Hsv-1和hsv-2疫苗和其使用方法

专利名称：Hsv-1和hsv-2疫苗和其使用方法
技术领域：
本发明提供向个体接种疫苗以对抗单纯疱疹病毒(HSV)感染和与其有关的病症 和症状、和在个体中阻止下列病状、抑制下列病状、降低下列病状的发生率和阻抑下 列病状的方法HSV感染、神经元病毒扩散、带状疱疹样损伤形成、疱疹性眼睛疾 病、疱疹介导的脑炎和生殖器溃疡疾病，所述方法包含使所述个体与HSV突变体菌 株接触的步骤，所述HSV突变体菌株在编码gE、 gl、 Us9或其它蛋白质的基因中含 有失活突变、任选地在编码gD的基因中含有失活突变。
背景技术：
人类I型或II型单纯疱疹病毒(HSV)感染通常是通过密切接触获得并造成口腔和 生殖器损伤。HSV-1通常导致口腔溃疡且HSV-2通常导致生殖器溃疡，但相反的情 况也会发生。感染HSV-l或HSV-2的人将永远是此病毒的携带者。在最初感染后， 损伤痊愈且HSV以休眠潜伏状态存在于感觉神经元中。HSV周期性地自潜伏受感染 的神经元复活并导致在皮肤表面上形成新溃疡。新生婴儿和免疫抑制个体尤其易受 HSV感染攻击，通常会导致弥散性感染并具有致命后果。眼睛HSV感染是此病毒的 另一种严重后果，其是失明的最主要原因。此外，生殖器HSV感染使得HIV传播速 率增加两倍。因此，迫切需要阻止HSV传播的疫苗。

发明内容
本发明提供向个体接种疫苗以对抗单纯疱疹病毒(HSV)感染和与其有关的病症 和症状、和在个体中阻止下列病状、抑制下列病状、降低下列病状的发生率和阻抑下 列病状的方法HSV感染、神经元病毒扩散、带状疱疹样损伤形成、疱疹性眼睛疾 病、疱疹介导的脑炎和生殖器溃疡疾病，所述方法包含使所述个体与HSV突变体菌 株接触的步骤，所述HSV突变体菌株在编码gE、 gl、 Us9或其它蛋白质的基因中含 有失活突变。
在另一实施例中，本发明提供在个体中治疗单纯疱疹病毒(HSV)感染、减少其发病、改善其症状、改善其继发性症状、降低其发生率、延长至其复发的潜伏期的方法， 所述方法包含使所述个体与包含突变体单纯疱疹病毒疫苗菌株的组合物接触的步骤， 其中所述突变体HSV疫苗菌株在Us8基因中包含失活突变。在一个实施例中，突变 体HSV疫苗菌株是HSV-Li汰，—而在另一实施例中，突变体HSV疫苗菌株是HSV-2 菌株。在一个实施例中，HSV感染是HSV-1感染，而在另一实施例中，HSV感染是 HSV-2感染。
在一个实施例中，突变体菌株在所述个体的皮肤组织中具有复制能力。在一个实 施例中，所述突变体菌株的神经元病毒扩散被阻止。
在一个实施例中，所述突变体HSV疫苗菌株在Us7基因中、或在另一实施例中 于Us9基因中、或在另一实施例中于Us7和Us9基因二者中进一步包含额外失活突 变。在一个实施例中，所述突变体HSV疫苗菌株在编码病毒入侵不需要的膜蛋白质 的基因中进一步包含额外失活突变，所述基因在一个实施例中是Us5，在另一实施例 中是Us4，在另一实施例中是UL53，在另一实施例中是ULIO，或在另一实施例中是 Us5、 Us4、 UL53、和UL10的任何组合。在一个实施例中，所述突变体HSV疫苗菌 株在编码病毒入侵所需要的膜蛋白质的基因中进一步包含额外失活突变，所述基因在 一个实施例中是Us6。
在一个实施例中，HSV感染是生殖器HSV感染，而在另一实施例中，HSV感染 是HSV脑炎，而在另一实施例中，HSV感染是眼睛疾病，而在另一实施例中，HSV 感染是唇部HSV感染，而在另一实施例中，HSV感染是上述的任何组合。
在一个实施例中，个体已感染HSV，而在另一实施例中，个体具有感染HSV的 风险，所述个体在一个实施例中是新生儿个体，在另一实施例中是免疫受损个体，在 另一实施例中是老年个体，且在另一实施例中是免疫受损新生儿或免疫受损老年个 体。
在一个实施例中，所述方法在个体中诱导抗HSV免疫应答，所述免疫应答在一 个实施例中是抗HSV中和抗体应答。
在一个实施例中，接触步骤包含表皮注射，在另一实施例中包含肌内注射，在另
一实施例中包含皮下注射，且在另一实施例中包含呼吸系统内粘膜注射。
在一个实施例中，本发明提供在编码gE蛋白质的基因中包含第一失活突变且包 含第二失活突变的经分离突变体HSV-1菌株。在另一实施例中，编码gE蛋白质的基 因是Us8基因。在另一实施例中，第二失活突变是在Us7基因中。在另一实施例中， 第二失活突变是在Us9基因中。在另一实施例中，第二失活突变是在业内已知的任何 其它HSV-1基因中。在另一实施例中，经分离突变体HSV-l菌株在编码gE蛋白质、 gl蛋白质、和Us9蛋白质的基因中含有失活突变。
在另一实施例中，本发明提供在编码gE蛋白质的基因中包含第一失活突变且包 含一或多种额外失活突变的经分离突变体HSV-2菌株。在一个实施例中，编码gE蛋 白质的基因是Us8基因。在一个实施例中，额外失活突变是在病毒入侵不需要的膜蛋白质中。在另一实施例中，额外失活突变是在Us7基因中。在另一实施例中，额外失 活突变是在Us9基因中。在另一实施例中，额外失活突变是在Us5、 Us4、 UL53、 UL10 或其组合中。在一个实施例中，额外失活突变是在病毒入侵所需要的膜蛋白质中。在 另一实施例中， 卜-失活突变是在118—6中i在另一实施例中，额外失活突变是在业内 已知的任何其它HSV-2基因中。在另一实施例中，经分离突变体HSV-2菌株在编码 gE蛋白质、gl蛋白质、和Us9蛋白质的基因中含有失活突变。


图l.HSV在神经元中扩散。
图2.小鼠侧腹的典型HSV-1感染。
图3.小鼠侧腹/疫苗接种模型中的皮肤疾病谱。
图4.感染HSV-1 (gE无效)疫苗或有毒HSV-1 (a救gE无效)后小鼠的存活。
图5.感染HSV-1
(gE无效) 疫苗或有毒HSV-1 (拯救gE无效) 后的原发性皮肤疾病。 图6.感染HSV-l(gE无效)疫苗或有毒HSV-1 (超救gE无效)后的继发性(带状疱疹样) 皮肤疾病。
图7.在感染疫苗或有毒HSV-1后皮肤中的病毒滴度。 图8.在感染疫苗或野生型HSV-1后皮肤中的HSV检测。 图9.在感染疫苗或有毒HSV-1后背根神经节(DRG)中的病毒滴度。 图10.用10SpfuWTHSV-l(NS)攻击后接种疫苗或模拟接种疫苗小鼠的存活。 图11.用105pfuWTHSV-1 (NS)攻击的接种疫苗小鼠中的原发性皮肤疾病评分。 图12.用105 pfuWT HSV-1 (NS)攻击的接种疫苗小鼠皮肤中的病毒滴度。 图13.用105 pfu WT HSV-1 (NS)攻击的模拟接种疫苗或接种疫苗小鼠皮肤中的 HSV检测。
图14.用105 pfu WT HSV-1 (NS)攻击的接种疫苗小鼠中的继发性皮肤疾病。
N=3。
图15.用105 pfu WT HSV-1 (NS)攻击的模拟接种疫苗或接种疫苗小鼠的神经节 病毒滴度。N=3。
图16.疫苗保护神经节免于潜伏感染。
图17.接种5xl05 pfu HSV-lAgE疫苗对小鼠对抗105 pfu HSV-2(2.12)侧腹攻击的 交叉保护。"Mock Vac"表示模拟接种疫苗；"DgEVac"表示接种5xlC)5pfuHSV4 AgE疫苗。误差棒代表平均值的标准误差("SEM")。
图18.接种5 x 105 pfu HSV-lAgE疫苗对小鼠对抗5 x 105 pfu HSV-1 (KOS)侧腹 攻击后潜伏的保护。误差棒代表SEM。
图19.接种5 x 105 pfu HSV-lAgE疫苗对小鼠对抗105 pfu HSV-l(NS)阴道攻击 后死亡、明显疾病和大量病毒复制的保护。A.上图-存活曲线；下图-借助阴道擦拭物评价的病毒滴度。B.攻击后第8天小鼠的照片。误差棒SEM。
图20.通过不同途径("Ep.Scar.":表皮划痕；"SubQ":皮下；IM:肌内) 接种5 x 105 pfu HSV-lAgE疫苗对小鼠对抗105 pfu HSV-l(NS)侧腹攻击的保护。"DgE Vac"表示HSV-lAgE;误差皿表SEM。——
图21.通过不同途径接种5 x 105 pfu HSV-lAgE疫苗在小鼠中诱导中和抗体应 答。所述百分比是与来自模拟接种疫苗小鼠的血清进行比较。n-3(表皮划痕与皮下)， n=2 (肌内)， 一式两份实施分析。误差棒代表SEM。
图22.接种5 x 105 pfu HSV-lAgE疫苗对小鼠对抗105 pfu HSV-1 (NS、 F或17) 侧腹攻击的保护。误差棒代表SEM。
图23.接种5 x 105pfu HSV-1 AgE疫苗对小鼠对抗10" pfu HSV-1 (NS)侧腹攻 击的保护。误差棒代表SEM。
图24. A. HSV-1(NS) gE (SEQ ID NO: 2)与HSV-2(HG52) gE (SEQ ID NO: 6)的比 对。B.产生gE-2缺失的策略。
图25. Us区域的额外缺失。绘示HSV-2基因组(155 kb总基因组大小)Us区段 内4.5 kb区域的示意图。图中标出与HSV-lAgE疫苗菌株中缺失的区域等效的区域 和提议的额外缺失区域。
图26. A.在受感染细胞的提取物中实施蛋白质印迹法以检测gD (Us6)和gl (Us7)。 B. KOS-gDA3C病毒在活体外的稳定性。KOS或KOS-gDA3C的经PCR扩增 gD基因片段的Sspl消化。C. KOS-gDA3C突变体病毒在活体内的稳定性。将自 KOS-gDA3C感染小鼠的DRG获得的经PCR扩增gD片段用Sspl切割或不切割。
图27. KOS、 rKOS-gDA3C和KOS-gDA3C病毒至(A)非洲绿猴肾细胞(Vero)、 (B)B78-H1、 (C)A10或(D)C10细胞的入侵。结果为分别以一式三份实施的三种单独 感染的平均值+ SE。
图28.在A10 (A、 C)或C10 (B、 D)细胞中实施的KOS、 rKOS-gDA3C和 KOS-gDA3C的单步骤(A、 B)和多步骤(C、 D)生长曲线。结果为三种单独感染的平均 值+ SE。
图29.鼠科动物侧腹模型中的疾病。在接种5xl05 PFU KOS、 rKOS-gDA3C或 KOS-gDA3C的小鼠中接种位点(A)和带状疱疹样位点(B)的疾病评分。误差棒代表SE。 C.感染KOS、 rKOS-gDA3C、或KOS-gDA3C后10天拍的小鼠侧腹的照片。
图30. DRG中的病毒滴度和基因组拷贝数。将DRG自感染KOS、 rKOS-gDA3C 或KOS-gDA3C的小鼠中解剖下来并分析其病毒滴度(A)或病毒基因组拷贝数(B)。结 果代表平均值+ SE。 '
图31.先前感染KOS-gDA3C可对抗WT HSV-1攻击。结果代表感染后3-7天接 种位点(八)和带状疱疹样位点(8)的平均疾病评分+ SE。 DRG病毒滴度(C)和基因组拷 贝数(D)是在用NS攻击后5天测量。结果代表平均值+ SE。
图32. KOS-gDA3C感染的小鼠模型。KOS感染上皮细胞(E)并在接种位点处引起疾病。病毒扩散到DRG中的神经元(N)中、复制并扩散到邻近神经元中且随后传播回 皮肤中的上皮细胞中导致带状疱疹样疾病。KOS-gDA3C的入侵受损且感染较少上皮 细胞，此导致DRG中较少神经元受感染。入侵缺陷也使DRG中受感染的邻近神经元 减少并导致减少的带状疱疹样疾嵐。
具体实施例方式
本发明提供向个体接种疫苗以对抗单纯疱疹病毒(HSV)感染和与其有关的病症 和症状、和在个体中阻止下列病状、抑制下列病状、降低下列病状的发生率和阻抑下 列病状的方法HSV感染、神经元病毒扩散、带状疱疹样损伤形成、疱疹性眼睛疾 病、疱疹介导的脑炎和生殖器溃疡疾病，所述方法包含使所述个体与HSV突变体菌 株接触的步骤，所述HSV突变体菌株在编码gE、 gl、 Us9、其它蛋白质或其组合的 基因中含有失活突变。在另一实施例中，HSV突变体菌株在编码gE的基因中包含失 活突变，其在一个实施例中是gE无效突变。在另一实施例中，本发明提供包含HSV 突变体菌株的医药组合物，所述HSV突变体菌株在编码gE的基因中包含失活突变， 其在一个实施例中是gE无效突变。在另一实施例中，本发明提供包含HSV突变体菌 株的医药组合物，所述HSV突变体菌株在编码gE、 gl、 Us9、其它蛋白质或其组合 的基因中包含失活突变。
在一个实施例中，本发明提供向个体接种疫苗以对抗HSV感染的方法，其包含 使所述个体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体菌株在编码gE蛋白质的Us8 基因中含有失活突变。
在另一实施例中，本发明提供阻止个体中HSV-1感染的方法，其包含使所述个 体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体菌株在编码gE蛋白质的Us8基因中含 有失活突变。
在另一实施例中，本发明提供阻止个体中HSV-2感染的方法，其包含使所述个 体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体菌株在编码gE蛋白质的Us8基因中含 有失活突变。
在另一实施例中，本发明提供阻止个体中原发性HSV感染的方法，其包含使所 述个体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体菌株在编码gE蛋白质的Us8基因 中含有失活突变。在另一实施例中，本发明提供阻止个体中原发性HSV-1感染的方 法，其包含使所述个体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体菌株在编码gE蛋 白质的Us8基因中含有失活突变。在另一实施例中，本发明提供阻止个体中原发性 HSV-2感染的方法，其包含使所述个体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体 菌株在编码gE蛋白质的Us8基因中含有失活突变。
在一个实施例中，术语"阻止HSV感染"和"阻止原发性HSV感染"是指传染 性病毒的滴度降低909fc。在另一实施例中，滴度降低50%。在另一实施例中，滴度降低55%。在另一实施例中，滴度降低60%。在另一实施例中，滴度降低65%。在另 一实施例中，滴度降低70%。在另一实施例中，滴度降低75%。在另一实施例中，滴 度降低80%。在另一实施例中，滴度降低85%。在另一实施例中，滴度降低92%。 在另一实施例中，滴度降低95%。在另一实施例中，滴度降低96%。在另一实施例中， 滴度降低97%。在另一实施例中，滴度降低98%。在另一实施例中，滴度降低999fc。 在另一实施例中，滴度降低99%以上。
在另一实施例中，所述术语是指病毒复制程度降低90%。在另一实施例中，复 制减少50%。在另一实施例中，复制减少55%。在另一实施例中，复制减少60%。 在另一实施例中，复制减少65免。在另一实施例中，复制减少70%。在另一实施例中， 复制减少75%。在另一实施例中，复制减少80%。在另一实施例中，复制减少85%。 在另一实施例中，复制减少92%。在另一实施例中，复制减少95%。在另一实施例中， 复制减少96%。在另一实施例中，复制减少97%。在另一实施例中，复制减少98%。 在另一实施例中，复制减少99%。在另一实施例中，复制减少99%以上。
衡量HSV感染的方法已为所属领域的技术人员所熟知，且在一个实施例中包括 测定皮肤损伤和病毒介导的疾病的外观和严重程度(实例1和4)。衡量病毒感染的 其它方法实施例阐述于(例如)博格斯(BurgosJS)等人(生殖腺中经由血流具有载脂 蛋白E依赖性的I型单纯疱疹病毒感染受性别影响(Herpes simplex virus type 1 infection via the bloodstream with apolipoprotein E dependence in the gonads is influenced by gender.),病毒学期刊(J Virol.) 2005年2月；79(3):1605-12)和帕尔(Parr MB)等人 (阴道内投与II型单纯疱疹病毒至小鼠中导致数个神经和神经外位点感染 (Intravaginal administration of herpes simplex virus type 2 to mice leads to infection of several neural and extraneural sites.),神经病毒学期刊(J Neurovirol.) 2003年12月； 9(6):594-602)。测定HSV复制和HSV感染程度的其它方法充分阐述于(例如)兰 比亚斯(Lambiase A)等人(在疱疹性角膜炎动物模型中用神经生长因子实施局部治疗 (Topical treatment with nerve growth factor in an animal model of herpetic keratitis.)，格拉 芙临床与实验眼科学文献(Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol.)' 2007年5月4日)、 雷马瓦米(Ramaswamy M)等人(HSV禾fl HIV共感染中的相互影响和处理问题 (Interactions and management issues in HSV and HIV coinfection.)，抗感染治疗专家纟宗述 (ExpertRev AntiInfectTher.) 2007年4月；5(2):231-43)、和蒋(JiangC)等人(可降低 单纯疱疹病毒DNA聚合酶的持续合成因子的DNA结合、降低病毒产率、改变病毒 DNA复制的动力学、并降低DNA复制的保真度的突变(Mutations that decrease DNA binding of the processivity factor of the herpes simplex virus DNA polymerase reduce viral yield, alter the kinetics of viral DNA replication, and decrease the fidelity of DNA replication.),病毒学期刊，2007年4月；81(7):3495-502)。
依照本文，用本发明gE无效HSV菌株接种疫亩可防止随后的有毒HSV感染。 在另一实施例中，接种疫苗可防止由有毒HSV引起的疾病。在另一实施例中，疫苗菌株本身不引起明显疾病，所述疾病在一个实施例中是疱疹(实例1和4),或在另 一实施例中，疫苗菌株本身导致明显症状。
在一个实施例中，gE中的"失活突变"是指终止HSV神经元扩散的突变。在另 一实施例中，所述术语是指终止HSV的细胞至细胞扩散的突变。在另一实施例中， 所述术语是指终止沿轴突扩散。在另一实施例中，扩散是逆行性的(下文中予以定义)。 在另一实施例中，扩散是顺行性的(下文中予以定义)。在另一实施例中，顺行和逆 行方向二者的扩散均被终止。
在一个实施例中，神经元扩散降低90%。在另一实施例中，神经元扩散降低60%。 在另一实施例中，降低65%。在另一实施例中，降低70%。在另一实施例中，降低 75%。在另一实施例中，降低80%。在另一实施例中，降低85%。在另一实施例中， 降低95%。在另一实施例中，降低96%。在另一实施例中，降低97%。在另一实施 例中，降低98%。在另一实施例中，降低99%。在另一实施例中，降低99%以上。
在一个实施例中，所述术语是指终止gE蛋白质隔绝宿主抗HSV抗体的能力。 在另一实施例中，gE对抗HSV抗体的隔绝降低90%。在另一实施例中，隔绝降低50%。 在另一实施例中，降低65%。在另一实施例中，降低70%。在另一实施例中，降低 75%。在另一实施例中，降低80%。在另一实施例中，降低85%。在另一实施例中， 降低95%。在另一实施例中，降低96%。在另一实施例中，降低97%。在另一实施 例中，降低98%。在另一实施例中，降低99%。在另一实施例中，降低99%以上。
在一个实施例中，所述术语是指终止gE蛋白质结合IgG单体的能力。在另一实 施例中，gE对IgG单体的结合降低90呢。在另一实施例中，结合降低50%。在另一 实施例中，降低65%。在另一实施例中，降低70%。在另一实施例中，降低75%。 在另一实施例中，降低80%。在另一实施例中，降低85%。在另一实施例中，降低 95%。在另一实施例中，降低96%。在另一实施例中，降低97%。在另一实施例中， 降低98%。在另一实施例中，降低99%。在另一实施例中，降低99呢以上。
在一个实施例中，所述术语是指终止gE蛋白质结合IgG复合物的能力。在另一 实施例中，gE对IgG复合物的结合降低90免。在另一实施例中，结合降低50%。在 另一实施例中，降低65%。在另一实施例中，降低70%。在另一实施例中，降低75%。 在另一实施例中，降低80%。在另一实施例中，降低85%。在另一实施例中，降低 95%。在另一实施例中，降低96%。在另一实施例中，降低97%。在另一实施例中， 降低98%。在另一实施例中，降低99%。在另一实施例中，降低99呢以上。
在一个实施例中，gE中的失活突变包含缺失氨基酸124-508。在另一实施例中， gE中的失活突变包含缺失氨基酸110-500。在另一实施例中，gE中的失活突变包含 缺失氨基酸1-552。在另一实施例中，gE中的失活突变包含缺失氨基酸l-50。在另一 实施例中，gE中的失活突变包含缺失氨基酸1-100。在另一实施例中，gE中的失活 突变包含缺失氨基酸1-250。在另一实施例中，gE中的失活突变包含缺失氨基酸 100-300。在另一实施例中，gE中的失活突变包含缺失氨基酸1-400。在另一实施例
10中，gE中的失活突变包含缺失氨基酸200-500。在另一实施例中，gE中的失活突变 包含缺失氨基酸24-71。在另一实施例中，gE中的失活突变包含缺失氨基酸30-508。 在另一实施例中，gE中的失活突变包含缺失约氨基酸40-70。在另一实施例中，gE 中的失活突变包含向编码gE的基因的一部分中插入非天然序列，其中结果是所述gE 失活。在另一实施例中，gE中的失活突变包含置换氨基酸残基，例如极性残基置换 非极性残基、非极性残基置换极性残基、带电荷残基置换不带电荷残基、带正电荷残 基置换带负电荷残基、或反之亦然或其组合，此已为所属领域的技术人员所习知。在 另一实施例中，gE中的失活突变基本上由任何一种上文列示突变组成。在另一实施 例中，gE中的失活突变由任何一种上文列示突变组成。在另一实施例中，本发明对 于第一 HSV菌株所阐述的gE或其它蛋白质中的失活突变也可在第二 HSV菌株中对 应蛋白质的等效位置上突变，其中如所属领域的技术人员所熟知，插入、缺失或置换 的等效位置可通过序列比对来推断，其中与第一菌株中的突变序列匹配的区域在第二 菌株中将突变。
在一个实施例中，gD中的"失活突变"是指抑制蛋白质/受体相互作用的突变， 所述相互作用在一个实施例中是与HVEM细胞受体、连接蛋白-l细胞受体、或二者 的相互作用，且在另一实施例中，gD中的"失活突变"是指抑制病毒入侵至细胞中、 抑制gB、 gH、和gL下游激活、抑制病毒包膜与细胞膜融合或其组合的突变。在一 个实施例中，gD中的失活突变是在gD肽的氨基端，其在一个实施例中是残基1-15， 且在另一实施例中，突变可抑制当gD结合HVEM时形成发夹环结构。在另一实施例 中，突变是在氨基酸3、 38、或二者处，且在一个实施例中，这些位置上的丙氨酸和 酪氨酸残基被半胱氨酸残基代替(A3C/Y38C)以在氨基端产生3-38 二硫键和/或固定发 夹环。
在一个实施例中，本发明的失活突变是利用所属领域的技术人员所习知的手段来 达成。在一个实施例中，用于本发明和编码本发明蛋白质和用于本发明方法中的核酸 可通过例如所属领域的技术人员所熟知的任何合成或重组方法来产生。可借助所属领 域的技术人员所习知的技术对核酸实施进一步修饰以改变生物物理学或生物学特性。 例如，核酸可经修饰以增加其对核酸酶的稳定性(例如，"封端")、或改良其亲油性、 溶解性、或与互补序列的亲和性。在另一实施例中，可使用转座子来使基因失活突变， 其中在一个实施例中，转座子可为Tn551、迈诺斯(Minos)、赫耳墨斯(Hermes)或骑肩 (piggyback)。在另一实施例中，转座子可为AT-2(基于tyl的转座子，珀金埃尔默(Peridn Elmer);戴维尼(Devine)等人，(1997)基因组研究(GenomeRes.)， 7:551-563) 、 GPS-1 (新英格兰生物实验室(New England Biolabs)) 、 GPS-2(新英格兰生物实验室)、EZ::tn (基于Tn5的转座子，震中技术(Epicenter Technologies)) 、 SIF (基于Tn7的转座子， 毕尔瑞(Biery)等人，(2000)核酸研究(Nucl Acid Res) 28:1067-1077)、或Mu (芬兰酶 (Finnzymes),哈帕(Haapa)等人，(1999)核酸研究13:2777-2784)。在一个实施例中， 可利用来自各转座子突变体的经消化DNA的DNA印迹分析来证实转座子插入。在另一实施例中，可利用序列分析、PCR和/或杂交来确定转座子插入。突变也可使用 甲磺酸乙酯(EMS)或辐射来引发。在另一实施例中，可利用化学试剂诱变。在其它实 施例中，所述化学诱变剂可包含影响非复制DNA的诸如HN02和NH20H等化学品、 以及影响复制DNA的诸如吖啶类染料等试剂，已显示其可导致移码突变。使用辐射 或化学试剂产生突变体的方法已为所属领域的技术人员所熟知，且任何方法均可用于 本发明方法中(参见，例如，托马斯布鲁克(ThomasD.Brock)，生物技术工业微生 物学教程(Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology),第二版(1989)塞诺尔 协会(Sinauer Associates)公司，桑德兰(Sunderland)， MA.，或戴什潘德(Deshpande)、 穆昆德(Mukund V.)，应用生物化学与生物技术(Appl. Biochem. Biotechnol.) 36， 227 (1992))。
在一个实施例中，DNA可通过业内习知方法全部或部分自四种核苷酸化学合成。 所述方法包括阐述于卡如瑟(Caruthers) (1985年；科学(Science) 230:281-285)中者。 DNA也可通过制备重叠双链寡核苷酸、填充间隙、和将末端连接在一起来合成(通 常参见，萨姆布鲁克(Sambrook)等人(1989年；分子克隆-实验室手册(MoZecwtor CZwi^g -A Latorato 7 Ma肌aZ)，第2版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Habour Laboratory Press),纽约(New York)))。在另一实施例中，失活突变可通过位点定向诱变自野 生型DNA制备(参见，例如，左勒(Zoller)等人(1982年；DNA. 1984年12月； 3(6):479-88);左勒(1983);和左勒(1984年;DNA. 1984年12月;3(6):479-88); 麦克弗森(McPherson) (1991年；定向诱变实用方法(Directed Mutagenesis: A Practical Approach.),牛津大学出版社(Oxford University Press), NY))。可通过业内习知的 方法对所获得DNA实施扩增。 一种适宜方法是聚合酶链反应(PCR)方法，其阐述于佐 伯(Saiki)等人(1988年；科学1988年1月29日；239(4839):487-491)、穆利斯(Mullis) 等人，美国专利第4,683,195号、和萨姆布鲁克等人(1989)。
在一个实施例中，本发明提供在个体中阻止潜伏HSV感染建立的方法，其包含 使所述个体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体菌株在编码gE蛋白质的Us8 基因中含有失活突变。在另一实施例中，所预防的潜伏HSV感染在原发性HSV感染 之后。在另一实施例中，个体在接种疫苗之前已感染HSV。在另一实施例中，个体 具有HSV感染风险。在另一实施例中，无论个体在接种疫苗时是否感染HSV，通过 本发明方法接种疫苗均可有效保护个体以防原发性HSV感染之后潜伏HSV感染。
在一个实施例中，本发明提供在个体中抑制HSV突发的方法，其包含使所述个 体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体菌株在编码gE蛋白质的Us8基因中含 有失活突变。在另一实施例中，所预防的突发在个体暴露至HSV之后。在另一实施 例中，个体在接种疫苗之前已感染HSV。在另一实施例中，个体具有HSV感染风险。 在另一实施例中，无论个体在接种疫苗时是否感染HSV，通过本发明方法接种疫苗 均可有效保护个体以防个体暴露至HSV之后形成突发。
在一个实施例中，本发明提供保护个体以防HSV突发的方法，其包含使所述个体与突变体HSV菌株接触的步骤,其中突变体菌株在编码gE蛋白质的Us8基因中含 有失活突变。在另一实施例中，所预防的突发在个体暴露至HSV之后。在另一实施 例中，个体在接种疫苗之前已感染HSV。在另一实施例中，个体具有HSV感染风险。 在另一实施例中，无论个体在接种疫苗时是否感染HSV，通过本发明方法接种疫苗 均可有效保护个体以防个体暴露至HSV之后形成突发。
在一个实施例中，本发明提供降低HSV突发发生率的方法，其包含使所述个体 与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体菌株在编码gE蛋白质的Us8基因中含有 失活突变。在另一实施例中，所预防的突发在个体暴露至HSV之后。在另一实施例 中，个体在接种疫苗之前已感染HSV。在另一实施例中，个体具有HSV感染风险。 在另一实施例中，无论个体在接种疫苗时是否感染HSV，通过本发明方法接种疫苗 均可有效降低个体暴露至HSV之后的突发发生率。
在一个实施例中，本发明提供在个体中抑制HSV复发的方法，其包含使所述个 体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体菌株在编码gE蛋白质的Us8基因中含 有失活突变。在另一实施例中，所预防的复发在个体暴露至HSV之后。在另一实施 例中，个体在接种疫苗之前已感染HSV。在另一实施例中，个体具有HSV感染风险。 在另一实施例中，无论个体在接种疫苗时是否感染HSV，通过本发明方法接种疫苗 均可有效保护个体以防个体暴露至HSV之后复发。
在一个实施例中，本发明提供降低HSV复发发生率的方法，其包含使所述个体 与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体菌株在编码gE蛋白质的Us8基因中含有 失活突变。在另一实施例中，所预防的复发在个体暴露至HSV之后。在另一实施例 中，个体在接种疫苗之前已感染HSV。在另一实施例中，个体具有HSV感染风险。 在另一实施例中，无论个体在接种疫苗时是否感染HSV，通过本发明方法接种疫苗 均可有效降低个体暴露至HSV之后的复发发生率。
在另一实施例中，本发明提供在个体中阻抑HSV-1感染的方法，其包含使所述 个体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体HSV菌株在编码gE蛋白质的Us8 基因中含有失活突变。在另一实施例中，突变体HSV菌株是突变体HSV-1菌株。在 另一实施例中，突变体HSV菌株是突变体HSV-2菌株。
在另一实施例中，本发明提供在个体中阻抑HSV-2感染的方法，其包含使所述 个体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体HSV菌株在编码gE蛋白质的Us8 基因中含有失活突变。在另一实施例中，突变体HSV菌株是突变体HSV-1菌株。在 另一实施例中，突变体HSV菌株是突变体HSV-2菌株。
根据本发明的任何方法且在一个实施例中，所述个体是人类。在另一实施例中， 所述个体是鼠科动物，其在一个实施例中是小鼠，且在另一实施例中是大鼠。在另一 实施例中，所述个体是犬科动物、猫科动物、牛科动物、或猪。在另一实施例中，所 述个体是哺乳动物。在另一实施例中，所述个体是易受HSV感染的任何生物体。
在另一实施例中，本发明提供在人类个体中保护个体以防形成带状疱疹样损伤或
13类似暴发的方法，其包含使所述个体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体菌 株在编码gE蛋白质的Us8基因中含有失活突变。
在另一实施例中，本发明提供在人类个体中阻止形成HSV带状疱疹样损伤或类 似暴发的方法，其包含使所述个体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体菌株 在编码gE蛋白质的Us8基因中含有失活突变。
在另一实施例中，所阻止的带状疱疹样损伤或类似暴发在个体暴露至HSV之后。 在另一实施例中，个体在接种疫苗之前已感染HSV。在另一实施例中，个体具有HSV 感染风险。在另一实施例中，无论个体在接种疫苗时是否感染HSV，通过本发明方 法接种疫苗均可有效阻止个体暴露至HSV之后形成带状疱疹样损伤或类似暴发。
在另一实施例中，本发明提供在人类个体中阻止HSV带状疱疹样扩散或类似病 状的方法，其包含使所述个体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体菌株在编 码gE蛋白质的Us8基因中含有失活突变。在另一实施例中，所阻止的带状疱疹样扩 散或类似病状在个体暴露至HSV之后。在另一实施例中，个体在接种疫苗之前已感 染HSV。在另一实施例中，个体具有HSV感染风险。在另一实施例中，无论个体在 接种疫苗时是否感染HSV，通过本发明方法接种疫苗均可有效阻止个体暴露至HSV 之后形成带状疱疹样扩散或类似病状。
在一个实施例中，"带状疱疹样"是指HSV感染(尤其在复活感染期间)的皮肤 损伤特征，在一个实施例中，其以疹形式开始且随后在生皮节附近分布，通常以条状 或带状形式出现。在一个实施例中，疹发展成装满浆液的囊泡或小水疱。在一个实施 例中，带状疱疹样损伤是由于接触HSV而在小鼠中形成。在另一实施例中，带状疱 疹样损伤是由于接触HSV而在人类中形成。
在一个实施例中，"带状疱疹样扩散"是指HSV感染自神经节扩散到生皮节内 的继发性皮肤位点。在另一实施例中，所述术语是指在与起始感染位点相同的生皮节 内扩散。在另一实施例中，所述术语是指业内已知的"带状疱疹样扩散"的任何其它 定义。在另一实施例中，"暴发"是指疾病症状或疾病扩散或流行突然增加，且在一 个实施例中，是指带状疱疹样损伤突然增加，而在另一实施例中，"暴发"是指带状 疱疹样损伤突然出现。
在一个实施例中，本发明提供在人类个体中阻止形成生皮节损伤或类似病状的方 法，其包含使所述个体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体菌株在编码gE蛋 白质的Us8基因中含有失活突变。在另一实施例中，所阻止的生皮节损伤或类似病状 在个体暴露至HSV之后。在一个实施例中，生皮节损伤是由于接触HSV而在人类中 形成。在另一实施例中，人类中的生皮节损伤最常见地在病毒于神经节中自潜伏状态 复活时出现，且在一个实施例中，沿神经扩散，在一个实施例中，导致复发感染。在 另一实施例中，生皮节损伤是由于接触HSV而在小鼠中形成。在另一实施例中，个 体在接种疫苗之前己感染HSV。在另一实施例中，个体具有HSV感染风险。在另一 实施例中，无论个体在接种疫苗时是否感染HSV，通过本发明方法接种疫苗均可有效阻止个体暴露至HSV之后形成生皮节损伤或类似病状。
依照本文，用本发明gE无效HSV菌株接种疫苗可防止在随后感染有毒HSV后 潜伏HSV感染(实例5)和形成带状疱疹样和生皮节损伤(实例4)。在另一实施例 中，接种疫苗可防止由潜伏HSV感染引起或与其有关的疾病。在另一实施例中，接 种疫苗本身不会引起明显疾病(实例2)。
在一个实施例中，"有毒HSV"是指天然存在的HSV菌株。在另一实施例中， 所述术语是指能够引起感染的HSV菌株。在另一实施例中，所述术语是指能够建立 潜伏感染的HSV菌株。
在另一实施例中，本发明提供阻止个体中HSV神经元扩散的方法，其包含使所 述个体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体菌株在编码gE蛋白质的Us8基因 中含有失活突变。在另一实施例中，所阻止的神经元扩散在个体暴露至HSV之后。 在另一实施例中，个体在接种疫苗之前已感染HSV。在另一实施例中，个体具有HSV 感染风险。在另一实施例中，无论个体在接种疫苗时是否感染HSV，通过本发明方 法接种疫苗均可在个体暴露至HSV之后有效阻止神经元扩散。
衡量神经元HSV扩散的方法已为所属领域的技术人员所熟知，且在一个实施例 中包括测定继发性生皮节损伤的存在和程度(实例2)。衡量病毒扩散的其它方法实 施例阐述于(例如)拉贝图勒(LabetoulleM)等人(HSV1自口腔粘膜至眼睛的神经元 增殖(Neuronal propagation of HSV1 from the oral mucosa to the eye.)，目艮禾斗学石开究与视 力学(Invest Ophthalmol Vis Sci.), 2000年8月；41(9):2600-6)和汤普森(Thompson KA) 等人(在病灶疱疹性脑炎大鼠模型中皮质类固醇治疗并未使单纯疱疹复制和弥散增加 (Herpes simplex replication and dissemination is not increased by corticosteroid treatment in a rat model of focal Heipes encephalitis.),神经病毒学(J Neurovirol.), 2000年2月； 6(l):25-32)。
在一个实施例中，本发明提供降低个体中疱疹性眼睛疾病发生率的方法，其包含 使所述个体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体菌株在编码gE蛋白质的Us8 基因中含有失活突变。在另一实施例中，个体已感染HSV。在另一实施例中，个体 具有HSV感染风险。
在一个实施例中，本发明提供降低个体中疱疹性眼睛疾病严重程度的方法，其包 含使所述个体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体菌株在编码gE蛋白质的 Us8基因中含有失活突变。在另一实施例中，个体已感染HSV。在另一实施例中，个 体具有HSV感染风险。在另一实施例中，疫苗菌株来自与攻击菌株不同的物种。在 另一实施例中，疫苗菌株是与攻击菌株相同的物种。
在另一实施例中，本发明提供降低个体中HSV-1角膜感染、疱疹性角膜炎或任 何其它疱疹性眼睛疾病发生率的方法，所述方法包含向所述个体投与本发明HSV突 变体菌株由此降低个体中HSV-1角膜感染或疱疹性角膜炎发生率的步骤。在另一实 施例中，向所述个体中投与本发明HSV突变体菌株引发对抗HSV-1的免疫应答。测定疱疹性眼睛疾病、角膜感染和疱疹性角膜炎的存在和程度的方法已为所属领 域的技术人员所熟知，且阐述于(例如)拉贝图勒等人(HSV1自口腔粘膜至眼睛的 神经元增殖，眼科学研究与视力学，2000年8月；41(9):2600-6)和马任达(Majumdar
Si)(用于治疗HSV-1诱导的角膜上皮和基质角膜炎的二肽单酯更昔洛韦前药活体
夕卜禾卩活体内评价(Dipeptide monoester ganciclovir prodrugs for treating HSV-l-induced corneal epithelial and stromal keratitis: in vitro and in vivo evaluations.),目艮目青药i里学与治 疗学期刊(J Ocul Pharmacol Ther.)， 2005年12月;21(6):463-74)。
在一个实施例中，本发明提供降低个体中生殖器溃疡疾病发生率的方法，其包含 使所述个体与HSV突变体菌株接触的步骤，其中突变体菌株在编码gE蛋白质的Us8 基因中含有失活突变。在另一实施例中，个体已感染HSV。在另一实施例中，个体 具有HSV感染风险。
在一个实施例中，本发明提供降低个体中生殖器溃疡疾病严重程度的方法，其包 含使所述个体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体菌株在编码gE蛋白质的 Us8基因中含有失活突变。在另一实施例中，个体已感染HSV。在另一实施例中，个 体具有HSV感染风险。
在一个实施例中，生殖器溃疡疾病的特征在于在生殖器上具有溃疡性损伤。测定 生殖器溃疡疾病的存在和程度的方法己为所属领域的技术人员所熟知。
在一个实施例中，本发明提供降低个体中HSV-1介导的脑炎的发生率的方法， 其包含使所述个体与HSV突变体菌株接触的步骤，其中突变体菌株在编码gE蛋白质 的Us8基因中含有失活突变。在一个实施例中，"HSV-1脑炎"是指由HSV-1引起 的脑炎。在另一实施例中，所述术语是指与HSV-1有关的脑炎。在另一实施例中， 所述术语是指业内已知的任何其它类型HSV-1介导的脑炎。在另一实施例中，个体 已感染HSV。在另一实施例中，个体具有HSV感染风险。在另一实施例中，疫苗菌 株来自与攻击菌株不同的物种。在另 一实施例中，疫苗菌株是与攻击菌株相同的物种。
在一个实施例中，"HSV-1"是指单纯疱疹病毒l。在另一实施例中，所述术语 是指KOS菌株。在另一实施例中，所述术语是指F菌株。在另一实施例中，所述术 语是指NS菌株。在另一实施例中，所述术语是指CL101菌株。在另一实施例中，所 述术语是指"17"菌株。在另一实施例中，所述术语是指"17+syn"菌株。在另一实 施例中，所述术语是指麦金泰尔(MacIntyre)菌株。在另一实施例中，所述术语是指 MP菌株。在另一实施例中，所述术语是指HF菌株。在另一实施例中，所述术语是 指业内已知的任何其它HSV-1菌株。
在一个实施例中，"HSV-2"是指单纯疱疹病毒2。在另一实施例中，所述术语 是指HSV-2333菌株。在另一实施例中，所述术语是指2.12菌株。在另一实施例中， 所述术语是指HG52菌株。在另一实施例中，所述术语是指MS菌株。在另一实施例 中，所述术语是指186菌株。在另一实施例中，所述术语是指G菌株。在另一实施例 中，所述术语是指业内己知的任何其它HSV-2菌株。
16在另一实施例中，本发明提供降低个体中HSV-2介导的脑炎的发生率的方法， 其包含使所述个体与HSV突变体菌株接触的步骤，其中突变体菌株在编码gE蛋白质 的Us8基因中含有失活突变。在一个实施例中，"HSV-2脑炎"是指由HSV-2引起 的脑炎。在另一实施例中，所述术语是指与HSV-2有关的脑炎。在另一实施例中， 所述术语是指业内己知的任何其它类型的HSV-2介导的脑炎。在另一实施例中，个 体已感染HSV。在另一实施例中，个体具有HSV感染风险。
在一个实施例中，本发明提供降低个体中疱疹介导的脑炎的严重程度的方法，其 包含使所述个体与HSV突变体菌株接触的步骤，其中突变体菌株在编码gE蛋白质的 Us8基因中含有失活突变。在一个实施例中，个体已感染HSV。在另一实施例中，个 体具有HSV感染风险。
在一个实施例中，通过本发明方法治疗或预防的疱疹介导的脑炎是病灶疱疹性脑 炎。在另一实施例中，疱疹介导的脑炎是新生儿疱疹性脑炎。在另一实施例中，疱疹 介导的脑炎是业内已知的任何其它类型的疱疹介导的脑炎。
在一个实施例中，本发明提供降低个体中弥散性HSV感染的发生率的方法，其 包含使所述个体与HSV突变体菌株接触的步骤，其中突变体菌株在编码gE蛋白质的 Us8基因中含有失活突变。在一个实施例中，个体已感染HSV。在另一实施例中，个 体具有HSV感染风险。
在一个实施例中，本发明提供降低个体中弥散性HSV感染的严重程度的方法， 其包含使所述个体与HSV突变体菌株接触的步骤，其中突变体菌株在编码gE蛋白质 的Us8基因中含有失活突变。在另一实施例中，个体已感染HSV。在另一实施例中， 个体具有HSV感染风险。
在一个实施例中，本发明提供降低个体后代中新生儿HSV-1感染的发生率的方 法，其包含使所述个体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体HSV菌株在编码 gE蛋白质的Us8基因中含有失活突变。在一个实施例中，后代接触带有突变体HSV 菌株的个体。在另一实施例中，个体已感染HSV。在另一实施例中，个体具有HSV 感染风险。
在一个实施例中，本发明提供降低个体后代中新生儿HSV-2感染的发生率的方 法，其包含使所述个体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体HSV菌株在编码 gE蛋白质的Us8基因中含有失活突变。在一个实施例中，个体已感染HSV。在另一 实施例中，个体具有HSV感染风险。
在一个实施例中，本发明提供减少HSV-1感染自个体至其后代传播的方法，所 述方法包含使所述个体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体HSV菌株在编码 gE蛋白质的Us8基因中含有失活突变。
在一个实施例中，本发明提供减少HSV-2感染自个体至其后代传播的方法，所 述方法包含使所述个体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体HSV菌株在编码 gE蛋白质的Us8基因中含有失活突变。在一个实施例中，本发明提供减少HSV-1传播至后代的方法，所述方法包含使 所述个体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体HSV菌株在编码gE蛋白质的 Us8基因中含有失活突变。业内已知，HSV-2感染会使生殖器分泌物中的HIV-1病毒 排出增加(纳戈特(Nagot N)等人，利用阻抑单纯疱疹病毒的疗法来降低HIV-1 RNA 含量(Reduction of HIV-l RNA levels with therapy to suppress herpes simplex virus.), 新 英格兰医学杂志(NEnglJMed.)2007年2月22日；356(8):790-9)。因此，我们认为 抑制HSV-2感染的本发明方法也可有效减少HIV-1至后代的传播。在另一实施例中， 突变体HSV菌株是HSV-1菌株。在另一实施例中，突变体HSV菌株是HSV-2菌株。
在一个实施例中，本发明提供减少HSV-1传播至性伴侣的方法，所述方法包含 使所述个体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体HSV菌株在编码gE蛋白质 的Us8基因中含有失活突变。业内已知，HSV-2感染会使生殖器分泌物中的HIV-1 病毒排出增加。因此，我们认为抑制HSV-2感染的本发明方法也可有效减少HIV-1 至性伴侣的传播。在另一实施例中，突变体HSV菌株是HSV-1菌株。在另一实施例 中，突变体HSV菌株是HSV-2菌株。
在一个实施例中，本发明提供降低对HIV-1的易感染性的方法，所述方法包含 使所述个体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体HSV菌株在编码gE蛋白质 的Us8基因中含有失活突变。业内已知，HSV-2感染会使HIV-1复制增加(屋德瑞 古(Ouedraogo A)等人，在采取抗逆转录病毒疗法的女性中阻抑性疱疹疗法对生殖器 HIV-1 RNA的影响随机受控试验(Impact of suppressive herpes therapy on genital HIV匿l RNA among women taking antiretroviral therapy: a randomized controlled trial.), 艾滋病04/A5). 2006年11月28曰;20(18):2305-13)。因此，我们认为抑制HSV-2 感染的本发明方法也可有效降低对HIV-1的易感染性。在另一实施例中，突变体HSV 菌株是HSV-1菌株。在另一实施例中，突变体HSV菌株是HSV-2菌株。
在一个实施例中，本发明提供降低个体后代中新生儿HSV感染的严重程度的方 法，其包含使所述个体与HSV突变体菌株接触的步骤，其中突变体菌株在编码gE蛋 白质的Us8基因中含有失活突变。在另一实施例中，个体已感染HSV。在另一实施 例中，个体具有HSV感染风险。
在一个实施例中，本发明提供降低个体中与疱疹介导的脑炎有关的或其继发性疾 病、病症、或症状的发生率的方法，其包含使所述个体与突变体HSV菌株接触的步 骤，其中突变体菌株在编码gE蛋白质的Us8基因中含有失活突变。
在一个实施例中，本发明提供治疗个体中与疱疹介导的脑炎有关的或其继发性疾 病、病症、或症状的方法，其包含使所述个体与突变体HSV菌株接触由此治疗个体 中与疱疹介导的脑炎有关的或其继发性疾病、病症、或症状的步骤，其中突变体菌株 在编码gE蛋白质的Us8基因中含有失活突变。
在一个实施例中，所述疾病、病症、或症状是发热。在另一实施例中，所述疾病、 病症、或症状是头痛。在另一实施例中，所述疾病、病症、或症状是颈强直。在另一
18实施例中，所述疾病、病症、或症状是癲痫发作。在另一实施例中，所述疾病、病症、 或症状是部分麻痹。在另一实施例中，所述疾病、病症、或症状是木僵。在另一实施 例中，所述疾病、病症、或症状是昏迷。在另一实施例中，所述疾病、病症、或症状 是业内已知的与疱疹介导的脑炎有关的或其继发性的任何其它疾病、病症、或症状。
测定疱疹介导的脑炎的存在和严重程度的方法已为所属领域的技术人员所熟知， 且阐述于(例如)邦考斯卡(Bonkowsky JL)等人(在用促皮质素治疗婴儿痉挛症期间 单纯疱疹病毒中枢神经系统疾病复发(Herpes simplex virus central nervous system relapse during treatment of infantile spasms with corticotropin.),儿禾斗学(Pediatrics)， 2006 年5月；117(5):el045-8)和可汗(Khan OA)等人(以轻微失语症存在的疱疹性脑炎 病例报告(Herpes encephalitis presenting as mild aphasia: case report.), BMC家庭医学 (BMC Fam Pract.)， 2006年3月24日；7:22)。
在一个实施例中，本发明提供治疗个体中与HSV感染有关的疾病、病状、或症 状的方法，其包含使所述个体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体菌株在编 码gE蛋白质的Us8基因中含有失活突变。
在一个实施例中，本发明提供降低个体中与HSV感染有关的疾病、病状、或症 状的发生率的方法，其包含使所述个体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体 菌株在编码gE蛋白质的Us8基因中含有失活突变。
在一个实施例中，本发明提供治疗个体中HSV感染的继发性疾病、病状、或症 状的方法，其包含使所述个体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体菌株在编 码gE蛋白质的Us8基因中含有失活突变。
在一个实施例中，本发明提供降低个体中HSV感染的继发性疾病、病状、或症 状的发生率的方法，其包含使所述个体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体 菌株在编码gE蛋白质的Us8基因中含有失活突变。
在一个实施例中，HSV感染的继发性疾病、病症、或症状是口腔损伤。在另一 实施例中，所述疾病、病症、或症状是生殖器损伤。在另一实施例中，所述疾病、病 症、或症状是口腔溃疡。在另一实施例中，所述疾病、病症、或症状是生殖器溃疡。 在另一实施例中，所述疾病、病症、或症状是发热。在另一实施例中，所述疾病、病 症、或症状是头痛。在另一实施例中，所述疾病、病症、或症状是肌肉痛。在另一实 施例中，所述疾病、病症、或症状是腹股沟区域中腺体肿胀。在另一实施例中，所述 疾病、病症、或症状是排尿疼痛。在另一实施例中，所述疾病、病症、或症状是阴道 排出物异常。在另一实施例中，所述疾病、病症、或症状是发疱。在另一实施例中， 所述疾病、病症、或症状是流感样身体不适。在另一实施例中，所述疾病、病症、或 症状是角膜炎。在另一实施例中，所述疾病、病症、或症状是疱疹性瘭疽。在另一实 施例中，所述疾病、病症、或症状是贝尔麻痹(Bell's palsy)。在另一实施例中，所述 疾病、病症、或症状是疱疹性多形红斑。在另一实施例中，所述疾病、病症、或症状 是下背部症状(例如麻木、臀部或肛门附近区域具有麻刺感、尿潴留、便秘、和阳萎)。在另一实施例中，所述疾病、病症、或症状是局部疱疹性湿疹。在另一实施例中，所 述疾病、病症、或症状是弥散性疱疹性湿疹。在另一实施例中，所述疾病、病症、或 症状是外伤性疱疹。在另一实施例中，所述疾病、病症、或症状是疱疹性须疮。在另 一实施例中，所述疾病、病症、或症状是食管症状(例如吞咽困难或烧灼感、吞咽时 咽喉刺痛、体重减轻、吞咽时上胸中或上胸后疼痛)。在另一实施例中，所述疾病、 病症、或症状是业内已知的任何其它疾病、病症、或症状。
在一个实施例中，通过本发明方法和组合物治疗或改善的HSV感染是生殖器 HSV感染。在另一实施例中，HSV感染是口腔HSV感染。在另一实施例中，HSV 感染是眼睛HSV感染。在另一实施例中，HSV感染是皮肤病HSV感染。
在一个实施例中，HSV感染是HSV-2感染。在另一实施例中，HSV感染是HSV-1 感染。在另一实施例中，HSV感染是业内已知的任何其它类型HSV感染。
在一个实施例中，本发明提供在个体中诱导快速清除HSV-1感染的方法，其包 含使所述个体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体菌株在编码gE蛋白质的 Us8基因中含有失活突变。在另一实施例中，突变体HSV菌株是突变体HSV-1菌株。 在另一实施例中，突变体HSV菌株是突变体HSV-2菌株。
在一个实施例中，本发明提供在个体中诱导快速清除HSV-2感染的方法，其包 含使所述个体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体菌株在编码gE蛋白质的 Us8基因中含有失活突变。在另一实施例中，突变体HSV菌株是突变体HSV-1菌株。 在另一实施例中，突变体HSV菌株是突变体HSV-2菌株。
在一个实施例中，本发明提供在个体中诱导抗HSV免疫应答的方法，其包含使 所述个体与突变体HSV菌株接触由此在个体中诱导抗HSV免疫应答的步骤，其中突 变体菌株在编码gE蛋白质的Us8基因中含有失活突变。在另一实施例中，突变体HSV 菌株是突变体HSV-1菌株。在另一实施例中，突变体HSV菌株是突变体HSV-2菌株。
在一个实施例中，本发明提供在个体中诱导抗HSV中和抗体应答的方法，其包 含使所述个体与突变体HSV菌株接触的步骤，其中突变体菌株在编码gE蛋白质的 Us8基因中含有失活突变。在另一实施例中，突变体HSV菌株是突变体HSV-1菌株。 在另一实施例中，突变体HSV菌株是突变体HSV-2菌株。
在一个实施例中，本发明提供在个体中抑制唇部HSV感染的方法，其包含按照 本发明方法向个体接种疫苗以对抗HSV的步骤。
在另一实施例中，本发明提供在个体中抑制唇部HSV感染的方法，其包含按照 本发明方法阻止个体中HSV感染的步骤。
在一个实施例中，通过本发明方法和组合物诱导的免疫应答是细胞免疫应答。在 另一实施例中，免疫应答包含CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。在另一实施例中， 免疫应答包含CD4+辅助性T细胞应答。在另一实施例中，免疫应答包含体液免疫应 答。
在一个实施例中，本发明方法中突变体菌株的投与途径是经表皮。在另一实施例中，突变体菌株是通过表皮划痕或刮痕来投与。在另一实施例中，突变体菌株是经肌 内投与。在另一实施例中，突变体菌株是经皮下投与。在另一实施例中，突变体菌株 是经鼻内投与。在另一实施例中，突变体菌株是经皮投与。在另一实施例中，突变体 菌株是经阴道内投与。在另一实施例中，突变体菌株是经粘膜投与，在一个实施例中， 所述经粘膜投与是经呼吸系统内粘膜投与。在另一实施例中，突变体菌株是经鼻内投 与。在另一实施例中，突变体菌株是以气溶胶形式投与。在另一实施例中，突变体菌 株是经由业内己知的任何其它途径来投与。
在一个实施例中，本发明方法和组合物中所述HSV菌株的编码gE的基因中的 失活突变是缺失突变。在另一实施例中，失活突变是插入突变。在另一实施例中，失 活突变是置换突变。在另一实施例中，失活突变是gE无效突变。在另一实施例中， 失活突变是业内已知的任何其它类型突变。
在一个实施例中，本发明方法和组合物中所述HSV菌株的编码糖蛋白的基因中 的失活突变是缺失突变。在另一实施例中，失活突变是插入突变。在另一实施例中， 失活突变是置换突变。在另一实施例中，失活突变是无效突变。在另一实施例中，失 活突变是业内已知的任何其它类型突变。在一个实施例中，插入、缺失或置换突变包
含插入、缺失或置换单一氨基酸，而在另一实施例中，其包含插入、缺失或置换1-5 个氨基酸、1-10个氨基酸、5-20个氨基酸、10-50个氨基酸、25-100个氨基酸、100-500 个氨基酸、300-400个氨基酸、200-1000个氨基酸、或1000个或1000个以上氨基酸。
在一个实施例中，本发明提供在编码gE蛋白质的基因中包含第一失活突变且包 含第二失活突变的经分离突变体HSV-1菌株。在另一实施例中，编码gE蛋白质的基 因是Us8基因。在另一实施例中，突变是gE无效突变。在一个实施例中，本发明方 法和组合物中所述的经分离突变体HSV-1菌株进一步包含一或多种额外突变，所述 额外突变在一个实施例中是失活突变。在另一实施例中，第二或额外失活突变是在 Us7基因中。在另一实施例中，第二或额外失活突变是在Us9基因中。在另一实施例 中，第二失活突变是在赋予神经毒力的任何基因中。在另一实施例中，第二失活突变 是在为病毒入侵至宿主细胞中所需要的任何基因中。在另一实施例中，第二失活突变 是在宿主关闭基因(shut-offgene)中。在另一实施例中，第二失活突变是在胸苷激酶基 因中。在另一实施例中，第二失活突变是在业内已知的任何其它HSV-1基因中。在 另一实施例中，经分离突变体HSV-1菌株在编码gE蛋白质的基因、Us7基因、和 Us9基因中含有失活突变。在另一实施例中，本发明方法和组合物中所述的经分离突 变体HSV-l菌株在编码gD蛋白质的基因中进一步包含额外突变。
在一个实施例中，本发明提供在编码gE蛋白质的基因中包含第一失活突变且包 含第二失活突变的经分离突变体HSV-2菌株。在另一实施例中，编码gE蛋白质的基 因是Us8基因。在另一实施例中，突变是gE无效突变。在一个实施例中，本发明方 法和组合物中所述的经分离突变体HSV-2菌株进一步包含一或多种额外突变，所述 额外突变在一个实施例中是失活突变。在另一实施例中，第二或额外失活突变是在Us7基因中。在另一实施例中，第二或额外失活突变是在Us9基因中。在另一实施例
中，第二失活突变是在赋予神经毒力的任何基因中。在另一实施例中，第二失活突变 是在为病毒入侵至宿主细胞中所需要的任何基因中。在另一实施例中，第二失活突变 是在宿主关闭基因中。在另一实施例中，第二失活突变是在胸苷激酶基因中。在另一
实施例中，第二失活突变是在业内已知的任何其它HSV-2基因中。在另一实施例中， 经分离突变体HSV-2菌株在编码gE蛋白质的基因、Us7基因、和Us9基因中含有失 活突变。在另一实施例中，本发明方法和组合物中所述的经分离突变体HSV-2菌株 在编码gD蛋白质的基因中进一步包含额外突变。
在一个实施例中，突变的Us7基因在a-疱疹病毒中高度保守。在另一实施例中， 突变的Us7基因为病毒顺行性扩散所需要。在另一实施例中，突变的Us7基因为病毒 逆行性扩散所需要。
在一个实施例中，突变的Us9基因在a-疱疹病毒中高度保守。在另一实施例中， 突变的Us9基因为病毒顺行性扩散所需要。在另一实施例中，突变的Us9基因为病毒 逆行性扩散所需要。
在一个实施例中，Us7和/或Us9中的突变是失活突变。在另一实施例中，突变 是缺失突变。在另一实施例中，突变是插入突变。在另一实施例中，突变是置换突变。 在另一实施例中，突变是业内已知的任何其它类型突变。
在一个实施例中，突变的额外基因在a-疱疹病毒中高度保守。在另一实施例中， 突变的额外基因为病毒顺行性扩散所需要。在另一实施例中，突变的额外基因为病毒 逆行性扩散所需要。
在一个实施例中，突变的额外基因是病毒粒子膜蛋白质。在一个实施例中，额外 基因是病毒入侵不需要或必需的病毒粒子膜蛋白质。在另一实施例中，膜蛋白质是糖 蛋白。在另一实施例中，额外基因是糖蛋白J。在另一实施例中，额外基因是糖蛋白 G。在另一实施例中，额外基因是糖蛋白K。在另一实施例中，额外基因是糖蛋白M。 在另一实施例中，额外基因是选自糖蛋白J、 G、 K、和M。
在一个实施例中，"顺行性"是指自神经节到皮肤扩散。在另一实施例中，所述 术语是指自细胞体向轴突扩散。在另一实施例中，所述术语是指业内接受的任何其它 定义。
在一个实施例中，"逆行性"是指自感染位点到神经节扩散。在另一实施例中， 所述术语是指自轴突向细胞体扩散。在另一实施例中，所述术语是指业内接受的任何 其它定义。
在一个实施例中，引入额外突变以增强对突变体HSV-1菌株顺行性扩散的抑制。 在另一实施例中，需要额外突变与gE突变来抑制突变体HSV-l菌株顺行性扩散。在 另一实施例中，gE突变不足以抑制突变体HSV-l菌株的顺行性扩散。在另一实施例 中，于不存在gE突变下额外突变已足以抑制突变体HSV-1菌株的顺行性扩散。
在一个实施例中，引入额外突变以增强对突变体HSV-2菌株的顺行性扩散的抑制。在另一实施例中，需要额外突变与gE突变来抑制突变体HSV-2菌株的顺行性扩 散。在另一实施例中，gE突变不足以抑制突变体HSV-2菌株的顺行性扩散。在另一 实施例中，于不存在gE突变的情况下额外突变已足以抑制突变体HSV-2菌株的顺行 性扩散。
在一个实施例中，引入额外突变以增强对HSV-1或HSV-2菌株或二者的毒力的 衰减。在另一实施例中，需要额外突变与gE突变来衰减毒力。
在一个实施例中，突变的额外基因是病毒粒子膜蛋白质。在另一实施例中，额外 基因是病毒入侵所需要的病毒粒子膜蛋白质。在另一实施例中，额外基因是糖蛋白B。 在另一实施例中，额外基因是糖蛋白D。在另一实施例中，额外基因是糖蛋白H。在 另一实施例中，额外基因是糖蛋白L。
在一个实施例中，本发明方法和组合物中所述的突变体HSV菌株在个体的皮肤 组织中具有复制能力。在另一实施例中，突变体菌株在个体的皮肤细胞中具有复制能 力。在另一实施例中，突变体菌株在个体所属物种的皮肤组织中具有复制能力。在另 一实施例中，突变体菌株在来源于个体物种皮肤组织的细胞系中具有复制能力。在另 一实施例中，突变体菌株在个体物种的皮肤细胞培养物中具有复制能力。在另一实施 例中，突变体菌株在来源于个体物种皮肤细胞的细胞系中具有复制能力。
在一个实施例中，"具有复制能力"是指能够复制。在另一实施例中，所述术语 包括展示受损但仍可检测到的复制水平的菌株。在另一实施例中，所述术语是指展示 可测量复制的菌株。
在一个实施例中，本发明方法和组合物中所述的突变体HSV菌株不能自接种位 点扩散到背根神经节(DRG)。在一个实施例中，背根神经节含有神经纤维的神经元细 胞体。在另一实施例中，突变体HSV菌株不能逆行性扩散。在另一实施例中，突变 体HSV菌株的逆行性扩散受损。在另一实施例中，突变体HSV菌株的逆行性扩散显 著受损。在另一实施例中，突变体HSV菌株的逆行性扩散受损，但在皮肤中仍具有 复制能力。
在一个实施例中，本发明方法和组合物中所述的突变体HSV菌株不能自DRG 扩散到皮肤。在另一实施例中，突变体HSV菌株不能顺行性扩散。在另一实施例中， 突变体HSV菌株的顺行性扩散受损。在另一实施例中，突变体HSV菌株的顺行性扩 散显著受损。在另一实施例中，突变体HSV菌株的顺行性扩散受损，但在皮肤中仍 具有复制能力。
在一个实施例中，"DRG"是指神经元细胞体。在另一实施例中，所述术语是 指业内使用的"DRG"的任何其它定义。
在一个实施例中，"突发"或"复发"是指在潜伏神经元HSV感染后皮肤组织 再感染。在另一实施例中，所述术语是指在潜伏期后HSV复活。在另一实施例中， 所述术语是指在无症状潜伏期后出现症状性HSV损伤。
在一个实施例中，本发明的突变体HSV菌株在特定组织中或普遍(例如在神经组织中)具有复制缺陷。衡量病毒复制的方法已为所属领域的技术人员所熟知，且在 一个实施例中包括对接种位点附近的组织样品实施滴定分析(本文实例)。在另一实 施例中，利用自接种位点附近的组织中回收传染性病毒(本文实例)。衡量病毒复制 的方法中所述的其它实施例阐述于(例如)森(ThiTN)等人(通过实时PCR来快速测 定I型和n型单纯疱疹病毒的抗病毒药物敏感性(Rapid determination of antiviral drag susceptibility of herpes simplex virus types 1 and 2 by real-time PCR.)， 抗病毒石开究 (Antiviral Res.)， 2006年3月;69(3):152-7);熊兹(Schang LM)等人(细胞周期蛋白 依赖激酶的特异性抑制剂罗斯克韦亭(Roscovitine)于病毒早期蛋白质存在下抑制单纯 疱疹病毒DNA合成(Roscovitine， a specific inhibitor of cellular cyclin-dependent kinases, inhibits herpes simplex virus DNA synthesis in the presence of viral early proteins.), 病毒 学期刊，2000年3月;74(5):2107-20);和肯尼迪(Kennedy PG)等人(I型单纯疱疹 病毒RL1突变体1716在原代神经元细胞培养物中的复制一可能与用作病毒载体具有 相关性(Replication of the herpes simplex virus type 1 RLl mutant 1716 in primary neuronal cell cultures—possible relevance to use as a viral vector.), 神纟圣病学其月干l)(J Neurol Sci.)， 2000年10月1日；179(S 1-2):108-14)。
在一个实施例中，本发明方法和组合物中所述的突变体菌株在个体神经组织中的 扩散受损。在另一实施例中，突变体菌株在个体神经细胞培养物中的扩散受损。在另 一实施例中，突变体菌株在个体所属物种的神经组织中的扩散受损。在另一实施例中， 突变体菌株在来源于个体物种神经组织的细胞系中的扩散受损。在另一实施例中，突 变体菌株在个体物种的神经细胞培养物中的扩散受损。在另一实施例中，突变体菌株 在来源于个体物种神经细胞的细胞系中的扩散受损。
在一个实施例中，本发明方法和组合物中所述突变体菌株入侵个体神经组织的能 力受损。在另一实施例中，突变体菌株入侵个体神经细胞培养物的能力受损。在另一 实施例中，突变体菌株入侵个体所属物种的神经组织的能力受损。在另一实施例中， 突变体菌株入侵来源于个体物种神经组织的细胞系的能力受损。在另一实施例中，突 变体菌株入侵个体物种的神经细胞培养物的能力受损。在另一实施例中，突变体菌株 入侵来源于个体物种神经细胞的细胞系的能力受损。
在一个实施例中，本发明方法和组合物中所述的突变体HSV菌株可诱导抗HSV 免疫应答。在另一实施例中，免疫应答阻止HSV在个体中复制。在另一实施例中， 免疫应答阻止HSV在个体中的神经元扩散。在另一实施例中，免疫应答可杀死个体 中受HSV感染的细胞。
在一个实施例中，本发明方法和组合物中所述的突变体HSV菌株是突变体 HSV-1菌株。在另一实施例中，所述突变体HSV-1菌株赋予对抗HSV-1感染、扩散、 或其后果(例如带状疱疹样损伤或疱疹性眼睛疾病)的保护。在另一实施例中，突变 体HSV菌株是突变体HSV-2菌株。在另一实施例中，所述突变体HSV-2菌株赋予对 抗HSV-2感染、扩散、或其后果(例如带状疱疹样损伤或疱疹性眼睛疾病)的保护。在另一实施例中，突变体HSV菌株是业内已知的任何其它突变体HSV菌株。
在一个实施例中，本发明的突变体HSV-1菌株可保护个体以防野生型HSV-1感 染和与其有关的病症和症状。在另一实施例中，所述病症和症状包括唇疱疹(感冒疮 或发热性水疱)。在另一实施例中，所述病症和症状包括HSV介导的角膜疾病。在 另一实施例中，所述病症和症状包括疱疹介导的视网膜炎。在另一实施例中，所述病 症和症状包括疱疹介导的脑炎。在另一实施例中，所述病症和症状包括HSV-1介导 的生殖器溃疡疾病。在另一实施例中，本发明的突变体HSV-1菌株提供对抗HSV-1 感染的充分保护和对抗与HSV-2感染有关的一或多种症状的部分保护。在另一实施 例中，这些HSV-2症状包括上文所述症状。
在另一实施例中，所述病症和症状包括免疫受损个体(包括带有人类免疫缺陷病 毒(HIV)的个体)中的HSV感染。在另一实施例中，本发明的突变体HSV-1菌株可 阻止或抑制生殖器HSV-1自接种疫苗的母亲传播至其新生婴儿。在另一实施例中， 本发明的突变体HSV菌株可在老年个体中治疗、阻抑、阻止或抑制HSV。
在一个实施例中，本发明的突变体HSV-2菌株可保护个体以防野生型HSV-2感 染和与其有关的病症和症状。在另一实施例中，所述突变体HSV-2菌株可阻止或抑 制生殖器HSV-2自接种疫苗的母亲传播至其新生婴儿。在另一实施例中，所述突变 体HSV-2菌株可预防或抑制生殖器溃疡疾病。在另一实施例中，所述突变体HSV-2 菌株可提供对抗HSV-2感染和HSV-1感染二者的充分保护。
根据本发明的任何方法且在一个实施例中，感染是HSV-1感染。在另一实施例 中，感染是HSV-2感染。
根据本发明的任何方法且在一个实施例中，疫苗菌株来自与采取保护措施所对抗 的菌株("攻击菌株")不同的物种。在另一实施例中，疫苗菌株是与攻击菌株相同 的物种。
在一个实施例中，本发明方法和组合物中所述的疫苗可保护个体以防异源HSV 攻击。在另一实施例中，异源攻击是相同物种的不同菌株。在另一实施例中，在突变 体HSV-1疫苗菌株情形下，所述疫苗可赋予对抗异源HSV-1菌株的保护。在另一实 施例中，在突变体HSV-2疫苗菌株情形下，所述疫苗可赋予对抗异源HSV-2菌株的 保护。在另一实施例中，异源菌株具有相对于疫苗菌株明显异源的抗原蛋白质。在另 一实施例中，抗原蛋白质是gD。在另一实施例中，抗原蛋白质是gB。在另一实施例 中，抗原蛋白质是业内已知的任何其它抗原蛋白质。
在一个实施例中，异源菌株具有相对于疫苗菌株明显异源的gD蛋白质。在另一 实施例中，异源菌株的gD蛋白质与疫苗菌株具有50呢同源性。在另一实施例中，异 源菌株的gD蛋白质与疫苗菌株具有55%同源性。在另一实施例中，具有60%同源性。 在另一实施例中，具有65%同源性。在另一实施例中，具有70%同源性。在另一实施 例中，具有75%同源性。在另一实施例中，具有80%同源性。在另一实施例中，具有 85%同源性。在另一实施例中，具有90%同源性。在另一实施例中，具有95%同源性。在另一实施例中，具有98%同源性。在另一实施例中，具有98%以上的同源性。
在一个实施例中，异源菌株具有相对于疫苗菌株明显异源的gB蛋白质。在另一 实施例中，异源菌株的gB蛋白质与疫苗菌株具有50免同源性。在另一实施例中，异 源菌株的gB蛋白质与疫苗菌株具有55%同源性。在另一实施例中，具有60%同源性。 在另一实施例中，具有65%同源性。在另一实施例中，具有70%同源性。在另一实施 例中，具有75%同源性。在另一实施例中，具有80%同源性。在另一实施例中，具有 85%同源性。在另一实施例中，具有90%同源性。在另一实施例中，具有95%同源性。 在另一实施例中，具有98%同源性。在另一实施例中，具有98%以上的同源性。
在一个实施例中，异源攻击菌株是HSV-1NS。在另一实施例中，异源攻击菌株 是HSV-1(F)。在另一实施例中，异源攻击菌株是HSV-1 (17)。在另一实施例中，异 源攻击菌株是业内已知的任何其它HSV-1菌株。
在一个实施例中，异源攻击菌株是HSV-2(2.12)。在另一实施例中，异源攻击菌 株是业内已知的任何其它HSV-2菌株。
在一个实施例中，异源攻击菌株是不同的HSV物种。在另一实施例中，在突变 体HSV-1疫苗菌株情形下，所述疫苗可赋予对抗HSV-2攻击的保护。在另一实施例 中，在突变体HSV-2疫苗菌株情形下，所述疫苗可赋予对抗HSV-1攻击的保护。
在一个实施例中，本发明方法和组合物中所述的疫苗可保护个体对抗HSV大接 种物攻击。在另一实施例中，大接种物为10"篮斑形成单位(pfu)。在另一实施例中， 接种物为1.5xl06pfu。在另一实施例中，接种物为2xl(fpfu。在另一实施例中，接 种物为3xlO、fu。在另一实施例中，接种物为4x 106pfu。在另一实施例中，接种 物为5 x 106pfu。在另一实施例中，接种物为7 x 106 pfu。在另一实施例中，接种物 为lxlO pfu。在另一实施例中，接种物为1.5xl07pfu。在另一实施例中，接种物为 2 x 107 pfu。在另一实施例中，接种物为3 x 107 pfu。在另一实施例中，接种物为4 x 107 pfu。在另一实施例中，接种物为5 x 107 pfu。在另一实施例中，接种物为7xl(^pfu。 在另一实施例中，接种物为108pfu。在另一实施例中，接种物为103-106pfu。在另一 实施例中，接种物为103-105 pfu。在另一实施例中，接种物为104-106pfu。在另一实 施例中，接种物为3xlO、3xlO fu。在另一实施例中，接种物为10、10、fu。在另 一实施例中，接种物为3xlO、3xl(^pfu。在另一实施例中，接种物为105-108 pfu。 在另一实施例中，接种物为3 x 105-3 x 108 pfu。在另一实施例中，接种物为108 pfu 以上。
在一个实施例中，本发明方法和组合物中所述的疫苗由于不能感染神经节而展示 相对于含gEHSV疫苗菌株增强的安全性。在另一实施例中，本发明方法由于不能在 神经元中扩散而展示相对于含gEHSV疫苗菌株增强的安全性。
在另一实施例中，突变体HSV颗粒的多种剂量范围实施例可用于本发明方法中。 在另一实施例中，剂量为10Spfu。在另一实施例中，剂量为2xl()Spfu。在另一实施 例中，剂量为3xl()Spfu。在另一实施例中，剂量为5xl(^pfu。在另一实施例中，剂量为104pfu。在另一实施例中，剂量为1.5xl04pfu。在另一实施例中，剂量为104 pfu。在另一实施例中，剂量为2xl0"pfu。在另一实施例中，剂量为3xl(^pfu。在 另一实施例中，剂量为5xl0"pfu。在另一实施例中，剂量为7xl(fpfu。在另一实 施例中，剂量为105pfu。在另一实施例中，剂量为2xl()Spfu。在另一实施例中，剂 量为3 x 105 pfu。在另一实施例中，剂量为5 x 105 pfu。在另一实施例中，剂量为7 x 105pfu。在另一实施例中，剂量为l(^pfu。在另一实施例中，剂量为2xl()Spfu。在 另一实施例中，剂量为3xl(^pfu。在另一实施例中，剂量为5xl0Spfu。在另一实 施例中，剂量为7xl0Spfu。在另一实施例中，剂量为l(^pfu。在另一实施例中，剂 量为2xl(^pfu。在另一实施例中，剂量为3xl0、fu。在另一实施例中，剂量为5x 107pfu。在另一实施例中，剂量为7xl0 pfu。在另一实施例中，剂量为l()Spfu。在 另一实施例中，剂量为2xl()Spfu。在另一实施例中，剂量为3xl()Spfu。在另一实 施例中，剂量为5xl()8pfu。在另一实施例中，剂量为7xl()Spfu。
在另一实施例中，剂量为10Spfu/剂量。在另一实施例中，剂量为2 x 103 pfu/剂 量。在另一实施例中，剂量为3xl(^pfu/剂量。在另一实施例中，剂量为5xl(^pfu/ 剂量。在另一实施例中，剂量为10"pfu/剂量。在另一实施例中，剂量为1.5xl04pfu/ 剂量。在另一实施例中，剂量为104 pfu/剂量。在另一实施例中，剂量为2xl(/pfu/ 剂量。在另一实施例中，剂量为3x 1(/pfu/剂量。在另一实施例中，剂量为5x 104pfu/ 剂量。在另一实施例中，剂量为7 x 104 pfu/剂量。在另一实施例中，剂量为l(^pfu/ 剂量。在另一实施例中，剂量为2x 105 pfu/剂量。在另一实施例中，剂量为3x 105pfu/ 剂量。在另一实施例中，剂量为5xl()Spfu/剂量。在另一实施例中，剂量为7xl()Spfu/ 剂量。在另一实施例中，剂量为106 pfu/剂量。在另一实施例中，剂量为2xl()Spfu/ 剂量。在另一实施例中，剂量为3x 1(^pfu/剂量。在另一实施例中，剂量为5x 106pfu/ 剂量。在另一实施例中，剂量为7 x 1(^pfu/剂量。在另一实施例中，剂量为l(^pfu/ 剂量。在另一实施例中，剂量为2x 10、fu/剂量。在另一实施例中，剂量为3x 107pfu/ 剂量。在另一实施例中，剂量为5x 10 pfu/剂量。在另一实施例中，剂量为7x 107pfu/ 剂量。在另一实施例中，剂量为H)Spfu/剂量。在另一实施例中，剂量为2xl()8pfu/ 剂量。在另一实施例中，剂量为3xl()Spfu/剂量。在另一实施例中，剂量为5xl()Spfu/ 剂量。在另一实施例中，剂量为7x 1()8pfu/剂量。在另一实施例中，剂量大于108pfu。 在另一实施例中，剂量为103-106 pfu。在另一实施例中，剂量为103-105 pfu。在另一 实施例中，剂量为104-106pfu。在另一实施例中，剂量为3xl04-3xl()6pfu。在另一 实施例中，剂量为104-107 pfu。在另一实施例中，剂量为3xl()4-3xl07pfu。在另一 实施例中，剂量为105-108 pfu。在另一实施例中，剂量为3xl()5-3xl08pfu。
在一个实施例中，"治疗"是指治疗性治疗和预防性(pr叩hylactic或preventative) 措施二者，其中目的是预防或减轻上文所述目标病理学病状或病症。因此，在一个实 施例中，治疗可包括直接影响或治愈、阻抑、抑制、预防疾病、病症或病状、减轻其 严重程度、延迟其发作、减少其伴随的症状或其组合。因此，在一个实施例中，"治
27疗"尤其是指延迟进展、促进好转、诱导好转、增强好转、加速恢复、增强替代疗法 的功效或降低对替代疗法的抗性或其组合。在一个实施例中，"预防"尤其是指延迟 症状发作、防止疾病复发、减少复发事件的次数或频率、延长症状性事件之间的潜伏 期或其组合。在一个实施例中，"阻抑"或"抑制"尤其是指降低症状的严重程度、 降低急性事件的严重程度、减少症状次数、降低疾病相关症状的发生率、减少潜伏症 状、改善症状、减少继发性症状、减少继发性感染、延长患者存活期或其组合。
在一个实施例中，症状是原发性症状，而在另一实施例中，症状是继发性症状。 在一个实施例中，"原发性"是指症状是个体病毒感染的直接结果，而在一个实施例 中，"继发性"是指症状来源于原发性原因或为其结果。在一个实施例中，用于本发 明的组合物和菌株可治疗与HSV感染有关的原发性或继发性症状或继发性并发症。
在另一实施例中，"症状"可为HSV感染的任何表现形式，包含水疱、溃疡形 成、或女性尿道、子宫颈、大腿上部、和/或肛门损伤和男性阴茎、尿道、阴囊、大 腿上部、和肛门损伤、炎症、肿胀、发热、流感样症状、口疮、咽喉痛、咽炎、疼痛、 舌头、口腔或嘴唇上的水疱、溃疡、感冒疮、颈痛、淋巴结肿大、发红、出血、瘙痒、 排尿困难、头痛、肌肉痛等或其组合。
在一个实施例中，本发明方法和组合物中所述的gE蛋白质具有以下序列
MDRGAVVGFLLGVCVVSCLAGTPKTSWRRVSVGEDVSLLPAPGPTGRGPTQ
V(3PAPVPTPPPTPADYDEDDNDEGEDESLAGTPASGTPRLPPPPAPPRSWPSAPEVS HVRGVTVRMETPEAILFSPGETFSTNVSIHAIAHDDQTYSMDWWLRFDVPTSCAE MRIYESCLYHPQLPECLSPADAPCAASTWTSRLAVRSYAGCSRTNPPPRCSAEAHM EPVPGLAWQAAS VNLEFRD ASPQHSGL YLC VV YVNDHIHAWGH1TISTA AQYRN AVVEQPLPGRGADLAEPTHPHVGAPPHAPPTHGALRLGAVMGAAUXSALGLSV WACMTCWRRRAWRAVKSRASGKGPTYIRVADSELYADWSSDSEGERD(^VPWLA PPERPDSPSTNGSGFEILSPTAPSVYPRSDGHGSRRQLTTFGSGRPDRRYSQASDSSV FW(SEQIDNo: 2)。在另一实施例中，gE蛋白质是SEQ ID No: 2的同源物。在另一 实施例中，gE蛋白质是SEQIDNo:2的变体。在另一实施例中，gE蛋白质是SEQID No:2的异构体。在另一实施例中，gE蛋白质是SEQIDNo:2的片段。在另一实施例 中，gE蛋白质包含SEQIDNo: 2。
在另一实施例中，gE蛋白质是由具有以下序列的核苷酸序列编码 atggatcgcggggcggtggtggggtttcttctcggtgtttgtgttgtatcgtgcttggcgggaacgcccaaaacgtcctgga gacgggtgagtgtcggcgaggacgtttcgttgcttccagctccggggcctacggggcgcggcccgacccagaaactactatggg ccgtggaacccctggatgggtgcggccccttacacccgtcgtgggtctcgctgatgccccccaagcaggtgcccgagacggtcg tggatgcggcgtgcatgcgcgctccggtcccgctggcgatggcgtacgcccccccggccccatctgcgaccgggggtctacga acggacttcgtgtggcaggagcgcgcggccgtggttaaccggagtctggttattcacggggtccgagagacggacagcggcctgtataccctgtccgtgggcgacataaaggacccggctcgccaagtggcctcggtggtcctggtggtgcaaccggccccagttccga
ccccacccccgaccccagccgattacgacgaggatgacaatgacgagggcgaggacgaaagtctcgccggcactcccgccag
cgggaccccccggctcccgcctccccccgcccccccgaggtcttggcccagcgcccccgaagtctcacatgtgcgtggggtga
ccgtgcgtatggagactccggaagctatcctgttttcccccggggagacgttcagcacgaacgtctccatccatgccatcgcccac
gacgaccagacctactccatggacgtcgtctggttgaggttcgacgtgccgacctcgtgtgccgagatgcgaatatacgaatcgtg
tctgtatcacccgcagctcccagaatgtctgtccccggccgacgcgccgtgcgccgcgagtacgtggacgtctcgcctggccgtc
cgcagctacgcggggtgttccagaacaaaccccccaccgcgctgttcggccgaggctcacatggagcccgtcccggggctggc
gtggcaggcggcctccgtcaatctggagttccgggacgcgtccccacaacactccggcctgtatctgtgtgtggtgtacgtcaacg
accatattcacgcctggggccacattaccatcagcaccgcggcgcagtaccggaacgcggtggtggaacagcccctcccacagc
gcggcgcggatttggccgagcccaccc3cccgcacgtcggggcccctcccc3cgcgcccccaacccacggcgccctgcggtt
aggggcggtgatgggggccgccctgctgctgtctgcactggggttgtcggtgtgggcgtgtatgacctgttggcgcaggcgtgcc
tggcgggcggttaaaagcagggcctcgggtaaggggcccacgtacattcgcgtggccgacagcgagctgtacgcggactgga
gctcggacagcgagggagaacgcgaccaggtcccgtggctggcccccccggagagacccgactctccctccaccaatggatc
cggctttgagatcttatcaccaacggctccgtctgtatacccccgtagcgatgggcatcaatctcgccgccagctcacaacctttgga
tccggaaggcccgatcgccgttactcccaggcctccgattcgtccgtcttctggtaa (SEQ ID No: 3)。在另一实施
例中，gE蛋白质是由为SEQIDNo:3同源物的核苷酸分子编码。在另一实施例中，
核苷酸分子是SEQIDNo: 3的变体。在另一实施例中，核苷酸分子是SEQ ID No: 3
的异构体。在另一实施例中，核苷酸分子是SEQIDNo:3的片段。在另一实施例中，
核苷酸分子包含SEQ ID No: 3。
在另一实施例中，本发明方法和组合物中所述的gE蛋白质具有以下序列 MDRGAVVGFLLGVCVVSCLAGTPKTS職RVSVGEDVSIXPAPGPTGRGPTQ
V(^PAPVPTPPPTPADYDEDDNDEGEGEDESLAGTPASGTPRLPPSPAPPRSWPSAPE VSHVRGVTVRMETPEAILFSPGEAFSTNVSIHAIAHDD(2TYTMDVVWLRFDVPTSC
画EPFPGLAWGAASVNLEFRDASPGHSGLYLCVVYVNDHIHAWGHITINTAAQY
VWACMTC職RRAWRAVKSRASGKGPTYIRVADSELYADWSSDSEGERDQVPWL APPERPDSPSTNGSGFEILSPTAPSVYPRSDGHOSRRQLTTFGSGRPDRRYSOASDSS VFW(SEQIDNo:4)。在另一实施例中，gE蛋白质是SEQ ID No: 4的同源物。在另 一实施例中，gE蛋白质是SEQIDNo:4的变体。在另一实施例中，gE蛋白质是SEQ IDNo:4的异构体。在另一实施例中，gE蛋白质是SEQIDNo:4的片段。在另一实 施例中，gE蛋白质包含SEQ ID No: 4 。
在另一实施例中，gE蛋白质是由具有以下序列的核苷酸序列编码 atggatcgcggggcggtggtggggtttcttctcggtgtttgtgttgtatcgtgcttggcgggaacgcccaaaacgtcctggagacgggtgagtgtcggcgaggacgtttcgttgctaccagctccggggcctacggggcgcggcccgacccagaaactactatgg
gccgtggaacccctggatgggtgcggccccttacacccgtcgtgggtctcgctgatgccccccaagcaggtacccgagacggtc
gtggatgcggcgtgcatgcgcgctccggtcccgctggcgatggcatacgcccccccggccccatctgcgaccgggggtctacg
gacggacttcgtgtggcaggagcgcgcggccgtggttaaccggagtctggttatttacggggtccgagagacggacagcggcct
gtataccctgtctgtgggcgacataaaggacccggctcgccaagtggcctcggtggtcctggtggtgcaaccggccccagttccg
actccacccccgaccccagccgattacgacgaggatgacaatgacgagggcgagggcgaggacgaaagtctagccggcactc
ccgccagcgggaccccccggctcccgccttcccccgcccccccgaggtcttggcccagcgcccccgaagtctcacacgtgcgt
ggggtgaccgtgcgtatggagactccggaagctatcctgttttcccccggggaggcgtttagcacgaacgtctccatccatgccat
cgcccacgacgaccagacctacaccatggacgtcgtctggttgaggttcgacgtgccgacctcgtgtgccgagatgcgaatatac
gaatcgtgtctgtatcatccgcagctcccagagtgtctgtccccggccgacgctccgtgcgccgcgagtacgtggacgtctcgcct
ggccgtccgcagctacgcggggtgttccagaacaaaccccccgccgcgctgttcggccgaggctcacatggagcccttcccgg
ggctggcgtggcaggcggcctcagtcaatctggagttccgggacgcgtccccacaacactccgggctgtatctgtgcgtggtgta
cgtc33cg3CC3tettcacgcatggggccac3ttaccatc犯caccgcggcgcagtaccggaacgcggtggtggaacagcccct
cccacagcgcggcgcggatttggccgagcccacccacccgcacgtcggggcccctccccacgcgcccccaacccacggcgc
cctgcggttaggggcggtgatgggggccgccctgctgctgtctgcgctggggttgtcggtgtgggcgtgtatgacctgttggcgca
ggcgtgcctggcgggcggttaaaagcagggcctcgggtaaggggcccacgtacattcgcgtggccgacagcgagctgtacgc
ggactggagctcggacagcgagggagaacgcgaccaggtcccgtggctggcccccccggagagacccgactctccctccacc
aatggatccggctttgagatcttatcaccaacggctccgtctgtatacccccgtagcgatgggcatcaatctcgccgccagctcaca
acctttggatccggaaggcccgatcgccgttactcccaggcctccgattcgtccgtcttctggtaa (SEQ ID No: 5)。在另
一实施例中，gE蛋白质是由为SEQIDNo:5同源物的核苷酸分子编码。在另一实施
例中，核苷酸分子是SEQ ID No: 5的变体。在另一实施例中，核苷酸分子是SEQ ID No:
5的异构体。在另一实施例中，核苷酸分子是SEQIDNo: 5的片段。在另一实施例中，
核苷酸分子包含SEQ ID No: 5。
在另一实施例中，本发明方法和组合物中所述的gE蛋白质具有以下序列 MARGAGLVFFVGVWVVSCLAAAPRTSWKRVTSGEDVVLLPAPAERTRAHK LLWAAEPLDACGPLRPSWVALWPPRRVLETWDAACMRAPEPLAIAYSPPFPAGDE
APVPTPTPDDYDEEDDAGVTNARRSAFPPQPPPRRPPVAPPTHPRVIPEVSHVRGVT VHMETLEAILFAPGETFGTNVSIHAIAHDDGPYAMDVVWMRFDVPSSCADMRIYE
TCWRRRSWRAVKSRASATGPTYIRVADSELYADWSSDSEGERDGSLWQDPPERPD SPSTNGSGFEILSPTAPSVYPHSEGRKSRRPLTTFGSGSPGRRHSQASYPSVLW (SEQ
ID No: 6;此蛋白质在本文实例1-5中突变)。在另一实施例中，gE蛋白质是SEQID No:6的同源物。在另一实施例中，gE蛋白质是SEQIDNo:6的变体。在另一实施例
30中，gE蛋白质是SEQIDNo:6的异构体。在另一实施例中，gE蛋白质是SEQ ID No: 6的片段。在另一实施例中，gE蛋白质包含SEQIDNo:6。
在另一实施例中，gE蛋白质是由具有以下序列的核苷酸序列编码-
atggctcgcggggccgggttggtgttttttgttggagtttgggtcgtatcgtgcctggcggcagcacccagaacgtcctgga aacgggtaacctcgggcgaggacgtggtgttgcttccggcgcccgcggaacgcacccgggcccacaaactactgtgggccgcg gaacccctggatgcctgcggtcccctgcgcccgtcgtgggtggcgctgtggcccccccgacgggtgctcgagacggtcgtggat gcggcgtgcatgcgcgccccggaaccgctcgccatagcatacagtcccccgttccccgcgggcgacgagggactgtattcgga gttggcgtggcgcgatcgcgtagccgtggtcaacgagagtctggtcatctacggggccctggagacggacagcggtctgtacac cctgtccgtggtcggcctaagcgacgaggcgcgccaagtggcgtcggtggttctggtcgtggagcccgcccctgtgccgacccc gacccccgacgactacgacgaagaagacgacgcgggcgtgacgaacgcacgccggtcagcgttccccccccaacccccccc ccgtcgtccccccgtcgcccccccgacgcaccctcgtgttatccccgaggtgtcccacgtgcgcggggtaacggtccatatggag accctggaggccattctgtttgcccccggggagacgtttgggacgaacgtctccatccacgccattgcccacgacgacggtccgta cgccatggacgtcgtctggatgcggtttgacgtgccgtcctcgtgcgccgatatgcggatctacgaagcttgtctgtatcacccgca gcttccagagtgtctatctccggccgacgcgccgtgcgccgtaagttcctgggcgtaccgcctggcggtccgcagctacgccggc tgttccaggactacgcccccgccgcgatgttttgccgaggctcgcatggaaccggtcccggggttggcgtggctggcctccaccg tcaatctggaattccagcacgcctccccccagcacgccggcctctacctgtgcgtggtgtacgtggacgatcatatccacgcctgg ggccacatgaccatcagcaccgcggcgcagtaccggaacgcggtggtggaacagcacctcccccagcgccagcccgagccc gtcgagcccacccgcccgcacgtgagagccccccatcccgcgccctccgcgcgcggcccgctgcgcctcggggcggtgctgg gggcggccctgttgctggccgccctcgggctgtccgcgtgggcgtgcatgacctgctggcgcaggcgctcctggcgggcggtta aaagccgggcctcggcgacgggccccacttac倉gcgtggcggacagcgagctgtacgcggactggagttcggacagcga gggggagcgcgacgggtccctgtggcaggaccctccggagagacccgactctccctccacaaatggatccggctttgagatctt atcaccaacggctccgtctgtatacccccatagcgaggggcgtaaatctcgccgcccgctcaccacctttggttcgggaagcccg ggccgtcgtcactcccaggcctcctatccgtccgtcctctggtaa (SEQ ID No: 7;此基因在本文实例1-5 中突变)。在另一实施例中，gE蛋白质是由为SEQIDNo:7同源物的核苷酸分子编 码。在另一实施例中，核苷酸分子是SEQIDNo:7的变体。在另一实施例中，核苷酸 分子是SEQIDNo:7的异构体。在另一实施例中，核苷酸分子是SEQ ID No: 7的片 段。在另一实施例中，核苷酸分子包含SEQIDNo:7。
在一个实施例中，gE蛋白质是由以下基因库登录号(GenBank Accession Number) 中的一个禾口 AJ626469-AJ626498中的任何一个编码DQ889502、 NC_001806、 NC—001798、 Z86099、 X14112、 L00036、 X02138、和X04798。在另一实施例中，gE 蛋白质与一个上文基因库登录号所揭示的序列同源。在另一实施例中，gE蛋白质是 一个上文基因库登录号所揭示序列的变体。在另一实施例中，gE蛋白质是一个上文 基因库登录号所揭示序列的片段。
在一个实施例中，gE蛋白质HSV-l糖蛋白E(gE)是病毒粒子表面蛋白质，其为 在神经元中扩散所需要，且在一个实施例中，其为在任一方向上沿轴突至("逆行性") 和自("顺行性")神经元细胞体扩散所需要。在另一实施例中，gE也有助于通过隔绝对抗HSV-1的宿主抗体使其无活性来躲避宿主免疫系统。在一个实施例中，gE 缺失型HSV-1能在皮肤中复制，但不能沿神经元扩散以建立潜伏或逃避宿主抗体应 答。因此，在一个实施例中，活减毒gE缺失型HSV-l或HSV-2感染会在皮肤中引 发强烈免疫应答并防止宿主将来遭到野生型病毒的侵袭。
在一个实施例中，gE蛋白质是HS—V'-l gE蛋白质。在另一实施例中，gE蛋白质 是HSV-1 (NS)gE蛋白质。在另-实施例中，gE蛋白质是HSV-K17)gE蛋白质。在 另一实施例中，gE蛋白质是HSV-l (F) gE蛋白质。在另一实施例中，gE蛋白质是 HSV-l(KOS)gE蛋白质。在另一实施例中，gE蛋白质是HSV-l(CL101)gE蛋白质。在 另一实施例中，gE蛋白质是HSV-l (麦金泰尔(MacIntyre)) gE蛋白质。在另一实施 例中，gE蛋白质是HSV-1 (MP) gE蛋白质。在另一实施例中，gE蛋白质是 HSV-l(17+syn) gE蛋白质。在另一实施例中，gE蛋白质是HSV-l(KOS) gE蛋白质。 在另一实施例中，gE蛋白质是业内己知的任何其它HSV-1 gE蛋白质。
在一个实施例中，gE蛋白质是HSV-2 gE蛋白质。在另一实施例中，gE蛋白质 是HSV-2(HG52)gE蛋白质。在另一实施例中，gE蛋白质是HSV-2(2.12) gE蛋白质。 在另一实施例中，gE蛋白质是HSV-2(MS) gE蛋白质。在另一实施例中，gE蛋白质 是HSV-2(186) gE蛋白质。在另一实施例中，gE蛋白质是HSV-2(G) gE蛋白质。在 另一实施例中，gE蛋白质是业内已知的任何其它HSV-2 gE蛋白质。
在另一实施例中，gE蛋白质是任何其它HSV-l或HSV-2gE蛋白质，其在一个 实施例中与上文所列示的一种gE蛋白质或核酸序列具有80%以上的同源性，在另一 实施例中具有85%以上的同源性，在另一实施例中具有95%以上的同源性，且在另一 实施例中具有98%以上的同源性。在另一实施例中，gE蛋白质与HSV(NS)或HSV(17) 或二者具有98.6%的同源性。
在一个实施例中，gE蛋白质是业内已知的任何其它gE蛋白质。在另一实施例中， gE蛋白质是由业内已知的任何Us8核苷酸编码。在一个实施例中，Us8基因所具有 的核酸序列对应于基因库登录号GenelD:2703448或GeneID: 1487360所示的核酸序 列，或编码糖蛋白E的蛋白质序列，其在一个实施例中对应于基因库登录号 NP—044670.1或NP—044538.1所示者。
在一个实施例中，本发明方法的和用于本发明方法中的HSV菌株包含额外失活 突变，其在一个实施例中是Us6基因失活。在一个实施例中，Us6基因所具有的核酸 序列对应于基因库登录号GenelD:2703444 、 GeneID: 1487358 、 NC_001806、 NC—001798、 EU029158、 EF177451、 EF177450、 EF157322、 EF157321、 EF157320、 EF157319、 Z86099、 AJ004801 、 X14112、 AF147806、 AY779754、 AY779753、 AY779752、 AY779751、 AY779750、 AY517492、 AY155225、 AB016432、 AF02B42、 U12183、 U12182、 U12181、 U12180、或InterPro:IPR002896所示的核酸序列，或编码糖蛋白D 的蛋白质序列，其在一个实施例中，对应于以下基因库登录号所示者NP—044668.1、 NP一044536.1 、 CAA38245 、 AAB59754 、 AAA 19629 、 AAA19631 、 AAA19630 、AAK93950 、 ABS84899 、 ABM66848 、 ABM66847 、 AAW23134 、 AAW23133 、 AAW23132、 AAW23131、 AAW23130、 AAS01730 、 ABM52981 、 ABM52980 、 ABM52979、 ABM52978、 AAN74642、 AA026211、 AAL90884、 AAL90883、 AAK19597、 AAA45785、 BAA00020、 AAB60555、 AAB60554、 AAB60553、 AAB60552、 AAA98962、 AAA98963、 AAA45842、 AAA45786、 VGBEDZ、 CAB06713、 CAA32283、 AAB72102、 或CAB06713.1。
在另一实施例中，gD蛋白质是任何其它HSV-l或HSV-2gD蛋白质，其在一个 实施例中与上文所列示的一种gD蛋白质或核酸序列具有80%以上的同源性，在另一 实施例中具有85%以上的同源性，在另一实施例中具有95%以上的同源性，且在另一 实施例中具有98%以上的同源性。
在一个实施例中，本发明方法的和用于本发明方法中的HSV菌株包含额外失活 突变，其在一个实施例中是Us9基因失活。在一个实施例中，Us9基因所具有的核酸 序列对应于基因库登录号GenelD:2703452或GeneID: 1487362所示的核酸序列，或编 码Us9膜蛋白质的蛋白质序列，其在一个实施例中对应于基因库登录号NPJ)44672.1 或NPJ)44540.1所示者。
在一个实施例中，本发明方法的和用于本发明方法中的HSV菌株包含额外失活 突变，其在一个实施例中是Us5基因失活。在一个实施例中，Us5基因所具有的核酸 序列对应于基因库登录号GenelD:2703406或GeneID: 1487357所示的核酸序列，或编 码糖蛋白J的蛋白质序列，其在一个实施例中对应于基因库登录号NP—044667.1或 NP—044535.1所示者。
在一个实施例中，本发明方法的和用于本发明方法中的HSV菌株包含额外失活 突变，其在一个实施例中是Us4基因失活。在一个实施例中，Us4基因所具有的核酸 序列对应于基因库登录号GenelD:2703404或GeneID: 1487356所示的核酸序列，或编 码糖蛋白G的蛋白质序列，其在一个实施例中对应于基因库登录号NP_044666.1或 NP—044534.1所示者。
在一个实施例中，本发明方法的和用于本发明方法中的HSV菌株包含额外失活 突变，其在一个实施例中是UL53基因失活。在一个实施例中，UL53基因所具有的 核酸序列对应于基因库登录号GenelD:2703425或GeneID: 1487342所示的核酸序列， 或编码糖蛋白K的蛋白质序列，其在一个实施例中对应于基因库登录号NP_044656.1 或NP—044524.1所示者。
在一个实施例中，本发明方法的和用于本发明方法中的HSV菌株包含额外失活 突变，其在一个实施例中是UL10基因失活。在一个实施例中，UL10基因所具有的 核酸序列对应于基因库登录号GenelD:2703379或GeneID: 1487293所示的核酸序列， 或编码糖蛋白M的蛋白质序列，其在一个实施例中对应于基因库登录号NPJ)44611.1 或NPJ)44479.1所示者。
在一个实施例中，本发明方法的和用于本发明方法中的HSV菌株包含额外失活
33突变，其在一个实施例中是UL1基因失活。在一个实施例中，UL1基因所具有的核 酸序列对应于基因库登录号GenelD:2703393或GeneID: 1487292所示的核酸序列，或 编码糖蛋白L的蛋白质序列，其在一个实施例中对应于基因库登录号NP—044602.1 或NP—044470.1所示者。
在一个实施例中，本发明方法的和用于本发明方法中的HSV菌株包含额外失活 突变，其在一个实施例中是UL22基因失活。在一个实施例中，UL22基因所具有的 核酸序列对应于基因库登录号GenelD:2703373或GeneID: 1487306所示的核酸序列， 或编码糖蛋白H的蛋白质序列，其在一个实施例中对应于基因库登录号NP—044623.1 或NP—044491.1所示者。
在一个实施例中，本发明方法的和用于本发明方法中的HSV菌株包含额外失活 突变，其在一个实施例中是UL27基因失活。在一个实施例中，UL27基因所具有的 核酸序列对应于基因库登录号GenelD:2703455或GeneID: 1487312所示的核酸序列， 或编码糖蛋白B的蛋白质序列，其在一个实施例中对应于基因库登录号NPJ)44629.1 或NPJ)44497.1所示者。
在一个实施例中，本发明方法的和用于本发明方法中的HSV菌株包含额外失活 突变，其在一个实施例中是UL44基因失活。在一个实施例中，UL44基因所具有的 核酸序列对应于基因库登录号GenelD:2703410或GeneID: 1487331所示的核酸序列， 或编码糖蛋白C的蛋白质序列，其在一个实施例中对应于基因库登录号NPJ)44646.1 或NPJ)44514.1所示者。
在一个实施例中，本发明方法的和用于本发明方法中的HSV菌株包含额外失活 突变，其在一个实施例中是UL49a基因失活。在一个实施例中，UL49a基因所具有 的核酸序列对应于基因库登录号GenelD:2703419或GeneID: 1487337所示的核酸序 列，或编码糖蛋白N的蛋白质序列，其在一个实施例中对应于基因库登录号 NP_044652.1或NP—044520.1所示者。
在另一实施例中，额外突变是在HSV-1或HSV-2糖蛋白中，在一个实施例中其 与上文所列示的一或多种糖蛋白具有80%以上的同源性，在另一实施例中具有85% 以上的同源性，在另一实施例中具有95%以上的同源性，且在另一实施例中具有98% 以上的同源性。
在一个实施例中，本发明的和用于本发明中的HSV菌株在编码gD的基因中包 含失活突变，在一个实施例中所述基因是Us6。在另一实施例中，本发明的和用于本 发明中的HSV菌株在编码gE的基因中包含失活突变，在一个实施例中所述基因是 Us8。在另一实施例中，本发明的和用于本发明中的HSV菌株在编码gE的基因和编 码gD的基因中包含失活突变。在一个实施例中，引入Us6突变以衰减包含Us8突变 的高毒力HSV菌株的毒力。在一个实施例中，Us6突变可减少病毒入侵。Us6突变以 及本发明的任何突变可在HSV-1或HSV-2或二者中。在一个实施例中，HSV-1 gD 与HSV-2 gD具有较大程度的同源性。在一个实施例中，HSV-1 gD与HSV-2 gD的氨基酸序列具有81%的同源性，或在另一实施例中80%以上的同源性，或在另一实施例
中85%以上的同源性，或在另一实施例中90%以上的同源性，或在另一实施例中95% 以上的同源性。在一个实施例中，HSV-1 gD与HSV-2gD的核酸序列具有85呢的同 源性，或在另一实施例中80%以上的同源性，或在另一实施例中85%以上的同源性， 或在另一实施例中90%以上的同源性，或在另一实施例中95%以上的同源性。 在一个实施例中，本发明方法和组合物中得到的gD蛋白质具有以下序列 MGGTAARLGAVILFWIVGLHGVRGKYALADASLKMADPNRFRGKDLPVLD GLTDPPGVRRVYHIQAGLPDPFQPPSLPITVYYAVLERACRSVIXNAPSEAPQIVRG ASEDVRKQPYNLTIAWFRMGGNCAIPITVMEYTECSYNKSLGACPIRT(2PR丽YY DSFSAVSEDNLGFLMHAPAFETAGTYLRLV腿DWTEIT(2FILEHRAKGSCKYALP LRIPPSACLSPQAYGGGVTVDSIGMLPRFIPENQRTVAVYSLKIAGWHGPKAPYTST LLPPELSETPNAT(3PELAPEDPEDSALLEDPVGTVAPQIPPNWHIPSI(5DAATPYHPP ATPNNMGLIAGAVGGSLLAALVICGIVYWMHRRTRKAPKRIRLPHIREDDq PSSHQPL (SEQ ID No: 14)。在另一实施例中，gD蛋白质是SEQ ID No: 14的同源物。 在另一实施例中，gD蛋白质是SEQIDNo: 14的变体。在另一实施例中，gD蛋白质 是SEQIDNo: 14的异构体。在另一实施例中，gD蛋白质是SEQ ID No: 14的片段。 在另一实施例中，gD蛋白质包含SEQIDNo: 14。在一个实施例中，gD氨基酸序列 是HSV-1氨基酸序列。
在另一实施例中，gD蛋白质是由具有以下序列的核苷酸序列编码 gtggccccggcccccaacaaaaatcacggtagcccggccgtgtgacactatcgtccataccgaccacaccgacgaaccc ctaagggggaggggccattttacgaggaggaggggtataacaaagtctgtctttaaaaagcaggggttagggagttgttcggtcat aagcttcagcgcgaacgaccaactaccccgatcatcagttatccttaaggtctcttttgtgtggtgcgttccggtatgggggggactg ccgccaggttgggggccgtgattttgtttgtcgtcatagtgggcctccatggggtccgcggcaaatatgccttggcggatgcctctct caagatggccgaccccaatcgctttcgcggcaaagaccttccggtcctggaccagctgaccgaccctccgggggtccggcgcgt gtaccacatccaggcgggcctaccggacccgttccagccccccagcctcccgatcacggtttactacgccgtgttggagcgcgcc tgccgcagcgtgctcctaaacgcaccgtcgg鄉ccccccagattgtccgcggggcctccgaagacgtccggaaacaacccta caacctgaccatcgcttggtttcggatgggaggcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgctcctacaacaa gtctctgggggcctgtcccatccgaacgcagccccgctggaactactatgacagcttcagcgccgtcagcgaggataacctgggg ttcctgatgcacgcccccgcgtttgagaccgccggcacgtacctgcggctcgtgaagataaacgactggacggagattacacagtt tatcctggagc3ccgagcc3agggctcctgtaagtacgccctcccgctgcgc3tccccccgtcagcctgcctctccccccaggcc taccagcagggggtgacggtggacagcatcgggatgctgccccgcttcatccccgagaaccagcgcaccgtcgccgtatacag cttgaagatcgccgggtggcacgggcccaaggccccatacacgagcaccctgctgcccccggagctgtccgagacccccaacg ccacgcagccagaactcgccccggaagaccccgaggattcggccctcttggaggaccccgtggggacggtggcgccgcaaat cccaccaaactggcacatcccgtcg3tccaggacgccgcgacgccttaccatcccccggcc3ccccgaac3ac吨ggcctg3t cgccggcgcggtgggcggcagtctcctggcagccctggtcatttgcggaattgtgtactggatgcaccgccgcactcggaaagc ccc犯agcgcatacgcctcccccacatccgggaagacgaccagccgtcctcgcaccagcccttgttttactagatacccccccttaatgggtgcgggggggtcaggtctgcggggttgggatgggaccttaactccatataaagcgagtctggaaggggggaaaggcgg
(SEQ ID No: 15)。在另一实施例中，gD蛋白质是由为SEQ ID No: 15同源物的核苷酸 分子编码。在另一实施例中，核苷酸分子是SEQIDNo: 15的变体。在另一实施例中， 核苷酸分子是SEQIDNo:15的异构体。在另一实施例中，核苷酸分子是SEQ ID No: 15的片段。在另一实施例中，核苷酸分子包含SEQIDNo: 15。在一个实施例中，gD 核苷酸序列是HSV-1核苷酸序列。
在一个实施例中，本发明方法和组合物中所述的gD蛋白质具有以下序列 MGRLTSGVGTAAIXVVAVGL證CAKYALADPSL腿ADPNRFRGKNLPVLD GLTDPPGVKRVYHIQPSLEDPFQPPSIPITVYYAVLERACRSVLLHAPSEAPQ1VRG ASDEARKHTYNLTIAWYRMGDNCAIPITVMEYTECPYNKSLGVCPIRTQPRWSYY DSFSAVSEDNLGFLMHAPAFETAGTYLRLVK歸WTEITQFILEHRARASCKYALP
LLPPELSDTTNATQPELVPEDPEDSALLEDPAGTVSSQIPPNWHIPSIGDVAPHHAPA APSNPGLIIGALAGSTLAVLVIGGIAFWVRRRACJMAPKRLRLPHIRDDDAPPSHGPL FY (SEQ ID No: 16)。在另一实施例中，gD蛋白质是SEQ ID No: 16的同源物。在另 一实施例中，gD蛋白质是SEQ ID No: 16的变体。在另一实施例中，gD蛋白质是SEQ ID No: 16的异构体。在另一实施例中，gD蛋白质是SEQIDNo: 16的片段。在另一 实施例中，gD蛋白质包含SEQIDNo: 16。在一个实施例中，gD氨基酸序列是HSV-2 氨基酸序列。
在另一实施例中，gD蛋白质是由具有以下序列的核苷酸序列编码 atggggcgtt tgacctccgg cgtcgggacg gcggccctgc tagttgtcgc ggtgggactc cgcgtcgtct gcgccaaatacgccttagca gacccctcgc ttaagatggc cgatcccaat cgatttcgcg ggaagaacct tccggttttg gaccagctga ccgacccccc cggggtgaag cgtgtttacc acattcagcc gagcctggag gacccgttcc agccccccag catcccgatc actgtgtact acgcagtgct ggaacgtgcc tgccgcagcg tgctcctaca tgccccatcg gaggcccccc agatcgtgcg cggggcttcg gacgaggccc gaaagcacac gtacaacctg accatcgcct ggtatcgcat gggagacaat tgcgctatcc ccatcacggt tatggaatac accgagtgcc cctacaacaa gtcgttgggg gtctgcccca tccgaacgca gccccgctgg agctactatg acagctttag cgccgtcagc gaggataacc tgggattcct gatgcacgcc cccgccttcg agaccgcggg tacgtacctg cggctagtga agataaacga ctggacggag atcacacaat ttatcctgga gcaccgggcc cgcgcctcct gcaagtacgc tctccccctg cgcatccccc cggcagcgtg cctcacctcg aaggcctacc aacagggcgt gacggtcgac agcatcggga tgctaccccg ctttatcccc gaaaaccagc gcaccgtcgc cctatacagc ttaaaaatcg ccgggtggca cggccccaag cccccgtaca ccagcaccct gctgccgccg gagctgtccg acaccaccaa cgccacgcaa cccgaactcg ttccggaaga ccccgaggac tcggccctct tagaggatcc cgccgggacg gtgtcttcgc agatcccccc aaactggcac atcccgtcga tccaggacgt cgcgccgcac cacgcccccg ccgcccccag caacccgggc ctgatcatcg gcgcgctggc cggcagtacc ctggcggtgc tggtcatcgg cggtattgcg ttttgggtac gccgccgcgc tcagatggcc cccaagcgcc tacgtctccc ccacatccgg gatgacgacg
36cgcccccctcgcaccagcca ttgttttact ag (SEQ ID No: 17)。在另一实施例中，gD蛋白质是由 为SEQIDNo: 17同源物的核苷酸分子编码。在另一实施例中，核苷酸分子是SEQID No:17的变体。在另一实施例中，核苷酸分子是SEQIDNo: 17的异构体。在另一实 施例中，核苷酸分子是SEQID No: 17的片段。在另一实施例中，核苷酸分子包含SEQ ID No: 17。在一个实施例中，gD核酸序列是HSV-2核酸序列。
在一个实施例中，编码gD的基因中的失活突变包含HSV-1 gD或HSV-2 gD的 氨基酸3上的丙氨酸突变成半胱氨酸的突变(A3C)。在另一实施例中，编码gD的基 因中的失活突变包含以下突变HSV-1 gD或HSV-2 gD的残基3上的丙氨酸突变成 半胱氨酸(A3C)、残基2上的酪氨酸突变成丙氨酸(Y2A)、残基4上的亮氨酸突变成丙 氨酸(L4A)或其组合。在另一实施例中，编码gD的基因中的失活突变包含HSV-1 gD 或HSV-2gD的残基3上的丙氨酸缺失、残基2上的酪氨酸缺失、残基4上的亮氨酸 缺失或其组合。在另一实施例中，编码gD的基因中的失活突变包含氨基酸位置38、 222、 223、 215或其组合上的突变。在另一实施例中，编码gD的基因中的失活突变 包含Y38C突变，而在另一实施例中，其包含R222N、 F223I、 D215G突变或其组合。
在另一实施例中，编码gD的基因中的失活突变包含氨基酸2和3、 3和4、 2-4、 1-5、 1-7、或1-10中的突变。在另一实施例中，编码gD的基因中的失活突变基本上 由HSV-1 gD或HSV-2 gD的氨基酸3上的丙氨酸突变成半胱氨酸的突变(A3C)组成。 在另一实施例中，编码gD的基因中的失活突变由HSV-1 gD或HSV-2gD的氨基酸3 上的丙氨酸突变成半胱氨酸的突变(A3C)组成。在一个实施例中，用于描述突变位置 的编号方式是指在信号序列裂解后成熟肽的氨基酸编号方式，在一个实施例中，其为 HSV-1或HSV-2 gD的最初25个氨基酸，如业内所习知。
依照本文且在一个实施例中，包含gD中的突变的本发明突变体HSV菌株具有 降低的毒力(实例21)且能够到达DRG (实例22)。在另一实施例中，用本发明包 含gD中的突变的突变体HSV菌株接种疫苗可在后来感染有毒HSV后防止潜伏HSV 感染(实例23)。在另一实施例中，接种疫苗可防止由潜伏HSV感染引起或与其有 关的疾病。在另一实施例中，接种疫苗本身不会引起明显疾病。
在一些实施例中，在本文所述的任何形式或实施例中，本发明方法的和用于本发 明方法的任何突变体HSV菌株将包含本发明的失活突变。在一些实施例中，在本文 所述的任何形式或实施例中，本发明的任何突变体HSV菌株将由本发明的失活突变 组成。在一些实施例中，在本文所述的任何形式或实施例中，本发明的突变体HSV 菌株将基本上由本发明的失活突变组成。在一些实施例中，术语"包含"是指包括诸 如gE或gD中的突变等失活突变、以及包括业内已知的其它突变。在一些实施例中， 术语"基本上由其组成"是指仅菌株的功能突变是指定的功能突变，然而，也可包括 与菌株效用不直接相关的其它突变。在一些实施例中，术语"由其组成"是指菌株含 有特定基因的突变或特定突变。
在一个实施例中，可使用质粒互补来补充失活突变，在一个实施例中，此容许至少一轮本发明突变体HSV感染。
在一个实施例中，本发明提供用于阻止个体中形成带状疱疹样损伤的组合物，所
述组合物包含本发明的突变体HSV菌株。
在一个实施例中，本发明提供用于阻止个体中疱疹性眼睛疾病的组合物，所述组
合物包含本发明的突变体HSV菌株。
在一个实施例中，本发明提供用于向个体接种疫苗以防HSV感染的组合物，所 述组合物包含本发明的突变体HSV菌株。
在一个实施例中，本发明提供用于阻止个体中HSV感染的组合物，所述组合物 包含本发明的突变体HSV菌株。
在一个实施例中，本发明提供用于阻止个体中疱疹介导的脑炎的组合物，所述组 合物包含本发明的突变体HSV菌株。
在一个实施例中，本发明gE蛋白质与本文所揭示或列举的肽同源。在一个实施 例中，当提及任何蛋白质或肽时，术语"同源性"、"同源的"等是指在比对序列并 引入间隙(若需要，以达成最大百分比同源性)后候选序列中与对应天然多肽残基相 同的氨基酸(AA)残基的百分比，且不应将任何保守置换视为序列一致性的一部分。用 于比对的方法和计算机程序在业内已众所周知。
在一个实施例中，同源性是通过业内充分阐述的方法通过用于序列比对的计算机 算法来测定。例如，核酸序列同源性的计算机算法分析可包括使用任何数量的可用软 件包，例如BLAST、 DOMAIN、 BEAUTY (BLAST增强比对效用(BLAST Enhanced Alignment Utility)) 、 GENPEPT和TREMBL包。
在一个实施例中，"同源性"是指与选自SEQ ID No: 2-7的序列具有70%以上 的一致性。在另一实施例中，"同源性"是指与选自SEQ ID No: 2-7的序列具有72% 以上的一致性。在另一实施例中，"同源性"是指与SEQIDNo:2-7之一具有75%以 上的一致性。在另一实施例中，"同源性"是指与选自SEQ ID No: 2-7的序列具有 78%以上的一致性。在另一实施例中，"同源性"是指与SEQ ID No: 2-7之一具有80% 以上的一致性。在另一实施例中，"同源性"是指与SEQIDNo:2-7之一具有82呢以 上的一致性。在另一实施例中，"同源性"是指与选自SEQ ID No: 2-7的序列具有 83%以上的一致性。在另一实施例中，"同源性"是指与SEQ ID No: 2-7之一具有85% 以上的一致性。在另一实施例中，"同源性"是指与SEQ ID No: 2-7之一具有87%以 上的一致性。在另一实施例中，"同源性"是指与选自SEQ ID No: 2-7的序列具有 88%以上的一致性。在另一实施例中，"同源性"是指与SEQ ID No: 2-7之一具有90% 以上的一致性。在另一实施例中，"同源性"是指与SEQIDNo:2-7之一具有92免以 上的一致性。在另一实施例中，"同源性"是指与选自SEQ ID No: 2-7的序列具有 93%以上的一致性。在另一实施例中，"同源性"是指与SEQ ID No: 2-7之一具有95% 以上的一致性。在另一实施例中，"同源性"是指与选自SEQ ID No: 2-7的序列具有 96%以上的一致性。在另一实施例中，"同源性"是指与SEQIDNo:2-7之一具有979fc
38以上的一致性。在另一实施例中，"同源性"是指与SEQIDNo:2-7之一具有98呢以 上的一致性。在另一实施例中，"同源性"是指与SEQIDNo:2-7之一具有99免以上 的一致性。在另一实施例中，"同源性"是指与SEQIDNo:2-7之一具有100呢的一致性。
在一个实施例中，同源性是经由测定候选序列杂交来测定，此方法业内已充分阐 述(参见，例如，"核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)",黑姆斯(Hames BD)和希 金斯(HigginsSJ)编辑，(1985);萨姆布鲁克等人，2001，分子克隆-实验室手册，冷泉 港出版社，纽约；和奥苏贝尔(Ausubel)等人，1989，分子生物学现行方案(Current Protocols in Molecular Biology),格林出版协会和约翰威立公司(Green Publishing Associates and Wiley Interscience)，纽约)。在其它实施例中，在中等至严格条件下实 施与编码天然半胱天冬酶肽的DNA补体的杂交方法。例如，杂交条件为在42'C下于 包含以下的溶液中过夜培育10-20%甲酰胺、5XSSC (150mMNaCl、 15 mM柠檬 酸三钠)、50 mM磷酸钠(pH 7.6)、 5 X丹哈德溶液(Denhardt's solution)、 10%硫酸葡 聚糖、和20 pg/ml变性已剪切的鲑鱼精DNA。
在一个实施例中，通过业内充分阐述的方法(包括免疫印迹分析)或经由AA序 列的计算机算法分析使用众多可用软件包的任何一种经由既定方法来测定本文所列 示任何AA序列的蛋白质和/或肽同源性。这些软件包的一些包括FASTA、 BLAST、 MPsrch或Sca叩s软件包，且在另一实施例中，例如，利用使用史密斯(Smith)和沃特 曼(Waterman)算法、禾口/或全局/局部(global/local)或BLOCKS比对来分析。
在一个实施例中，"变体"是指与大多数群体不同但与普通模式仍然充分类似可 视为其中之一的氨基酸或核酸序列(或在其它实施例中是生物体或组织)，例如剪接 变体。
在一个实施例中，"异构体"是指由相同元素以相同比例构成但由于原子排列不 同而具有不同化学和/或生物学特性的两种或更多种物质中的任何一种，在一个实施
例中其为立体异构体，在另一实施例中其为组成型异构体或互变异构体。在一个实施 例中，异构体是光学异构体或对映异构体、几何异构体、D-和L-异构体、位置异构 体、或顺-反异构体。
在本发明的一个实施例中，"核酸"或"核苷酸"是指至少两个碱基-糖-磷酸组 合的串。在一个实施例中，所述术语包括DNA和RNA。在一个实施例中，"核苷酸" 是指核酸聚合物的单体单元。在一个实施例中，RNA呈以下形式tRNA(转移RNA)、 snRNA (小核RNA) 、 rRNA (核糖体RNA) 、 mRNA (信使RNA)、反义RNA、 小抑制RNA (siRNA)、微小RNA (miRNA)和核酶。siRNA和miRNA的用途已有阐述 (考迪(Caudy AA)等人，基因与发育(Genes & Devel) 16: 2491-96和其中所引用的参考 文献)。在其它实施例中，DNA可呈质粒DNA、病毒DNA、线状DNA、或染色体 DNA或这些类别DNA的衍生物形式。另外，这些DNA和RNA形式可为单链、双 链、三链、或四链。在另一实施例中，所述术语也包括含有其它类型主链但相同碱基的人工核酸。在一个实施例中，人工核酸是PNA (肽核酸)。PNA含有肽主链和核 苷酸碱基且在一个实施例中能够结合DNA和RNA分子二者。在另一实施例中，核 苷酸经环氧丙垸修饰。在另一实施例中，通过用硫代磷酸酯键代替一或多个磷酸二酯 键对核苷酸进行修饰。在另一实施例中，人工核酸含有业内已知的天然核酸的磷酸主 链的任何其它变体。硫代磷酸酯核酸和PNA的使用已为所属领域的技术人员所习知， 且阐述于(例如)尼尔森(Neilsen PE)，结构生物学新观点(Curr Opin Struct Biol) 9:353-57;和拉兹(Raz NK)等人，生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem Biophys Res Commun.) 297:1075-84。核酸的产生和使用已为所属领域的技术人员所习知，且 阐述于(例如)分子克隆(Molecular Cloning), (2001)，萨姆布鲁克和拉塞尔(Russell) 编辑；和酶学方法真核细胞中的分子克隆方法(Methods in Enzymology: Methods for molecular cloning in eukaryotic cells), (2003)，普尔丘(Purchio)和法瑞德(G. C. Fareed)。
在一个实施例中，本发明提供包含在实施本发明方法中所使用的化合物或组合物 的试剂盒。在另一实施例中，本发明提供包含本发明组合物、工具、或装置的试剂盒。
在一个实施例中，"接触"是指使靶细胞与本发明的突变体HSV菌株直接接触。 在另一实施例中，"接触"是指使靶细胞与本发明突变体HSV菌株间接接触。因此， 在一个实施例中，本发明方法包括如下方法使个体与突变体HSV菌株接触以通过 扩散或业内已知的任何其它主动运输或被动运输过程(化合物借此在体内循环)使突 变体HSV菌株与靶细胞接触。
在本发明方法的一个实施例中，突变体HSV菌株在个体血流中被携带到靶细胞。 在另一实施例中，通过扩散将突变体HSV菌株携带到靶细胞。在另一实施例中，通 过主动运输将突变体HSV菌株携带到靶细胞。在另一实施例中，突变体HSV菌株是 以可直接接触靶细胞的方式投与到个体中。
医药组合物和投与方法
在一个实施例中，本发明方法包含投与包含突变体HSV菌株和医药上可接受的 载剂的医药组合物。
在一个实施例中，"医药组合物"是指治疗有效量的活性成份(即突变体HSV 菌株)与医药上可接受的载剂或稀释剂。在一个实施例中，"治疗有效量"是指对于 给定病状和投与方案可提供治疗效果的量。
在一个实施例中，可通过所属领域的技术人员所习知的任何方法将含有突变体 HSV菌株的医药组合物投与到个体中，例如非经肠、经粘膜、经皮、肌内、静脉内、 皮内、皮下、腹膜腔内、心室内、颅内、阴道内或瘤内。
在如本发明方法和组合物中所述的另一实施例中，医药组合物是经口投与，且因 此以适于经口投与的形式经调配，即以固体或液体制剂形式。适宜固体经口调配物包 括片剂、胶囊、丸剂、颗粒剂、小药丸和其类似物。适宜液体经口调配物包括溶液、 悬浮液、分散液、乳液、油状物和其类似物。在本发明的另一实施例中，将活性成份 调配于胶囊中。根据此实施例，除活性化合物和惰性载剂或稀释剂外，本发明组合物
40也包含硬凝胶化胶囊。
在另一实施例中，所述医药组合物是通过静脉内、动脉内、或肌内注射液体制剂 来投与。适宜液体调配物包括溶液、悬浮液、分散液、乳液、油状物和其类似物。在 另一实施例中，所述医药组合物是经静脉内投与且因此将其调配成适于静脉内投与的 形式。在另一实施例中，所述医药组合物是经动脉内投与且因此将其调配成适于动脉 内投与的形式。在另一实施例中，所述医药组合物是经肌内投与且因此将其调配成适 于肌内投与的形式。
在另一实施例中，所述医药组合物是经局部投与到身体表面且因此将其调配成适 于局部投与的形式。适宜局部调配物包括凝胶、软膏、乳膏、洗剂、滴剂和其类似物。 对于局部投与，制备突变体HSV菌株并以存于含有或不含有医药载剂的生理学上可 接受的稀释剂中的溶液、悬浮液、或乳液形式施用。
在另一实施例中，本文提供的医药组合物是受控释放组合物，即组合物中的突变 体HSV菌株在投与后经一段时间释放出来。受控或持续释放组合物包括存于亲脂贮
藏物质(例如脂肪酸、蜡、油)中的调配物。在另一实施例中，所述组合物是立即释
放组合物，即组合物中的所有突变体HSV菌株在投与后立即释放出来。
上文添加剂、赋形剂、调配物和投与方法中的每一者均代表本发明的单独实施例。
实验细节部分
实例l: HSV(化蹄)不引起疾病 材料和实验方法(实例l-4)
錄泰萝拔
使用低传代数临床分离物野生型HSV-1菌株NS来产生突变体病毒。为构建 HSV-1 (gE无效)，用Xbal将全部gE编码序列自pCMV3gE-l切除并克隆到pSPT18中。 pSPT18具有以下序列
gaatacaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccgggtaccgagctcgaattccggtctccctatagtgagt cgtattaatttcgataagccagctgggcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggt cacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcag ccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatatactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccat atgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcg ctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcagga aagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccc cctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctg gaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttct caatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgac cgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacag gattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttg gtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagt
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cagcccagtagtaggttgaggccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtccccc
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gtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgtagaggatctggctag
cgatgaccctgctgattggttcgctgaccatttccgggtgcgggacggcgttaccagaaactcagaaggttcgtccaaccaaaccg
actctgacggcagtttacgagagagatgatagggtctgcttcagtaagccagatgctacacaattaggcttgtacatattgtcgttaga
acgcggctacaattaatac3t犯ccttatgtatc加cacatacgatttaggtgac3ctata (SEQ ID No: 1)。
自氨基酸(AA) 124-508切除1.1 kb HpaI-BglII片段，并将Hpal位点改变成BglII 位点。将在HSVICP6启动子控制下来源于含有大肠杆菌(Kyc/^n'c&a co"') |3-半乳糖苷 酶基因(p-gal)的pD6P的4.3 kb片段克隆到BglII位点中。所得载体含有ICP6::lacZ盒 的374 bp NS DNA序列5'和225 bp 3'并使用其来构建gE无效病毒。分离出含有侧翼 序列载体的Xbal片段，并将750 ng Xbal片段与1.0昭NS DNA通过磷酸钙转染共转 染到非洲绿猴肾细胞(Verocell)中。移除DNA-磷酸钙混合物，并用15%甘油使细胞休 克。当在30-40%的细胞中观察到细胞病变效应时，收获细胞并实施超声处理以制备 病毒库。通过感染非洲绿猴肾细胞并覆盖0.5%琼脂糖、5.0呢胎牛血清(FBS)、和300昭 5-溴-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)来选择表达(3-gal的重组gE无效病毒。挑选蓝色噬斑并 在X-Gal琼脂糖覆盖物中纯化两次并通过限制稀释纯化一次。在5-70%蔗糖梯度上自 受感染非洲绿猴肾细胞的上清液提纯病毒。
通过用1.0昭NS-gE无效DNA和1.5昭野生型gE片段(纯化自pCMV3gE-l) 共转染非洲绿猴肾细胞来制备HSV-l(g救gE无效)，pCMV3gE-l是通过用Nrul消化HSV-1(NS) DNA来获得。通过使用抗gE MAb 1BA10实施免疫过氧化物酶染色来检查子代 病毒以证实gE在受感染细胞表面上表达。通过限制稀释来纯化噬斑，并制备病毒库。 使病毒原液以2.0 MOI在汇合非洲绿猴肾细胞(Vero cell)(非洲绿猴肾上皮细胞 系)上生长。感染后24小时，在培养基中刮除细胞并在3,000 xg下离心。移除差不 多lmL上清液，并再悬浮细胞，超声处理3秒并分配成50mcL (微升)分液。对于 模拟感染，使用未经感染细胞来制备类似分液。 </、嚴纖,染方菜
所有实验方案均经宾夕法尼亚州大学(University of Pennsylvania)动物和实验室 资源IACUC委员会批准。使五周至六周龄BalbC小鼠(美国国家癌症研究所(National Cancer Institute))适应恒定温度和光周期(12小时光照，12小时黑暗)的生物安全2 级动物设施达1周。给小鼠剃毛并用脱毛乳膏(奈尔(Nair)TM)沿右侧腹(用于接种 疫苗)或左侧腹(用于攻击)进行脱毛，随后用温水洗涤。第二天，经由腹膜腔内注 射75 mcL存于PBS中的14.3 mg/ml氯胺酮和1.8 mg/ml甲苯噻嗪使小鼠麻醉，随后 通过在1 cn^侧腹面积(距脊柱1 cm的背侧)中用26号(3/8)计量注射针表面刮痕60 次借助10 mcL含有5x 103 - 5 x 105 pfu HSV的微滴进行感染(图1)。在侧腹受HSV 感染的小鼠中，自一或多个脊神经节的神经元继发性扩散回皮肤导致带状损伤(图2)。 通过用C02窒息、继之颈椎脱臼宰杀小鼠。自接种后第3天开始以24小时间隔观察 小鼠以记录皮肤损伤和疾病的外观和严重程度。使用用以描述损伤严重程度的标准化 评分系统来使观察结果一致(图3)。 麥辨资劳微击
对于接种疫苗，通过在右侧腹上造成刮痕借助含有HSV-1 (gE无效)或无病毒 细胞溶解产物(上文所述)的接种物使小鼠受感染。28天后借助含有1 x 105 pfuHSV-l (NS)的微滴通过刮痕在相对(左)侧腹上对小鼠进行攻击。 麟紫餅经微激
取下沿脊柱右侧(用于接种HSV-1
(gE无效)
疫苗或HSV-1 (拯救gE无效) 感染分析)或 左侧(用于HSV-1(NS)攻击分析)的背根神经节(DRG)，集中并置于110mcLDMEM (2.5呢FBS)中并在-8(TC下冷冻，直至分析。
取下接种位点处1 crr^面积的皮肤。将一半样品置于含有110mcLDMEM(2.5% FBS)的管中并在-8(TC下冷冻直至分析。将另一半置于含有类似样品的索引卡上并在4 。C下于存于1XPBS中的4%多聚甲醛中浸没24小时，随后用1XPBS代替所述溶液。 将样品保存在4'C下直至组织学分析处理。 薪、资织学微鄉织众学
由费城儿童医院(Children's Hospital of Philadelphia)的病理学核心设施(Pathology Core Facility)对皮肤样品实施石蜡包埋、切片和染色。使用抗HSV-1兔多克隆抗体 (DAKO)针对HSV-1抗原对皮肤切片进行染色并用苏木素对比染色。
43通过103.5、 104'5、或105'5噬斑形成单位(pfu)疫苗菌株HSV-l(gE无恥划痕使具有 五只小鼠的群组侧腹感染。为与HSV-1的有毒形式进行比较，将具有五只小鼠的另 一群组用10"pfuHSV-l (拯救gE无效) 侧腹感染，所述HSV-1 (拯救gE无效) 疫苗菌株主链的编 码gE的基因已恢复。HSV-l(述救gE无效)感染导致疾病和60呢的死亡率(图4)。然而， 在HSV-1 (gE无效)接种疫苗后未出现疾病、病或死亡的临床体征。
另外，HSV-1麵gE无效)感染导致看似溃疡性和坏死性的严重原发性损伤(图5)。 相比之下，HSV-1 (gE，,感染导致与模拟接种疫苗无差别的接种位点处的轻微皮肤病 变。因此，在投与HSV-l(gE无奶后的所有或基本上所有皮肤病变均由刮痕接种过程本 身造成。
这些发现显示，感染gE无效疱疹病毒不会引起疾病。
实例2: HSV (&就)不在感觉神经元中扩散
HSV-1消救gE絲)感染造成严重继发性(带状疱疹样)溃疡性和坏死性损伤，所述 损伤在4-5 (感染后天数)dpi时首次出现(图6)。相比之下，HSV-l(gE无效,感染后 未看见继发性损伤。由于沿生皮节的继发性损伤形成取决于病毒沿神经元自皮肤到神 经节和随后再反向扩散的能力，因此这些结果显示疫苗不能在感觉神经元中扩散。因 此，HSV(gE无效)不能引起复发感染。
实例3: HSV^^，可在皮肤细胞中复制
为测定HSV-1 (gE无效)在皮肤细胞中的复制程度，使小鼠(n-3)感染HSV-1 (gE无效)或 有毒HSV-l(扬救gE无效)。在接种后l、 3、 6、 8和13天，宰杀小鼠，取下接种位点处的 皮肤，并集中来自每只小鼠右侧的DRG。对均质化组织进行滴定以测定其病毒含量， 揭示接种疫苗后HSV-1
(gE无效) 在皮肤中复制，但不及HSV-1
(拯救gE无效) 大量(图7)。 此外，免疫细胞浸润接种HSV-l(gE无效)疫苗的皮肤，且截止第6天病毒已被清除(图 8)。
这些结果显示HSV (gE无^在皮肤中复制，且因此预期会引发宿主炎症应答。 HSV-l(旌救gE无效)的含量超过HSV-l(gE无效)4个数量级(图9)。另外，在感染HSV-1 ^e皿)小鼠的DRG中未检测到传染性病毒。在神经节中不存在特征性带状模式损伤 和可检测病毒证实在接种HSV-1 (gE絲)疫苗后未发生神经元病毒扩散。
因此，gE不存在的HSV感染限于宿主皮肤，且免疫系统能够快速检测到病毒并 将其清除。
实例4:接种HSV-1 (w德疫苗可防止野生型HSV-1感染
在接种疫苗后28天用致死剂量的105 pfu WT HSV-1 (NS菌株)对模拟接种疫 苗或接种HSV-l(gE琉)疫苗的小鼠进行攻击。尽管100%的模拟接种疫苗的小鼠在攻 击后死亡，但100%的接种HSV-l(gE无影疫苗的小鼠历经致死攻击而存活下来(图10)。 HSV-l(gE无效)的所有测试剂量(103'5、 1045、禾口10"pfu)均可对抗攻击。另夕卜，在对 接种HSV-1 (ge m)疫苗的小鼠进行攻击后观察到非常少的原发性(接种位点)疾病(图 11)。接种疫苗小鼠的皮肤中具有不可检测到的攻击病毒含量，比模拟接种疫苗小鼠低至少5个数量级(图12)。
与严重患病的模拟接种疫苗小鼠相比，在接种疫苗的小鼠中原发性疾病快速痊 愈。为证实此观察结果，同等皮肤样品的免疫组织化学展示第3天时在接种疫苗的小 鼠中存在非常少抗原且截止第6天已清除(图13)。组织学分析也揭示，接种疫苗 的小鼠中免疫细胞明显浸润，显示疫苗成功起动宿主免疫系统。
与模拟接种疫苗小鼠中病毒带状疱疹样扩散导致严重生皮节损伤不同，在接种疫 苗小鼠中未看见带状疱疹样疾病(图14)。另外，在接种疫苗小鼠中在粉碎的DRG 中不能检测到病毒滴度，且因此，此病毒滴度较模拟接种疫苗小鼠至少低4个数量级 (图15)。
实例5:接种HSV (^m、疫苗可预防在随后攻击后 建立潜伏野生型HSV-1感染
材料和实验方法
力邀织#嫩传染丝谅泰
在宰杀后立即(在l、 3、 6、 8或13dpi)取下小鼠的DRG和皮肤样品。对于每 一数据点感染三只小鼠，但对来自这些小鼠的类似组织单独进行分析。将组织置于 110 mcL含有2.5% FBS的DMEM中并存储于-80。C下直至分析。为测定病毒滴度， 解冻组织并使用用即弃研杵将其粉碎。通过在12孔盘中对汇合非洲绿猴肾细胞进行 噬斑分析来定量存于50 mcL连续稀释(1:10、 1:100禾n l"OOO)上清液中的传染性病 毒。
为自潜伏受感染小鼠取出传染性病毒，自感染HSV-l(gE无效〕的相同(右)侧取 DRG。将来自个体小鼠的所有DRG置于12孔盘的一个孔中，所述12孔盘含有浸泡 在DMEM (2.5% FBS)中的汇合非洲绿猴肾细胞。每两天更换培养基并监测细胞的细 胞病变效应(CPE)迹象，其为DRG含有传染性病毒的指示。
结果
在攻击后28天，取出接种疫苗小鼠的DRG，并外植以使潜伏攻击病毒复活。在 取出后15只接种疫苗小鼠中仅1只的相关神经元发生复活(图16)。
此实例和先前实例的结果显示，HSV(gE通)可保护小鼠免于攻击后的神经元感染 和免于通常伴随WT HSV感染的潜伏感染发生。
实例6:给小鼠接种HSV-lAgE疫苗 可交叉保护对抗HSV-2攻击
材料和实验方法
使6-8周龄的雌性Balb/C小鼠适应所述动物设施达10天。将小鼠麻醉并剃毛并 通过奈尔(Nair)处理右侧腹移除毛发。第二天，给麻醉小鼠模拟接种疫苗或接种5x 105 pfuHSV-lAgE (在一个实施例中，其为gE无效形式)，此通过用26号(5/8)计量注
45射针刮痕60次借助10mcl (微升)接种物微滴来实施。27天后，如上将每只小鼠的 相对侧腹(左侧)剃毛和脱毛。第二天(第28天)，通过刮痕接种105pfuHSV-2 (菌 株2.12)来攻击小鼠。观察小鼠并且每天对接种位点疾病、带状疱疹样疾病和存活进 行评分。(评分0=无疾病=> 4=严重坏死性疾病)。误差棒代表平均值的标准误差 (SEM)。
结果
为测试接种HSV-lAgE疫苗防止HSV-2疾病的能力，用野生型HSV-2经表皮攻 击接种HSV4AgE疫苗的小鼠。接种HSV-lAgE疫苗的小鼠没有一只死亡，而80% 的模拟接种疫苗小鼠死亡(图17，上图)。与未接种疫苗的小鼠相比，接种疫苗的 小鼠展示可快速痊愈的接种位点疾病(图17，中图)。另外，接种疫苗小鼠经保护 完全免于模拟接种疫苗小鼠中所观察到的带状疱疹样疾病和死亡(图17，下图)。，
因此，接种AgE HSV疫苗能够保护个体以防异源HSV疾病，甚至不同物种的 单纯疱疹。
实例7:接种HSV-lAgE疫苗可对抗HSV-l(KOS) 并抑制HSV.l潜伏建立
材料和实验方法
如先前实例中所述实施疫苗接种和疾病评价，只是使用5 x 105 pfu HSV-1菌株 KOS进行攻击。为衡量潜伏感染，在攻击后第41天宰杀小鼠，并取右侧和左侧DRG， 置于DMEM/10呢FBS中，用剪刀剪碎，并外植到亚汇合的非洲绿猴肾细胞单层上。 每天检测培养物的噬斑形成(指示自潜伏状态复活)，持续20天。
结果
此实验测试接种HSV-lAgE疫苗保护小鼠免于与异源HSV-1野生型菌株有关的 疾病的能力。与未接种疫苗的小鼠相比，用野生型HSV-1菌株KOS攻击的接种HSV-1 AgE疫苗的小鼠展示可快速痊愈的接种位点疾病(图18,上图)。另夕卜，接种HSV-1 AgE疫苗可保护受HSV-lKOS攻击的小鼠完全免于带状疱疹样疾病(图18，中图)。 由于HSV-1 KOS感染对于小鼠并非致死的，因此在攻击后4周在模拟接种疫苗相对 于接种HSV-lAgE疫苗的小鼠中使用此菌株来比较病毒自潜伏状态的复活。在模拟接 种疫苗的小鼠中，来自外植DRG的HSV-1 (KOS)病毒在100%小鼠(11=10)中复活，而 接种HSV-lAgE疫苗的小鼠中仅l/10(10呢)展示复活(图18，下图表)，其可能为疫 苗或攻击病毒潜伏感染。因此，接种HSV-lAgE疫苗可有效保护小鼠免于疾病和通过 异源HSV病毒建立潜伏。
实例8:接种HSV-lAgE疫苗可对抗HSV-1阴道攻击 材料和实验方法
如实例6中所述实施疫苗接种。33天后，将于0.9% NaC1/10 mM HEPES缓冲液 中稀释至IOO mcl总体积的乙酸甲羟孕酮(2 mg)(思科医药(Sicor Pharmaceuticals)公司，加利福尼亚州尔湾(IrvineCA))经皮下注射到每只小鼠的颈部中。5天后(第38 天)，麻醉小鼠，用浸于PBS中的藻酸钙拭子擦拭阴道内，并通过阴道内滴注5x105 pfuHSV-l (菌株NS)进行攻击。使小鼠在其笼中恢复，以俯卧姿势休息。每天观察 受攻击小鼠的阴道疾病和存活情况。每天取阴道内擦拭物以用于通过在非洲绿猴肾细 胞上实施病毒滴定进行的分析。
继
测试接种HSV-lAgE疫苗对抗野生型HSV-1阴道攻击的能力。接种HSV-lAgE 疫苗的所有小鼠均历经攻击而存活下来，而60%的模拟接种疫苗小鼠死亡(图19A， 上图)。所有模拟接种疫苗小鼠均在阴道部位显示一些可见疾病体征；然而，接种 HSV-lAgE疫苗的小鼠则未显示明显可见疾病体征(图19B)。截止阴道攻击后第l 天，如在阴道擦拭物样品中所检测，接种HSV-lAgE疫苗的小鼠所具有的传染性病毒 为模拟接种疫苗动物的1/100。截止攻击后第3天，在来自接种HSV-lAgE疫苗小鼠 的擦拭物中未检测到传染性病毒，此值为相同天时模拟接种疫苗小鼠的1/至少 30,000。另外，接种HSV-lAgE疫苗的小鼠的感染清除比模拟接种疫苗小鼠快接近三 倍(图19A，下图)。因此，接种HSV-lAgE疫苗可防止死亡和与HSV-1阴道攻击 有关的疾病并赋予快速清除HSV感染的能力。
实例9:经表皮、皮下、和肌内途径接种HSV-l厶gE 疫苗均可对抗HSV.l攻击
材料和实验方法
用5 x 105 pfu HSV-lAgE通过借助10 mcl接种物微滴用26号(5/8)计量注射针刮 痕60次、经皮下注射100 mcl接种物到颈背中、或通过肌内注射100 mcl接种物到右 股后肌中来实施疫苗接种。
为衡量潜伏感染，在攻击后32天宰杀小鼠，并取右侧和左侧DRG，置于 DMEM/10% FBS中，用剪刀剪碎，并外植到亚汇合的非洲绿猴肾细胞单层上。每天 (持续15天)检测培养物的噬斑形成(指示自潜伏状态复活)。
驢
将肌内和皮下途径投与HSV-lAgE疫苗的功效与先前实例中所用的表皮划痕进 行比较。所有疫苗接种途径均可有效保护小鼠以防HSV-1(NS)表皮攻击后死亡(图20， 上图)。通过三种途径的每一种接种疫苗的小鼠在HSV-1(NS)攻击后均展示接种位点 疾病，仅略微大于模拟攻击的小鼠(图20，左下图)。通过表皮划痕或肌内注射接 种HSV-lAgE疫苗可保护小鼠完全对抗带状疱疹样疾病(图20，右下图)。攻击后， 经皮下途径接种疫苗的小鼠有1/5具有数个不连续的带状疱疹样损伤，其不严重且快 速消退(图20，右下图)。另外，也衡量疫苗防止潜伏感染的能力。经所有途径接 种HSV-lAgE疫苗均可防止潜伏建立(表l)。模拟接种疫苗的小鼠显示100%复活 (表1;也参见图18)。
47表1.经不同途径接种HSV-1疫苗均可防止HSV潜伏。
疫苗接种途径 自潜伏状态复活
模拟 1/1
表皮划痕 0/4 肌内 0/5 皮下 1/5
因此，经表皮、肌内或皮下途径投与HSV-lAgE各自均可对抗野生型HSV攻击 的急性疾病、突发和潜伏疾病。
实例10:经表皮划痕、皮下注射和肌内注射接种HSV-lAgE
疫苗可诱导中和抗体
如先前实例中所述给小鼠接种疫苗。在第21天，通过颈静脉给小鼠放血。在第 28天，如上将每只小鼠的相对侧腹(左侧)剃毛和脱毛。如下对血清样品实施中和 分析在37。C下将50 mcl血清稀释物(1:10到1:320)与5 mcl 102 pfu HSV-1 (NS) 培育1小时，并随后接种非洲绿猴肾细胞单层。
结果
衡量经表皮划痕、肌内、和皮下投与途径接种HSV-lAgE疫苗对于诱导中和抗 体的功效。经所有三种途径给小鼠接种HSV-lAgE疫苗均可诱导中和抗体形成；表皮 划痕和肌内途径比皮下接种疫苗产生显著较高的量(图21)。
实例11:接种HSV-lAgE疫苗可对抗多种异源HSV-1菌株的侧腹攻击
衡量接种HSV-lAgE疫苗对抗异源较高毒力野生型HSV-l菌株(F和n)的能 力；疫苗接种和攻击如实例7中所述实施，只是使用不同菌株进行攻击。接种HSV-1 AgE疫苗可完全保护小鼠免于HSV-1(NS)、HSV-1(F)和HSV-1(17)表皮攻击后死亡(图 22，上图)。接种疫苗也会减少接种位点疾病，尽管HSV-1(F)攻击会在接种位点造 成比HSV-1(NS)或HSV-1(17)攻击略微较多的疾病(图22，中图)。而且，接禾中HSV-1 AgE疫苗可完全保护所有受HSV-1(NS)和HSV-1(17)攻击的小鼠和2/3的受HSV-1(F) 攻击的小鼠免于带状疱疹样疾病；受HSV-1(F)攻击的其它小鼠具有两处小带状疱疹 样损伤(图22，下图)。因此，接种HSV-lAgE疫苗可保护小鼠对抗多种异源HSV-l 菌株。
实例12:接种HSV-lAgE疫苗可对抗剂量髙达 1 X 107 PFU HSV-1(NS)的侧腹攻击
衡量接种HSV-lAgE疫苗对抗较高剂量野生型HSV-1的能力，如实例7中所述 实施疫苗接种和攻击，只是使用105、 106或107 pfu HSV-1(NS)较高剂量进行攻击。 接种疫苗的小鼠全部完全经保护免于死亡和带状疱疹样疾病(图23，上图和下图)。 接种疫苗且用105 pfu HSV-1(NS)攻击的小鼠展示的接种位点疾病比模拟攻击小鼠略微严重，表明大多数疾病是由划痕(针刮痕)造成。接种HSV-lAgE疫苗且用106或 107 pfu攻击的小鼠的接种位点处疾病显著减少，与模拟接种疫苗小鼠相比其快速痊愈
(中图)。
实例13: HSV-2 (￡^^不引起疾病 材料和实验方法
潘微虜奉
在含有热灭活10%新生牛血清(生命技术公司(Life Technologies),盖瑟斯堡 (Gaithersburg)，马里兰州(Md.))加上50微克(mcg)青霉素/ml、 50 mcg/ml链霉素/ml、 禾口0.15 mcg/ml两性霉素B (Fungizone) (生命技术公司)的杜贝克氏改良鹰氏培养 基(Dulbecco's mod迅ed Eagle's medium)中于37。C和5% C02下培养非洲绿猴肾细胞 (ATCC CCL81)。自受感染非洲绿猴肾细胞单层制备HSV-2菌株的澄清原液并存储于 -8(TC下直至使用。通过标准噬斑分析来测定病毒滴度。
如下引入编码HSV-2 gE的1635 bp HSV-2 (2.12) Us8基因的碱基对(bp) 369-1479 缺失。将来自HSV-2(2.12)的两种PCR片段，即对应于具有拟定缺失的5'区域的658 bp 片段和具有拟定缺失的536 bp片段3'亚克隆到pBluescript SK+多克隆位点(MCS)中。 将5'侧翼区域亚克隆到pBluescript SK+ MCS的Kpnl和HindIII位点中，并将3'侧翼 区域亚克隆到MCS的Pstl和Sacl位点中。此留下介于5'与3'侧翼区域之间的一段较 短MCS序歹U,包括EcoRI和EcoRV限制位点并造成移码，由此仅表达gE的最初123 个氨基酸(图24B)。将载体与HSV-2(2.12)基因组DNA共转染到非洲绿猴肾细胞中 以实施同源重组。通过PCR来筛选自所得噬斑纯化的病毒粒子DNA以检测缺失纳入。 證-2麟鮮離微,
在病毒接种前7天和1天用2.0 mg得普乐(Depo-Provera)(普强(Upjohn)，卡拉 马祖市(Kalamazoo)，密执安州(MI))经皮下在颈背中对小鼠进行处理以使其动情周期 同步并增强其对于HSV-2阴道感染的易感染性。用藻酸钙拭子(飞世尔科学(Fisher Scientific),匹兹堡(Pittsburgh)，宾夕法尼亚州(Pa.))进行湿润和随后干燥阴道擦拭， 然后将HSV-2病毒(104 pfu)滴注入阴道腔中。在接种后(p丄)14天期间每天评价动物的 症状性疾病(由阴道附近脱毛和红斑来指示)。在接种后21天期间观察存活。作为 感染的另一指标，收集阴道擦拭物并在非洲绿猴肾细胞上检验病毒含量。
MM
使用与HSV-1 (实例l)所用类似的策略自菌株HG52构建gE无效HSV-2病毒。 HSV-1 (NS) gE(实例1-5)与HSV-2 (HG52) gE序列72%—致且79%类似(阳性)(图 24A)。另夕卜，也构建HSV-2 (拯救gE无效) 菌株。
为测试HSV-2(gE无效)菌株是否会引起疾病，将10"pfu (在wt病毒情形下致死) wt HSV-2和HSV-2 (gE无效)菌株投与到单独小鼠群组中。预期接受wt和HSV-2 (拯救^无 效)病毒的小鼠会死亡，同时预期接受HSV-2(gE无效)菌株的小鼠会存活，且预期不会展 示明显疾病体征。
49实例14:接种HSV-2 (&壬紀疫苗可防止野生型HSV-2感染
材料和实验方法
如先前实例中所述给小鼠接种HSV-2 (gE琉)疫苗或模拟接种疫苗，并在28天后 用致死剂量的WT HSV-2进行攻击。预期接种HSV-2 (gE，)疫苗的小鼠在攻击后不会 死亡，而预期模拟接种疫苗的小鼠会死于此感染。另外，预期接种HSV-2 (ge魏,疫苗 会大大减少或消除wt HSV-2攻击后的原发性(接种位点)疾病。与模拟接种疫苗小 鼠中阴道附近预期出现脱毛和红斑不同，在接种疫苗小鼠中预期不会观察到带状疱疹 样疾病。在攻击后数天在接种疫苗小鼠中预期相同皮肤样品的免疫组织化学展示大大 降低的抗原含量，此可证实上述观察。预期组织学分析会揭示，接种疫苗的小鼠展示 免疫细胞明显浸润。
在另外实验中，在小鼠侧腹模型中对HSV-2 (gE魏)疫苗进行测试(实例4-5), 且预期可防止HSV-2感染。
实例15:接种HSV-2 (&fw疫苗对抗天竺鼠模型中 现存HSV-2生殖器感染的功效
材料和实验方法
主遭器棘游天，微
在接种当天，用预湿润的藻酸钙拭子使阴道封闭膜破裂。用干燥藻酸钙拭子擦拭 阴道穹窿，并用注射器和20号计量塑料导管将10" pfu HSV-2滴注到阴道穹窿中。 此剂量是亚致死量的，同时使几乎每只接种动物都感染。在急性生殖器感染期间，在 p.U4天期间每天评价动物的生殖器皮肤疾病和尿潴留。通过自0 (无疾病)到4 (严 重疾病，特征在于大溃疡和衰弱)不等的皮肤损伤评分系统来定量疾病。在急性疾病 后，基于疾病严重程度来分配动物以产生统计学类似的群组。自p.i.21-56每天对每只 动物进行评分以确定外部复发疱疹性损伤的频率。 豫泰微層
即使不存在疾病体征，天竺鼠仍本能地自阴道腔排出HSV-2。可在10-20%的来 自潜伏感染天竺鼠的阴道擦拭物中检测到病毒DNA，此容许研究病毒排出频率并比 较数量。在p.i.22-43天每天用顶端覆盖有藻酸钙的拭子擦拭阴道腔。使用QIAmp DNA提取系统(凯俊(Qiagen)公司，查茨沃思(Chatsworth)， CA)自每一擦拭物样品 提取DNA，包括模拟擦拭物空白作为样品污染的检测物质，并使用靶向DNA聚合酶 基因的引物经PCR来定量HSV-2DNA。使用扩增单拷贝天竺鼠白蛋白基因的第二组 引物对于每一样本实施单独反应以确定模板的质量和量。使用所得498 bp扩增引物 来规范化DNA浓度并更定量性地估计每一样本中的HSV-2负荷。比较阳性样本与使 用MS HSV-2原液扩增的既定基因组等效物的一系列IO倍系列稀释物。在基因扩增 (GeneAmp) PCR系统9600(珀金埃尔默(Perkin-Elmer)公司，诺沃克(Norwalk)， Conn.) 中进行反应，先在95'C下进行2min"热启动"；随后在95'C下进行35个变性周期，1 min，在65'C下复性1 min，和72。C下延伸1 min 30 s;和最后在72。C下延伸7 min。 通过DNA印迹来检测每一样品的扩增产物、阳性和阴性对照、和已知标准物系列。 HSV-2负荷是自线性关系推断得出，所述线性关系是自与样品平行扩增的已知基因组 等效物的系列稀释物的带密度确立。 #定服-2應在效廣萝餅经穸柳潜微。
解剖骶骨背根神经节(每只动物6-8节)并称重，通过使用QIAamp⑧DNA微型 试剂盒(凯俊(QIAGEN))来提取病毒DNA，并实施实时PCR。使用含有HSV-2gD 基因序列的纯化质粒来构建每个实验的标准曲线。将数据以对于天竺鼠乳清蛋白 DNA具有特异性的探针为基准进行规范化。
MM
使用天竺鼠模型来评价iss对抗复发疱疹性疾病的功效。此模型提供与人类
HSV-2感染中所见类似的天然存在复发疾病，且受潜伏感染的天竺鼠以类似于人类中 所观察到的频率经阴道排出病毒。
给天竺鼠接种HSV-2 (gE无效)疫苗或模拟接种疫苗并在28天后用105'7 pfu HSV-2 进行攻击。预期与模拟接种疫苗的动物相比接种HSV-2 (gE无效)疫苗会显著降低生殖器 损伤发生的频率并减少经历任何复发的动物的数量。另外，预期接种HSV-2(gE诚)疫 苗会显著降低病毒排出量。
为测试接种HSV-2 (gE无效)疫苗对潜伏HSV-2感染建立的影响，对wt HSV-2病毒 基因组在天竺鼠DRG中的聚集进行评价。预期接种HSV-2(gE无效液苗会显著降低DRG 中病毒基因组的数量。
预期此实例和先前实例将提供HSV-2 (gE无效)疫苗可有效保护个体以防HSV-2感 染和随后生殖器复活的额外证据。
实例16:向US区域中引入额外缺失以进一步削弱 △gE-2疫苗菌株的顺行性扩散
为进一步衰减AgE-2疫苗菌株的毒力，使用与构建HSV-2 Us8缺失所用类似的 方法向编码gl和Us9蛋白质的Us7和Us9中引入额外缺失(图25)。构建含有两个 500-1000碱基对侧翼区域的克隆用载体，每一侧翼区域与具有拟定缺失的DNA序列 5'或3'同源。这两个区域的DNA是通过对HSV-2(2.12)基因组DNA实施PCR来获得。 将克隆用载体与HSV-2基因组DNA共转染，由此通过同源重组将缺失纳入到病毒 DNA中。通过PCR针对正确的Us缺失来筛选所得噬斑。
实例17:识别削弱AgE-2疫苗菌株的顺行性扩散的额外突变
使用RNA干扰(RNAi)基因沉默方法来识别与病毒扩散有关的除gE、 Us7和Us9 之外的基因。RNAi技术使用约20-22个碱基对双链RNA片段，其序列与靶向沉默的 病毒基因相同。为耙向HSV-l或HSV-2病毒基因上的序列，使用业内已知的标准技 术来合成序列与病毒RNA相同的小RNA双链片段，并通过转染技术引入到细胞中， 随后用HSV-1或HSV-2野生型或突变体病毒感染。缺陷病毒的扩散是通过筛选人类
51表皮角质形成细胞(HaCaT)中的小噬斑来检测(柯林斯(Collins WJ)等人，在上皮细胞 中表达的单纯疱疹病毒gE/gl干扰细胞到细胞的扩散(Herpes simplex virus gE/gl expressed in epithelial cells interferes with cell-to-cell spread.), 病毒学期干U(J Virol.)， 2003年2月；77(4):2686-95)。在基因缺失研究中使用诱导小噬斑的RNAi片段靶向 的基因。随后将失活突变引入到通过上文RNAi筛选方法识别的一或多种基因中以产 生突变体病毒。突变体病毒的扩散特性是使用大鼠颈上神经节细胞神经元培养物(王 (WangF)、唐(TangW)、麦格罗(McGraw HM)、班尼特(Bennett J)、安奎斯特(Enquist LW)、和弗里德曼(Friedman HM)，病毒学期刊79:13362-72， 2005)和小鼠视网膜眼 感染模型(王(WangF)、唐(TangW)、麦格罗(McGraw HM)、班尼特(Bennett J)、安 奎斯特(Enquist LW)、弗里德曼(Friedman HM)，病毒学期刊79:13362-72， 2005)在 活体外进行评价。将识别的活体外或活体内扩散改变的病毒突变体菌株引入到含有 gE、 Us7或Us9缺失的菌株中以产生含有多种基因缺失的菌株以确定最佳突变组合， 所述最佳突变组合接种到实验室动物中时引起很少或不引起疾病、在DRG中产生低 含量病毒DNA或不产生病毒DNA、并在通过感染野生型HSV-1或HSV-2进行攻击 时提供对抗疾病和病毒潜伏建立的最大保护。
在其它实验中，人们的努力集中在病毒粒子膜蛋白质上，例如糖蛋白J、 G、 K、 和M。病毒入侵所需要的诸如糖蛋白B、 D、 H和L等膜糖蛋白被排出在外。如先前 段落中所述对这些病毒粒子膜蛋白质进行分析。
实例18: HSVgD突变体的特征和稳定性 禱淑实避方兹f諸格23j
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使用野生型HSV-1菌株KOS来制备gD突变体。为构建HSV-1 (gD无效)，通过向 质粒pRM416中插入A3C (丙氨酸到半胱氨酸)和Y38C (酪氨酸到半胱氨酸)突变 来构建质粒pSC594，所述质粒pRM416含有KOS gD开放读码框，其侧翼为开放读 码框的474个碱基对5'和985个碱基对3'。将HSV-1 gD-无效DNA和pSC594 DNA 共转染到VD60细胞中。通过在非洲绿猴肾细胞中复制来筛选重组病毒并随后进行噬 斑纯化。在每次噬斑纯化后，通过在gD基因的5'端(包括突变位点)实施PCR来扩 增600个碱基对。通过限制酶图谱法来筛选扩增的gD片段。引入新Sspl位点证实存 在A3C突变且无Rsal位点证实存在Y38C突变。在进一步噬斑纯化后，实施DNA 测序以证实存在突变。无性系在非洲绿猴肾细胞上生长到高滴度，在10%到60%蔗糖 梯度上纯化，并最后实施DNA序列分析和限制性内切酶图谱法，其揭示仅剩余A3C 突变。在蔗糖梯度上进一步纯化KOS-gDA3C并对全部gD基因进行测序以证实存在 A3C突变和不存在额外非拟定突变。
拯救的KOS-gDA3C病毒(称为rKOS-gDA3C)是通过用KOS-gDA3C和pRM416 DNA共转染非洲绿猴肾细胞来产生。
病毒原液是在补充有10呢胎牛血清(FCS)的杜贝克氏最低必需培养基(Dulbecco'sminimum essential medium) (DMEM)中生长。B78-H1细胞是不允许HSV-1入侵的小 鼠黑色素瘤细胞，使其在含有5% FCS的DMEM中生长。B78-H1-A10细胞(AIO)和 B78-H1-C10细胞(C10)分别稳定表达HVEM和连接蛋白-1，并使其在含有5% FCS和 500昭/ml G418的DMEM中生长。在用gD DNA稳定转染的非洲绿猴肾细胞(VD60 细胞)中繁殖gD无效病毒。使用HSV-1菌株NS (低传代临床分离物)来进行小鼠 攻击研究。除非另外说明，病毒均在非洲绿猴肾细胞中生长，在蔗糖梯度上纯化并存 储于-8(TC下。 荷微滅染方案
所有实验方案均经宾夕法尼亚州大学动物和实验室资源IACUC委员会批准。使 五至六周龄的Balb/c小鼠(査尔斯河(Charies River))适应恒定温度和光周期(12小 时光照，12小时黑暗)的生物安全2级动物设施达1周。给小鼠剃毛并用脱毛乳膏 (奈尔(Nair)TM)沿右侧腹(用于接种疫苗)或左侧腹(用于攻击)进行脱毛，随后 用温水洗涤。第二天，经由腹膜腔内注射75 mcL存于PBS中的14.3 mg/ml氯胺酮和 1.8 mg/ml甲苯噻嗪使小鼠麻醉，随后通过在1 cr^侧腹面积(距脊柱1 cm的背侧) 中用30号计量注射针表面刮痕60次借助10 mcL含有5x 105 pfu HSV的微滴进行感 染。自接种后第3天开始以24小时间隔观察小鼠以记录皮肤损伤和疾病的外观和严 重程度。接种位点处的评分自0到5不等且带状疱疹样位点处的评分自0到10不等。 每个囊泡指定一个点或若损伤汇合，则基于汇合损伤的大小指定多个点。
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将K0S-gDA3C、 rKOS-gDA3C或KOS (400 pfu)与B78-Hl、 A10、 C10或非洲 绿猴肾细胞在4。C下培育一小时。使细胞升温到37。C,保持0、 10、 30、 60或120分 钟，随后洗涤移除未结合的病毒并经受柠檬酸盐缓冲液pH 3.0洗涤1分钟以使已结合 但未入侵细胞的病毒失活。额外洗涤后，给细胞覆盖上存于DMEM中的0.6免低熔点 琼脂，并使噬斑显影并于68小时后计数。 卓步麥教多,麥主长箱遂
实施MOI为3下与KOS、KOS-gDA3C或rKOS-gDA3C病毒一起培育的B78-H1 、 A10和C10细胞的单步骤生长曲线。在于37。C下一小时后，将细胞用柠檬酸盐缓冲 液pH 3.0处理一分钟，并立即(0时间)或在2、 4、 8、 10、 12、 20和24小时收集 细胞和上清液。将样品冷冻-解冻一次，超声处理三次(每次持续10秒)，并在非洲 绿猴肾细胞上进行滴定。以类似方式实施多步骤生长曲线，只是感染是在MOI为0.01 下实施且滴度是在24、 48和72小时测定。 萝餅经卿/ G)顿奉DiVA麟好定蘆尸C7f
收获最接近接种位点的DRG并使用凯俊扩增微型(Qia Amp-mini) DNA试剂盒 (凯俊(Qiagen))来分离DNA。扩增Us9基因以定量DRG中的病毒基因组拷贝数。 在50 mcl体积中用最少200 ng来自DRG的DNA实施PCR反应。添加50 pmol正向 引物5'cgacgccttaataccgactgtt (SEQ ID NO: 8)和反向引物5'acagcgcgatccgacatgtc (SEQID NO: 9)和15 pmol塔曼(Taqman)探针5'tcgttggccgcctcgtcttcgct (SEQ ID NO: 10)。每 50 mcl反应物添加一单位扩增塔曼金(Ampli Taq Gold)(应用生物科学(Applied Bioscience))。在ABI Prism7700序列检测器(应用生物系统(Applied Biosystems)) 上实施实时PCR扩增。自经纯化HSV-1 (NS) DNA产生标准曲线。小鼠脂肪细胞蛋 白酶(细胞持家基因)也在相同条件下自DRG DNA扩增。用于扩增的引物是正向 5'gatgcagtcgaaggtgtggtta (SEQ ID NO: ll)和反向5' cggtaggatgacactcgggtat (SEQ ID NO: 12)，同时使用塔曼(T叫man)探针5'tctcgcgtctgtggcaatggc (SEQ ID NO: 13)进行检测。 随后基于鼠科动物脂肪细胞蛋白酶拷贝数将病毒DNA拷贝规范化。
结果
由于gD转录物与gl和gJ同3'末端，因此gD和gl的分子量是通过对感染WT、 rKOS-gDA3C、或KOS-gDA3C病毒的细胞实施蛋白质印迹法来定值。对于所述三种 病毒，蛋白质大小类似(图26A)，同时DNA测序证实KOS-gDA3C中的gJ基因完 整(结果未显示)。通过使用经PCR扩增的DNA片段的SspI进行限制酶切消化证 实位置3上存在半胱氨酸残基来证实gDA3C突变的稳定性。所述Sspl位点经30次 传代仍存在，表明残基3上丙氨酸到半胱氨酸的改变是稳定的(图26B)。此通过每 5次传代后实施DNA序列分析得以证实。
在侧腹上给小鼠刮痕接种KOS-gDA3C,并在感染后5天收获DRG以证实gDA3C 突变在活体内的稳定性。自三个单独噬斑分离病毒。所有三种分离物均保留Sspl位点 (图26C)，表明氨基酸3上的半胱氨酸残基存在，此通过DNA测序得以证实。 实例19: HSV gD突变体作为入侵受损的活病毒疫苗 对KOS、 rKOS-gDA3C、和KOS-gDA3C至表达HVEM (A10)、连接蛋白-1 (C10)、 二者(非洲绿猴肾细胞)、或两受体均不表达(B78-H1)的细胞的入侵进行评价。三种 病毒至非洲绿猴肾细胞的入侵相当(图27A)，然而各病毒均不能入侵B78-H1细胞 (图27B)。与KOS或rKOS-gDA3C相比，KOS-gDA3C至A10细胞的入侵被减少 约50% (图27C)，且至C10细胞的入侵被减少约70% (图27D)。
这些发现显示，gDA3C突变可减少由HVEM和连接蛋白-l受体二者调介的入侵。
实例20: HSVgD突变体病毒的生长曲线 通过实施MOI为3时的单步骤生长曲线来检查病毒复制。KOS、 rKOS-gDA3C 和KOS-gDA3C不能感染B78-Hl细胞(结果未显示)。三种病毒的复制在A10细胞 (图28A)和C10细胞(图28B)中相当，只是KOS-gDA3C的滴度在0时间(在一 小时吸附期结束时)降低，此反映实例19中所见的入侵缺陷。
通过在MOI为0.01下感染细胞以容许多周期病毒复制来实施多步骤生长曲线。 与KOS和rKOS-gDA3C相比，KOS-gDA3C的峰值滴度在72小时于A10细胞中降低 约1.51og10 (图28C)且在C10细胞中降低约21og10 (图28D)。
实例21: HSVgD突变体毒力降低 KOS-gDA3C突变体的毒力是在小鼠侧腹模型中予以评价。用5xl05 PFU KOS、
54rKOS-gDA3C、或KOS-gDA3C将小鼠感染并对接种位点和带状疱疹样位点处的疾病 进行评分。感染KOS-gDA3C的小鼠接种位点处的疾病较为不严重(图29A)且几乎 无带状疱疹样疾病，在第5天30只小鼠中仅一只小鼠发生3处损伤(图29B)。显 示第10天带状疱疹样位点疾病的照片(图29C)。
这些发现显示，用gD突变体疱疹病毒感染引起最少疾病。
实例22: HSV gD突变体到达DRG的能力降低
用5xl05 PFU KOS、 rKOS-gDA3C、或KOS-gDA3C接种小鼠且在感染后5天， 收获DRG以测量病毒滴度(图30A)和病毒基因组拷贝数(图30B)，与KOS或 rKOS-gDA3C相比KOS-gDA3C降低。
这些发现显示，gD突变体疱疹病毒不能到达DRG。
实例23: HSV gD突变体作为减毒活病毒疫苗
将小鼠模拟感染或用rKOS-gDA3C或KOS-gDA3C感染并使其恢复。尽管 rKOS-gDA3C弓l起大面积疾病，但所有动物都存活，此与所有小鼠感染KOS的情形 相同。30天后，在相对侧腹上用HSV-1菌株NS以106PFU (约20LD50)攻击先前 感染KOS-gDA3C或rKOS-gDA3C的小鼠。攻击病毒在模拟群组中在接种位点(图 31A)和带状疱疹样位点(图31B)引起大面积疾病。KOS-gDA3C和rKOS-gDA3C 对抗接种位点处的疾病且两种病毒全部可防止带状疱疹样疾病。感染rKOS-gDA3C 或KOS-gDA3C的小鼠在NS菌株攻击后没有一只死亡，而模拟感染的小鼠100%死 亡(结果未显示)。
这些发现显示，KOS-gDA3C可提供与更具毒力rKOS-gDA3C所提供保护相当的 对抗攻击的保护。
对先前感染KOS-gDA3C阻止WT病毒到达DRG的能力进行评价。将小鼠模拟 感染或在侧腹中用5xl05 pfu rKOS-gDA3C或KOS-gDA3C进行感染。30天后，在相 对侧腹上用1(fpfuNS对小鼠进行攻击。攻击后5天，收获分布神经于攻击位点中的 DRG。先前模拟感染的小鼠的DRG中NS病毒滴度为约6 loglO,而自先前感染 rKOS-gDA3C或KOS-gDA3C的小鼠的DRG中未回收到病毒(图31C)。
在攻击后5天，对DRG实施定量PCR。在先前模拟感染小鼠的DRG中检测到 约5.8 loglO HSV-1基因组拷贝，相比之下，在先前感染rKOS-gDA3C或KOS-gDA3C 的小鼠中分别为3.4或3.21oglODNA拷贝(图31D)。
这些发现显示，KOS-gDA3C在接种位点和带状疱疹样位点处引起皮肤损伤和感 染DRG的毒力减弱，然而其仍然可与rKOS-gDA3C同样有效地保护小鼠对抗WT HSV-1攻击。
这些实例表明，gD中具有突变的HSV菌株可用作减毒活HSV疫苗。图32显示 在病毒生命周期的每一步骤由于病毒入侵具有缺陷导致产生较少KOS-gDA3C的模 型。这些步骤包括在表皮细胞(标记为E) 、 DRG核(标记为N)中产生、和返回到 皮肤带状疱疹样位点的病毒的量。
55在一个实施例中，本发明实例为接种疫苗对抗HSV感染的方法提供实验支持， 所述方法通过使个体与含有一或多种失活突变的HSV突变体菌株接触来实施。
权利要求
1、一种突变体HSV-1菌株，其在Us8基因中包含第一失活突变且在Us7基因、Us9基因或其组合中包含第二失活突变。
2、 如权利要求1所述的HSV-1菌株，其中所述第一或第二失活突变是添加、缺 失或置换突变。
3、 一种突变体HSV-2菌株，其在Us8基因中包含第一失活突变且在一或多种额 外基因中包含第二失活突变。
4、 如权利要求3所述的HSV-2菌株，其中所述第二失活突变是在编码病毒入侵 不需要的膜蛋白质的基因中。
5、 如权利要求4所述的HSV-2菌株，其中所述编码病毒入侵不需要的膜蛋白质 的基因是Us7基因、Us9基因或其组合。
6、 如权利要求4所述的HSV-2菌株，其中所述编码病毒入侵不需要的膜蛋白质 的基因是Us5、 Us4、 UL53、 UL10或其组合。
7、 如权利要求3所述的HSV-2菌株，其中所述第二失活突变是在编码病毒入侵所需要的膜蛋白质的基因中。
8、 如权利要求7所述的HSV-2菌株，其中所述编码病毒入侵所需要的膜蛋白质 的基因是Us6。
9、 如权利要求3所述的HSV-2菌株，其中所述第一或第二失活突变是添加、缺 失或置换突变。
10、 一种在个体中治疗单纯疱疹病毒(HSV)感染、减少其发病、改善其症状、改 善其继发性症状、降低其发生率、延长至其复发的潜伏期的方法，所述方法包含使所 述个体与包含突变体单纯疱疹病毒疫苗菌株的组合物接触的步骤，其中所述突变体 HSV疫苗菌株在Us8基因中包含失活突变。
11、 如权利要求10所述的方法，其中所述突变体HSV疫苗菌株是HSV-1菌株 或HSV-2菌株。
12、 如权利要求10所述的方法，其中所述HSV感染是HSV-1感染或HSV-2感染。
13、 如权利要求IO所述的方法，其中所述突变体菌株的神经元病毒扩散被阻止。
14、 如权利要求10所述的方法，其中所述突变体菌株在所述个体的皮肤组织中 具有复制能力。
15、 如权利要求IO所述的方法，其中所述突变体HSV疫苗菌株在编码病毒入侵 不需要的膜蛋白质的基因中进一步包含额外失活突变。
16、 如权利要求15所述的方法，其中所述编码病毒入侵不需要的膜蛋白质的基 因是Us7基因、Us9基因或其组合。
17、 如权利要求15所述的方法，其中所述编码病毒入侵不需要的膜蛋白质的基 因是Us5、 Us4、 UL53、 UL10或其组合。
18、 如权利要求IO所述的方法，其中所述突变体HSV疫苗菌株在编码病毒入侵 所需要的膜蛋白质的基因中进一步包含失活突变。
19、 如权利要求18所述的方法，其中所述编码病毒入侵所需要的膜蛋白质的基 因是Us6。
20、 如权利要求IO所述的方法，其中所述HSV感染是生殖器HSV感染、HSV 脑炎、眼睛疾病、唇部HSV感染或其组合。
21、 如权利要求10所述的方法，其中所述个体已感染HSV或具有感染HSV的 风险。
22、 如权利要求21所述的方法，其中所述个体是新生儿、免疫受损个体、老年 个体或其组合。
23、 如权利要求10所述的方法，其中所述治疗单纯疱疹病毒(HSV)感染、减少 其发病、改善其症状、改善其继发性症状、降低其发生率、延长至其复发的潜伏期是 通过在所述个体中诱导抗HSV免疫应答来实施。
24、 如权利要求23所述的方法，其中所述抗HSV免疫应答是抗HSV中和抗体应答。
25、 如权利要求IO所述的方法，其中所述接触步骤包含表皮、肌内、皮下或呼 吸系统内粘膜注射。
全文摘要
本发明提供向个体接种疫苗以对抗单纯疱疹病毒(HSV)感染和与其有关的病症和症状、和在个体中阻止下列病状、抑制下列病状、降低下列病状的发生率和阻抑下列病状的方法HSV感染、神经元病毒扩散、带状疱疹样损伤形成、疱疹性眼睛疾病、疱疹介导的脑炎和生殖器溃疡疾病，所述方法包含使所述个体与HSV突变体菌株接触的步骤，所述HSV突变体菌株在编码gE、g1、Us9或其它蛋白质的基因中含有失活突变。
文档编号A61K48/00GK101583381SQ200780038798
公开日2009年11月18日 申请日期2007年9月7日 优先权日2006年9月8日
发明者伊丽莎白·E·布里特勒, 哈维·弗里德曼 申请人:宾夕法尼亚大学董事会