一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽用生物制品技术领域，具体设及一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的 方法。
【背景技术】
[0002] 新城疫和禽流感是当今全球范围内最流行的家禽传染病，也是我国所有鸡病中危 害最大的两种疾病。二联疫苗的制备，可W-针防治两种传染病，同时可W解决使用多种疫 苗分次免疫，造成的鸡群的其它的不良反应，简化免疫程序，降低投入的成本。当前国内生 产的新城疫、禽流感二联灭活疫苗基本都是采用鸡胚接种病毒后进行增殖，收获尿囊液制 备而成。传统的二联疫苗均由单一疫苗分别生产后混合在一起制成二联疫苗，该工艺费时 费力，生产成本较高。同胚培养是近年来兽用生物制品行业提出的生产工艺，即将两种病毒 W合适的比例混合后同时接种到鸡胚中进行增殖，该工艺减少了生产工艺环节，缩短的生 产周期，减少人力物力投入，大大降低了生产成本。但是截至到目前为止同胚培养的工艺仍 存在缺陷，特别是鸡新城疫、禽流感的同胚培养，培养过程中由于病毒之间的互相干扰，两 种病毒的含量均不稳定，批次间差异较大，困扰着该品种的生产，严重影响了后期疫苗的品 质。
[0003] 氨基酸，是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质 的基本物质。维生素是维持机体生命活动必须的一类有机物质，也是保持机体健康的重要 活性物质。维生素是酶的辅酶或者是辅酶的组成分子，维生素是维持和调节机体正常代谢 的重要物质。在体内砸和维生素E协同，能够保护细胞膜，防止不饱和脂肪酸的氧化。
[0004] 多糖是中药活性成分之一，大量研究表明，多糖及糖复合物在生物体内不仅是作 为能量资源和构成材料，更重要的是它存在于一切细胞膜结构中，参与生命现象中细胞的 各种活动。多糖类物质是所有生命有机体的重要组成部分，具有清除自由基、提高抗氧化酶 活性和抑制脂质过氧化的能力。但是中药多糖的作用并不具有广谱性，同常某种或某几种 多糖协同作用具有特异性的活性作用。
[0005] 本发明基于上述技术背景，提出一种同胚培养的方法及其应用，具体是一种特别 适用于鸡新城疫、禽流感病毒同胚培养的方法及其应用，解决了新城疫病毒、禽流感病毒 同胚培养稳定性差、批次间差异大的培养难题，提高了两种病毒的稳定性、收获量和病毒滴 度。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种鸡新城疫、禽流感病 毒同胚培养的方法的技术方案，通过该方法，可同时提高两种病毒的稳定性、收获量和病毒 滴度。
[0007] 所述的一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于采用鸡新城疫、禽流感 特异性病毒稀释液稀释新城疫病毒至1000-5000倍，稀释禽流感病毒至5000-10000倍，分 别在4°C解育30-60分钟后按1:1比例混合均匀，接种9-10日龄鸡胚，0. 1-0. 15ml/胚， 36-37°C继续培养至96小时，弃去48小时前死亡鸡胚，收获48-96小时死活胚液，既得鸡新 城疫病毒、禽流感病毒混合病毒液。
[0008] 所述的一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于所述的鸡新城疫、禽流 感特异性病毒稀释液为每1000ml憐酸缓冲液中含有W下重量配比的组分：氨基酸组合2~ 4g、维生素组合3~6g、亚砸酸钢0~lOmg和复方中药多糖20~50g; 所述的氨基酸组合包括天冬氨酸、脯氨酸和谷氨酷胺； 所述的维生素组合包括维生素B1、维生素B3和维生素B7 ; 所述的复方中药多糖由海藻、地肤子、桑叶、牵牛子和丹参提取得到。
[0009] 所述的一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于该稀释液的抑为 7. 0 ~7. 2。
[0010] 所述的一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于所述的憐酸缓冲液由 氯化钢6~lOg，氯化钟0. 05~0. 5g，憐酸氨二钢1~1. 2g，憐酸二氨钟0. 05~0. 5g，氯 化巧0. 05~0. 2g，含6个结晶水的氯化儀0. 05~0. 2g溶于1000ml双蒸水中得到。
[0011] 所述的一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于所述的氨基酸组合中 含有：天冬氨酸20~50%、脯氨酸20~40%和谷氨酷胺10~60%，优选为天冬氨酸30~ 40%、脯氨酸25~35%和谷氨酷胺30~40%。
[0012] 所述的一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于所述的维生素组合中 含有：维生素B1 15~35%、维生素B3 20~50%和维生素B7 20~50%，优选为维生素B1 20~30%、维生素B3 30~40%和维生素B7 35~45〇/〇。
[0013] 所述的一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于所述的复方中药多糖 按W下步骤制得： a、 按海藻20~40份、地肤子5~20份、桑叶10~30份、牵牛子5~20份和丹参10~ 30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴 至90°C，并保持在90°C，熬制2小时，熬制过程中每10分钟揽拌一次； b、 弃去a中药渣，收集药液，室溫冷却后经1000化pm离屯、10分钟，弃去沉淀，收集上 清； C、将b中上清进行醇沉，沉淀得到粗制中药多糖； t用灭菌纯化水洗涂C中粗制中药多糖，洗涂后用20倍量的42°C灭菌纯化水进行溶 解，溶解后，按0. 5%比例加入活性炭4°C吸附过夜，吸附后经1000化pm离屯、10分钟，弃去沉 淀，收集上清； e、 将d中上清液进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液； f、 将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥制得复合中药多糖冻干粉。
[0014] 所述的一种鸡新城疫、禽流感同胚培养的方法，其特征在于所述的鸡新城疫、禽流 感特异性病毒稀释液通过W下步骤制得： 1) 憐酸缓冲溶液的配制：按比例称取氯化钢、氯化钟、憐酸氨二钢、憐酸二氨钟、氯化 巧、含6个结晶水的氯化儀溶于双蒸水中，无菌条件下通过0. 22μm滤膜，过滤除菌备用； 2) 复方中药多糖的制备 a、按比例称取海藻、地肤子、桑叶、牵牛子和丹参，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加 入原料重量15倍的纯化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小时，熬制过程中每10分 钟揽拌一次； b、弃去a中药渣，收集药液，室溫冷却后经1000化pm离屯、10分钟，弃去沉淀，收集上 清； C、将b中上清进行醇沉，沉淀得到粗制中药多糖； t用灭菌纯化水洗涂C中粗制中药多糖，洗涂后用20倍量的42°C灭菌纯化水进行溶 解，溶解后，按0. 5%比例加入活性炭4°C吸附过夜，吸附后经1000化pm离屯、10分钟，弃去沉 淀，收集上清； e、 将d中上清液进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液； f、 将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥制得复合中药多糖冻干粉； 3)接种鸡胚用病毒稀释液配制：按比例称取氨基酸组合、维生素组合、复方中药多糖和 亚砸酸钢，溶解于步骤1)制得的憐酸缓冲溶液中，充分混匀，用酸或碱调节抑至6. 6~7. 0 之间，无菌条件下通过0. 22μm滤膜，过滤除菌后置4°C保存备用。
[0015] 本发明具有积极有益的效果： (1)本发明所制备的稀释液，可接种低日龄鸡胚，因低日龄鸡胚组织分化程度较低，与 现有技术相比，病毒更易在鸡胚组织中增殖。
[0016] (2)本发明所制备的稀释液接种鸡胚后，可提高鸡胚耐受病毒的能力，延长死亡时 间，即延长了病毒增殖时间，与现有技术相比提高了病毒滴度2~8倍。
[0017] (3)按本发明方法培养收获的病毒液提高了同胚培养的稳定性，大大降低了批次 间差异，为后续疫苗生产工艺提供了优质的抗原液。