强免疫。从第三次免疫起，每次免疫后第7天采小鼠的 尾血，分离血清，用常用的间接ELISA法（参照董国伟和刘贤进，2001报道的方法）检测血 清抗体效价。
[0040] 2. 2细胞融合与筛选
[0041] 在融合前3天给免疫合格的小鼠腹腔注射100yg免疫原CNPA0Z-KLH强化免疫。 根据骨髓瘤细胞的计数结果，取骨髓瘤细胞与免疫脾细胞混合；以1500r/min离心5min，将 离心管上清倒尽后，倒扣在吸水纸上，控干水滴；将吸有lmL预温至37°C的50%聚乙二醇 (PEG)的lmL刻度吸管插入到管底，缓缓加PEG到混合细胞上，边加边轻轻搅拌，加完后静置 90sec，用预温至37°C的RPMI- 1640基础培养液（购于Hyclone公司）沿管壁缓缓加到融 合细胞上，边加边轻轻晃动离心管，加完后拧紧盖，缓慢颠倒几次，混匀；以1500r/min离心 5min，弃去上清，用含有饲养细胞的HAT完全培养基（购于Hyclone公司）轻轻将融合细胞 搅拌重悬。将融合细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，置于C02培养箱中培养。根据细胞 的生长情况，取细胞培养上清，以发明人制备的CPA0Z-BSA偶联物为包被原，利用ELISA方 法筛选出分泌A0Z抗体的阳性细胞孔。对筛选出来的阳性细胞孔利用有限稀释法克隆化， 最终建立得到一株稳定的分泌且能够识别呋喃唑酮代谢物（A0Z)的单克隆抗体的杂交瘤 细胞，申请人将该杂交瘤细胞命名为抗A0Z杂交瘤细胞SC20150701A，于2015年7月20日 送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC)保藏，保藏号为CCTCCN0: C2015129〇
[0042] 2. 3腹水制备与鉴定
[0043] 在接种前7天取Balb