运载新城疫病毒的禽疫苗的制作方法

专利名称：运载新城疫病毒的禽疫苗的制作方法
运载新城疫病毒的禽疫苗援引加入本申请要求2009年4月3日提交的US临时申请系列No. 61/166，481的权利。技术领域：
本发明包括运载NDV的禽疫苗或组合物，尤其是禽流感疫苗。疫苗可为经加工的
禽疫苗。
背景技术：
近年的几项研究点燃了新城疫病毒(NDV)用作禽疾病的疫苗载体的潜力 (Krishnamurthy et al.，Virology 278，168—182，2000 ；Huang et al.，J.Gen. Virol. 82, 1729-1736,2001 ；Nakaya et al. , J. Virol. 75,11868-11873,2001 ；Park et al. PNAS 103,8203-8208,2006 ；Veits et al PNAS 103，8197-8202，2006 ;Ge et al. J. Virol. 81, 150-158,2007 ;Romer-Oberdorfer et al. Vaccine 26，2307—2313，2008)。NDV属于副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)和禽副粘病毒属(Avulavirus)。NDV 在呼吸和消化道中，在输卵管中，及对于一些分离物，在神经系统中复制。传播是产气的，且通过口及粪便途径。NDV导致高度接触传染及致死的疾病，其影响全部物种的鸟，及可感染一些哺乳动物种。疾病可从临床不明显变化到高度强毒形式，依赖于病毒株和宿主物种。 由NDV株显示的毒力的连续谱致使将它们分为3种不同致病型组缓发型，中发型及速发型(Alexander, D. J.，Diseases of Poultry, Iowa State Uni· Press，Ames IA，541-569， 1997)。缓发型株通常不在成年鸡中导致疾病，且在美国和其他国家在家禽工业中作为活疫苗广泛使用。中间毒力的病毒称之为中发型，而导致高死亡率的病毒称之为速发型。疾病具有世界性分布，且对商业家禽生产保持恒定的主要威胁。NDV基因组是约151Λ的RNA的非-分段的阴性链。基因组RNA含有编码依序以下蛋白的6个基因核壳蛋白(NP)，磷蛋白(P)，基质蛋白(M)，融合蛋白(F)，血细胞凝集素-神经酰胺酶(HN)和大聚合酶蛋白(L)。P基因转录期间通过RNA编辑产生未知的功能的 2 种额外的蛋白，V 和 W(Steward et al.，1993，Journal of General Virology 74: 2539-2547)。近年建立了自克隆的cDNA完全恢复非-分段的阴性RNA病毒的方法的开发，开启了遗传操作此病毒组，包括 NDV 的可能性(Conzelmann，K. K. ,Ann. Rev. Genet. 32，123-162， 1998 ；Roberts and Rose, Virology 247，1-6，1998)。此独特分子遗传方法，称之为“反向遗传学”，提供不仅研究各种病毒-编码的基因的功能的手段(Palese et al. , PNAS 93， 11354-11358,1996 ；Nagai, Y.，Rev. Med. Virol. 9，83-99，1999)，而且允许使用这些病毒来表达异源基因(Bukreyev et al.，J. Virol. 70，6634-6641，1996 ；Mebatsion et al.，PNAS 93,7310-7314,1996 ；Schnell et al. ,PNAS 93,11359-11365,1996 ；Hasan et al. , J. Gen. Virol. 78,2813-2820,1997 ；He et al. ,Virology 237,249-260,1997 ；Sakai et al. ,FEBS Lett. 45，221-226，1999)。此提供产生改善的疫苗和疫苗载体的新方法。
2个独立小组在1999年同时报道了基于NDV的缓发型疫苗株(LaSota)自克隆的 cDNA 恢复系统(Peeters et al.，1999 ；Romer-Oberdorfer et al.，1999)。在第 1 报道的系统中，将自LaSota株(ATCC-VR699)的全长NDV cDNA组装进含有T7DNA-依赖性-RNA聚合酶启动子的P0LTV5转录载体。将NDV转录酶复合物的个体克隆(NP，P和L)在真核表达载体中克隆。共转染流程在感染的单层细胞中产生了几个感染中心(Peeters et al., J. Virol. 73，5001-5009，1999)。第2系统报道了自克隆的cDNA的缓发型NDV的恢复，基本上使用组装全长反基因链表达质粒及支持质粒的相同的策略(Romer-Oberdorfer et al.， Journal of General Virology, 80, 2987-2995,1999) 最近开发其他系统来恢复 NDV 的缓发型HitchnerBl (Nakaya等人，2001)或LaSota株(Huang等人，2001)。可对于重组体中发型NDV的恢复有用的系统仅被Krishnamurthy等人描述Q000)。此系统利用痘苗病毒重组(MVA)和用于转染的HEP-2细胞。使用中发型株Beaudette C的全长克隆和自相同的株的支持质粒(N，P和L)用于转染。将编码CAT报告子基因的额外的转录单元放置在HN和 L基因之间。表达CAT基因的rNDV的生长延迟及病毒衰减。CAT报告子基因在细胞培养中稳定地表达几代。禽流感(AIV)，有时称之为禽流感(Avian flu)，且通常认识为鸟流感，指由适应于鸟的流感病毒导致的流感。AIV是分段的，单-链，负义RNA病毒，属于正粘病毒科 (Orthomyxoviridae)，及分类为A型流感病毒。A型病毒是动物和人流感的最频繁的病原。 此类型在主要基于2种表面脂质-包裹的膜蛋白，血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)分化的许多株或亚型中发生。HA，辅助病毒进入宿主细胞，及NA辅助后代病毒从感染的细胞释放 (de Jong et al. ,J Clin Virol.35(1) :2-13, 2006) A 型病毒流感基于它们的特定 HA 和 NA含量分为亚型。有16种不同HA亚型，及9种不同NA亚型。许多不同HA和NA蛋白的组合是可能的。流感A病毒亚型根据它们的HA和NA表面蛋白命名。例如，“H7N2病毒”指具有H7亚型的HA蛋白和自N2亚型的NA蛋白的流感A亚型。类似地，“H5m ”病毒具有H5 亚型的HA和自附亚型的NA。H5W亚型特别相关于新近在亚洲，俄罗斯，中东，欧洲和非洲的暴发(Olsen et al.，Science21 ；312 (5772) :384-8,2006) 流感A病毒可感染人，猪，马，海豹，鲸，家禽，猫，狗，雪貂及其他动物，但野生鸟是它们的天然的宿主。水生鸟构成主要流感携带者，由此病毒系进化及适应它们的宿主，例如，人，猪及马流感。宿主特异性不是绝对的，且物种间传播可发生，如通过高度病原性禽流感(HPAI)H5W亚型感染人，猫，狗和猪物种的能力例证。高度病原性流感A病毒亚型H5m病毒是全球关心的作为潜在流行病威胁的新出现的禽流感病毒。H5m已经在越来越多的贯穿亚洲，欧洲和非洲的国家杀了几百万家禽。 不像B型流感，A型流感经历抗原位移(至少2种不同株的病毒组合而形成新亚型)，且流行病学家，感染性疾病研究者，及其他健康专家急切关注，人流感病毒和禽流感病毒(尤其 H5N1)的共-存在可提供遗传物质在物种-特异性病毒之间交换的机会，可能创建容易传染禾口对人致死的新强毒、流感株(Food Safety Research Information Office. “ A Focus on Avian Influenza" . Created May 2006, Updated November 2007)。由于在1997年发生首次H5m暴发，已有越来越多的HPAI H5W鸟-至-人传播导致临床严重的和致死的人感染。但是，因为有鸟和人之间存在的显著物种屏障，病毒不容易跨到人。尽管自其被发现，几百万的鸟已被所述病毒感染，在印度尼西亚，老挝，越南，罗马尼亚，中国，土耳其和俄罗斯总共仅约200人死于禽流感。考虑到动物，包括人对AIV的的感受性，防止AIV感染及保护动物的手段是必要的。因此，有对抵抗流感的有效疫苗的需求。本申请中任何文献的引用或鉴定不是认可该文献可作为本发明的现有技术。发明概述本发明部分基于申请人的发现，由新城疫病毒(NDV)的向肠AVINEW 株表达的AIV 血凝素基因在禽中是高度免疫原性的。本发明涉及运载NDV的禽疫苗或组合物，其可包含有效量的具有固有肠向性的经加工的NDV载体，其包含及表达某些禽抗原，更特别禽流感抗原，及药学或兽医学可接受的载体，赋形剂或媒质。向肠NDV可为由Merial Limited商业化的AVINEW 修饰的活疫苗的 NDV 株。禽流感抗原可为血凝素。禽流感HA抗原可为自H5亚型的HA。本发明也涉及免疫接种禽的方法，包括给禽施用有效量的疫苗，其可包含有效量的重组NDV载体和药学或兽医学可接受的载体，赋形剂或媒质。施用可通过卵内，眼滴，喷雾，饮用水或肠胃外(皮下，肌内，经皮)施用。本发明涉及修饰Avinew NDV的基因组来产生经加工的Avinew NDV的方法，其中方法包括在Avinew NDV基因组的非必要区内将分离的多核苷酸导入Avinew NDV基因组。 非必要区可为编码非必要蛋白的开放阅读框或开放阅读框的非-必要的部分；或位于NP基因上游的非翻译(或非-编码)区，或2个基因(基因间区)之间，或自Avinew NDV基因组的L基因的下游。本发明还涉及使用初施-追施流程施用疫苗或组合物。本发明涉及在施用可包含有效量的经加工的NDV载体和药学或兽医学可接受的载体，赋形剂或媒质的本发明的疫苗之前，用禽流感疫苗初施禽。或者，本发明还涉及在施用禽流感疫苗之前，用本发明的疫苗 (表达至少一种禽流感抗原的经加工的NDV载体和药学或兽医学可接受的载体)初施。本发明还包括实施引发或诱导免疫应答的方法的试剂盒，其可包含任何一种重组流感免疫学组合物或疫苗，或灭活的免疫学组合物或疫苗，及用于实施方法的使用说明。因此，本发明的目的是不在本发明之内包括任何之前知道的产品，制造产品的方法，或使用产品的方法，以至于申请人保留权益及由此公开放弃任何之前知道的产品， 处理或方法。还应注意，本发明不旨在在本发明的范围之内包括不符合书面描述及启动 USPTO(35U. S. C. § 112，第1段落)或EPO(EPC的第83条)要求的任何产品，处理或产品的制造或使用产品的方法，以至于申请人保留权益及由此公开放弃任何之前描述的产品，制造产品的方法，或使用产品的方法。这些和其他实施方式被以下详述公开或显而易见和含盖。
以下详述，通过例的方式给出，但不旨在单独限制本发明到描述的特定实施方式， 可通过附图最好理解，其中图IA描绘全长NDV基因组的遗传图谱；图IB描绘显示有流感HA插入到2个代表性转基因插入位点到全长NDV基因组的2种经加工的NDV的遗传图谱的图谱；图IC是NDV反向遗传学系统的流程图的例；图ID描绘使用NDV反向遗传学恢复经加工的NDV感染性粒子的方式。图2描绘将AVINEW全基因组克隆到用于反向遗传学开发的转录质粒和允许容易转基因克隆的独特限制性位点(I^acI&Fsel)插入到P和M基因之间的示意图。图3描绘质粒pIV(^9的质粒图谱。图如 4ο提供质粒pIV0291的插入子序列。斜体字指非AVINEW 序列，及加下划线的斜体字指P和M基因之间的内部I^cl-Fsel插入，斜体字指HDV核酶(3’端)及加下划线的斜体字指Τ7启动子(5’端)和终止子(3’端)。在图谱中指出转录开始序列(GS =基因开始)和转录终止序列(GE =基因结束)，及给序列加了下划线。环绕的T (图如中的第3190位)指环绕的核苷酸(在I^acl-Fsel插入之前)这是组装的AVINEW 基因组进转录载体的T (SEQ ID NO 24的第3190位)(T来自用于创建PacI和FseI限制性位点的引物)。在共有AVINEW 基因组(SEQ ID NO=D中，在对应第3150位的核苷酸是C。图5描绘质粒pIV32的质粒图谱。图6描绘质粒pIV33的质粒图谱。图7描绘质粒pIV034的质粒图谱。图8描绘质粒pNS151的质粒图谱。图9描绘将AIV HA基因经NDV插入盒导入NDV基因组的示意方法。图10描绘质粒pIV039的质粒图谱。图IlA和IlB描绘由经加工的NDV vAVW02的HA表达。将不含有插入子的vAVWOl 用作阴性对照。通过病毒-接种的含胚的蛋的尿囊液中(图IlA中的左图)或自感染的CHO 细胞裂解物(图IlA的右图)的蛋白印迹或通过感染的CHO细胞中的免疫荧光(图11B) 使用对感染的CHO细胞的抗-H5阳性鸡血清检测HA表达。图12显示分配给DNA和蛋白序列的SEQ ID NO的表。图13描绘免疫接种的SPF层的不同组的一日龄鸡后代中的抗-NDV和抗-AI (针对H5m C12或H5N9LP抗原)母源的抗体(MDA)HI滴度。图14描绘评估SPF鸡中由经加工的NDV诱导的禽流感保护的疫苗接种/攻击时间线及流程。图15显示在日龄用vAVW01(v01或01 ；无插入的基因)或vAVW03 (v03或03 ；AI HA插入子)免疫接禾中的无MDA (SPF)或NDV MDA (21A)，或NDV和H5MDA或H5仅MDA (21B) 鸡的死亡率的动力学表。 图16描绘自用vAVWO 1或vAVW03免疫接种的无(SPF)或有MDA的鸡中的口(&C) 和泄殖腔(B&D)拭子的AIV脱落的比较。C和D中的结果表示为在不同时间点攻击之后， vAVWOl-免疫的鸡的HPAI H5N1攻击脱落和vAVW03_免疫的鸡的那些的平均水平之间的以 IoglO的比。图17描绘疫苗接种(D21)之后和攻击￠3 之后对vAVW03_诱导的AIV HI滴度 (使用 H5N9 (A)或 H5m 分化体 2. 2 (B)抗原)的 NDV MDA 效应(SPF 无 MDA ；NDV 抗-NDV MDA) 0书写在图上的编号对应于测试的阳性血清/总和的编号。在NDV MDA存在下，相比无NDV MDA的SPF鸡中的结果，AIV HI滴度在疫苗接种之后更高且在攻击之后不增加。图 18 描绘在无 MDA (SPF)，AI H5N9 禾口 NDV MDA (H5N9+NDV), NDV MDA(NDV)或 AIH5N1 (H5N1)MDA ；NDV MDA 的鸡中用 vAVWOl 或 vAVW03 疫苗接种后(在 D0)D21NDV HI 滴度对由vAVWOl或vAVW03诱导的NDV HI滴度水平不具有负面效应。图 19 描绘在 DO 和 D21 用 AVINEff(Gl)，vAVW02 (G2)和 vAVW03 (G3) 2 次疫苗接种后的NDV HI滴度。图20描绘在DO和D21用vAVW02 (G2)或vAVW03 (G3) 2次疫苗接种后的AI H5N1HI滴度。图21描绘在DO和D21用vAVW02 (G2)或vAVW03 (G3) 2次疫苗接种后的AI H5N1SN 滴度。图22A和22B分别描绘通过vAVW03的1次(在DO)或2次(在DO和D14)眼滴剂施用诱导的NDV HI滴度和AIV SN滴度。图23A 23D描绘自未疫苗接种的(组1)或免疫接种的(组2 在D0，1次施用 vAVW03 ；组 3 在 DO 禾Π D14 2 次施用 vAVW03 ；组 4 在 DO 用 vFP89 和在 D14 用 vAVW03 初施-追施)在第观天用HPAIH5m分离物攻击的俄国小鸭的口咽(A和C)和泄殖腔(B和 D)拭子中的病毒载量(A和B)及阳性样品的百分率(C和D)的动力学。图24A 24D描绘自未疫苗接种的(组1)或免疫接种的(组2 1次施用vAVW03 在DO ；组3 :2次施用vAVW03在DO和D14 ；组4 在DO用vFP89和在D14用vAVW03初施-追施)在第42天用HPAIH5m分离物攻击的俄国小鸭的口咽(A和C)和泄殖腔(B和D)拭子中的病毒载量(A和B)及阳性样品的百分率(C和D)的动力学。图25提供在氨基酸水平禽流感HA蛋白和序列同一性百分率之间的序列比对。图沈提供在核酸水平禽流感HA蛋白和序列同一性百分率之间的序列比对。发明详述需知，在此公开中和特别在权利要求和/或段落中，术语例如“包括 (comprises) ”，“包括(comprised) ”，“包括(comprising) ”等可具有美国专利法中规定的含义；例如，它们可表示“包括(includes)”，“包括(included) ”，“包括(including) ”，等； 及that术语例如“基本上由...组成(consisting essentially of) ”和“基本上由...组成(consists essentially of) ”具有美国专利法中规定的含义，例如，它们允许因素不明确地叙述，但排除见于现有技术或影响本发明的基本或新特征的因素。除非另外解释，本文所用的全部技术和科学术语与本公开所属领域普通技术人员通常理解的具有相同的含义。除非背景明显另外指示，单数术语“a”，“an”和“the”包括复数个指示物。类似地，词汇“或”旨在包括“及”，除非背景明显另外指示。在本发明中，将AVINEW疫苗株用作载体。AVINEff是世界上广泛使用的活NDV疫苗 (Merial Limited)。此疫苗株①天然地无毒力及呈现双呼吸和肠向性。此外，AVINEW株属于可感染鸭的NDV基因组(II类，基因型I)。相比LaSota (其向性基本上针对呼吸道)，其不诱导呼吸性副反应。本发明涉及可包含有效量的经加工的NDV载体和药学或兽医学可接受的载体，赋形剂或媒质的禽疫苗。本发明包括任何表达在动物，例如禽中引发免疫原性应答的蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原的经加工的NDV载体。蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原可为流感蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原，例如但不限于在动物，例如禽中引发，诱导或刺激应答的蛋白，多肽，肽或其片段。说道“动物”期望是哺乳动物，鸟，等。动物或宿主包括哺乳动物和人。动物可选自马(例如，马)，狗(例如、狗、狼、狐、山狗、豺)，猫(例如，狮、虎、家养猫、野生猫、其他大猫、及其他猫包括猎豹和山猫)，绵羊(例如，绵羊)，牛(例如，牛)，猪(例如，猪)，禽(例如，鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、雉鸡、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦、鸵鸟、鸸鹋和鹤鸵)，灵长类动物(例如， 狐猴、跗猴、猴、长臂猿、猿)和鱼。术语“动物”也包括在全部发育阶段，包括胚胎和胚胎阶段的个体动物。在一实施方式中，禽流感免疫学组合物或疫苗包含经加工的载体和药学或兽医学可接受的赋形剂，载体或媒质。经加工的载体可为可包含编码流感蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原的多核苷酸的NDV表达载体。流感蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原，可为血凝素，基质蛋白，神经氨酸酶，非结构性蛋白，核蛋白，聚合酶或其任何片段。在另一实施方式中，流感蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原可源于经流感或禽流感株感染的禽。禽流感蛋白，抗原，表位或免疫原可为血凝素(HA)例如但不限于HA前体，H1， H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15 或 H16 蛋白，基质蛋白(例如但不限于基质蛋白Ml或M2)，神经氨酸酶(例如但不限于NAl，NA2, NA3, NA4, NA5, NA6, NA7， NA8或NA9)，非结构性(NS)蛋白(例如但不限于NSl或NS2)，核蛋白(NP)和聚合酶(例如但不限于PA聚合酶，PBl聚合酶1或PB2聚合酶2)。禽流感抗原可为血凝素，例如H5HA。在一实施方式中，H5分离自H5WA/火鸡/ 土耳其/1/2005(分化体2.幻，A/鸡/印度尼西亚/7/2003(分化体2. 1)，A/鸭/老挝 /3295/2006 (分化体 2. 3)，A/ 鸡 / 西爪哇 /PWT-ffIJ/2006 (分化体 2. 1)株。在另一实施方式中，禽流感蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原可源于经源自任何亚型的新近分离物的流感或禽流感株感染的禽。本文使用的术语“抗原”或“免疫原”是指在宿主动物中诱导特定免疫应答的物质。抗原可包含杀死的，衰减的或活的全生物；生物的亚单位或部分；含有表达有免疫原性性质的表位，多肽，肽，蛋白或其片段的插入子的重组载体；呈递给宿主动物后能诱导免疫应答的核酸的碎片或片段；蛋白，多肽，肽，表位，半抗原，或其任何组合。或者，免疫原或抗原可包含毒素或抗毒素。本文使用的术语“免疫原性蛋白或肽”也包括免疫学活跃的肽和多肽，意为一旦施用到宿主，其能引发针对蛋白的体液和/或细胞类型的免疫应答。优选蛋白片段为其与总蛋白具有基本上相同的免疫学活性。由此，根据本发明的蛋白片段包含至少一个表位或抗原决定簇，或基本上由其组成或由其组成。术语表位，也称为抗原决定簇，是被免疫系统识别的及能诱导体液类型(B细胞)和/或细胞类型(T细胞)的免疫反应的大分子的部分。术语“免疫原性蛋白或肽”还涵盖序列的缺失，添加和置换，只要多肽如本文定义发挥产生免疫学应答的功能。在这点上，特别优选的置换会通常是性质上保守的，即，在氨基酸家族内发生的那些置换。例如，氨基酸通常分为的4个家族(1)酸性一天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性一赖氨酸，精氨酸，组氨酸；(3)非-极性一丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；及(4)不带电的极性一甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，胱氨酸，丝氨酸苏氨酸，酪氨酸。苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸有时分类为芳族氨基酸。 可合理预测，用异亮氨酸或缬氨酸单独取代亮氨酸，或反之；用谷氨酸单独取代天冬氨酸或反之；用丝氨酸单独取代苏氨酸或反之；或用结构上相关的氨基酸的氨基酸的类似保守性取代，不会对生物学活性具有主要效应。因此，与参照分子具有基本上相同的氨基酸序列但具有基本上不影响蛋白的免疫原性的少数氨基酸置换的蛋白在参照多肽的定义内。术语表位是被免疫系统识别的及能诱导体液类型(B细胞)和/或细胞类型(T细胞)的免疫反应的大分子的部分。该术语也与"抗原决定簇"或"抗原决定簇位点"互换使用。认识相同的表位的抗体可在显示一种抗体阻断另一抗体与靶抗原的结合的能力的简单免疫测定中鉴定。对组合物或疫苗的"免疫学应答"是在宿主中发展的对目标组合物或疫苗的细胞和/或抗体-介导的免疫应答。通常，“免疫学应答"包括但不限于一种或更多以下效应特别针对包括在目标组合物或疫苗中的抗原的抗体，B细胞，辅助性T细胞，和/或细胞毒性T细胞的产生。优选地，宿主会展示治疗性或保护性免疫学应答，以至于对新感染的抗性会增强和/或疾病的临床严重性减小。该保护会展示为由感染的宿主正常显示的症状的减小或缺乏，更快恢复时间和/或感染的宿主中降低的病毒滴度。本文使用的术语"免疫原性"蛋白或多肽也指引发以上描述的免疫学应答的氨基酸序列。本文使用的"免疫原性"蛋白或多肽包括蛋白的全长序列，其类似物，或其免疫原性片段。说道"免疫原性片段"是指包括一种或更多表位，由此引发上述免疫学应答的蛋白的片段。该片段可使用本领域熟知的任意数的表位标位技术鉴定。见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66(Glenn E. Morris, Ed.， 1996)。例如，线性表位可如下测定，例如，在固体支持物上同时合成大量肽，对应蛋白分子的部分的肽，及使肽与抗体反应而肽仍附接到支持物。该技术本领域已知及描述于，例如， U. S.专利No. 4，708，871 ；Geysen等人，1984 ；Geysen等人，1986，全部通过引用整体并入本文。类似地，通过测定氨基酸的空间构象，例如通过，例如，χ-射线晶体学和2维核磁共振容易鉴定构象表位。见，例如，Epitope Mapping ftx)tocols，见上。尤其可应用于小泰勒虫 (T. parva)蛋白的方法完全描述于PCT申请系列No。PCT/US2004/022605，通过引用整体并入本文。合成抗原也包括在定义内，例如，多表位，侧接表位，及其他重组体或合成来源的抗原。见，例如，Bergmann 等人，1993 ；Bergmann 等人，1996 ；Suhrbier, 1997 ；Gardner 等人， 1998。免疫原性片段，为本发明的目的，会通常包括分子的至少约3个氨基酸，优选至少约5 个氨基酸，更优选至少约10 15个氨基酸，及最优选约15 25个氨基酸或更多氨基酸。 片段长度无关键上限，其可包含蛋白序列的几乎全长，或甚至包含蛋白的至少一个表位的融合蛋白。因此，表达表位的多核苷酸的最小结构是其包含编码流感蛋白或多聚蛋白的表位或抗原决定簇的核苷酸，或基本上由其组成或由其组成。编码总蛋白或多聚蛋白的片段的多核苷酸，更有利地，包含编码总蛋白或多聚蛋白的序列的最小15个核苷酸，有利地约30 45个核苷酸，及优选约45 75，至少57，87或150个连续或连续的核苷酸，或基本上由其组成或由其组成。表位确定方法，例如，产生重叠肽库(Hemmer等人，1998)， Pepscan (Geysen et al. , 1984 ；Geysen et al. ,1985 ；Van der Zee R. et al. ,1989 ； Geysen, 1990 ；Multipin. RTM. Peptide Synthesis Kits de Chiron)和算法(De Groot 等人，1999)和在PCT申请系列No.PCT/US2004/02^05，均通过引用并入本文，无需过度实验而可用于本发明的实践。也可谘询本文引用的及合并的其他文献有关测定免疫原或抗原的表位由此编码该表位的核酸分子的方法。“多核苷酸”是含有以任何组合的脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸和类似物的任何长度的核苷酸的聚合物形式。多核苷酸可具有3维结构，及可实施知道的或未知的任何功能。 术语“多核苷酸”包括双_，单链和三-链化的螺旋分子。除非别有指定或需要，本文所述的发明的任何实施方式是包括双链形式和已知或预测组成DNA，RNA或杂交体分子的双链形式的各2个互补形式的多核苷酸。术语“密码子优化”指最佳配置编码用于在选定的宿主表达/翻译的蛋白，多肽， 抗原，表位，结构域或片段的核酸序列的过程。一般而言，基因表达水平依赖于许多因素，例如启动子序列和调控元件。最重要因素之一是将转录物基因的密码子利用适应到宿主的典型密码子利用(Lithwich, G. and Margalit, H.，Genome Res. 13,2665-2673,2003) 因此，原核生物基因组中在翻译选择下高度表达的基因具有显著的密码子使用偏好。这是因为它们使用被最丰富的tRNA物种识别的小子集的密码子(Ikemura，Τ.，J. Mol. Biol. 151， 389-409，1981)。调节此密码子适应的力称为翻译选择，且其强度在快速_生长细菌中重要(Rocha, E.P. ， Genome Res. 14,2279-2286,2004 ；Sharp, P.M. et al. ， Nucleic Acids Res. 33,1141-1153)。如果基因含有宿主罕见使用的密码子，其表达水平不会最大。此可为异源蛋白表达(Gustafsson,C. et al. ,Trends Biotechnol. 22，346-353，2004)和 DNA疫苗开发(Ivory, C. and Chadee，K.，Genet. Vaccines Ther. 2，17，2004)的限制之一。已重新设计大量合成基因来增加它们的表达水平。合成基因数据库(S⑶B) (ffu, G. et al.，Nucleic Acids Res. 35，D76-D79，2007)含有自多于200个公布的对于合成基因的实验的信息。在会插入新宿主来以最佳量表达某些蛋白的核酸序列的设计过程中，密码子利用优化通常是第 1 步骤之一 (Gustafsson, C.，Trends Biotechnol. 22，346-353，2004)。密码子利用优化基本上涉及改变靶基因中的罕见密码子，从而无需修饰编码的蛋白的氨基酸序列而使它们更紧密反映宿主的密码子利用(Gustafsson,C. ,Trends Biotechnol. 22，346-353，2004)。通常用于优化处理的信息因此是待优化的DNA或蛋白序列及宿主的密码子利用表(参照组)。有几个公共网页服务器和独立申请允许由本领域技术人员一些密码子优化。 iGeneDesign' (Richardson, S. Μ. et al. , Genome Res. 16, 550-556,2006), 'Synthetic Gene Designer' (ffu, G.et al. , Protein Expr. Purif. 47,441-445,2006)禾口 ‘Gene Designer，(Villalobos, A. et al.，BMC Bioinformatics 7，285，2006)是提供用于合成基因设计，包括密码子优化步骤的平台的包装。有关可在各服务器或程序中得到的密码子利用优化的方法，开发的第1个程序仅使用‘一个氨基酸-一个密码子’方法。更新近程序和服务器现在还包括创建一些密码子利用变异性的方法。此变异性反映天然高度表达的基因的密码子利用变异性及致使在优化过程中导入额外的标准(例如限制性位点的回避)。本文所述的多数申请及网页服务器提供3种密码子优化方法全部密码子的完全优化，使用 Monte Carlo方法的基于参照组的相对密码子利用频度的优化，和设计为用查询及优化的序列之间的最小变化最大化优化的新方法。在本文中的一实施方式中，编码NDV的蛋白补体的序列是用于在禽细胞中表达而优化的密码子，在优选的实施方式中，编码NDV P，L和 NP的核酸序列是用于在禽细胞中表达而优化的密码子。在再一实施方式中，编码重组蛋白， 抗原，肽，多肽，片段，结构域或表位的核酸序列是用于在禽中表达优化的密码子。在另一实施方式中，密码子优化的序列编码用于禽表达的AIV蛋白，抗原，肽，多肽，片段，结构域或表位。在再一实施方式中，密码子优化的序列编码用于禽表达的AIV HA和/或N蛋白，抗原，肽，多肽，片段，结构域或表位。以下是多核苷酸的非限制性例基因或基因片段，外显子，内含子，mRNA, tRNA, rRNA, siRNA,核酶，cDNA,重组多核苷酸，分支的多核苷酸，质粒，载体，任何序列的分离的 DNA，任何序列的分离的RNA，核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物，尿嘧啶，其他糖和连接基，例如氟核糖和硫醇盐，及核苷酸分支。 核苷酸序列可还在聚合之后修饰，例如通过与标记组分缀合。包括在此定义中的其他类型的修饰是加帽，一个或更多天然存在的核苷酸用类似物置换，及多核苷酸附接到蛋白，金属离子，标签组分，其他多核苷酸或固体支持物的手段的导入。多核苷酸可通过化学合成得到或源自微生物。本发明还包括编码流感蛋白，抗原，表位或免疫原的多核苷酸的互补链。互补链可为聚合物及任何长度，及可含有以任何组合的脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸和类似物。术语“蛋白”，“肽”，“多肽”和“多肽片段”在本文使用互换来指任何长度的氨基酸残基的聚合物。聚合物可为线性或分支的，其可包含修饰的氨基酸或氨基酸类似物，及其可由非氨基酸的化学部分打断。术语也包括已天然地或通过干扰修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成，糖基化，脂质化，乙酰化，磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标签或生物活性组分缀合。“分离的”多核苷酸或多肽是基本上无在其天然环境中与其相联的物质的多核苷酸或多肽。基本上无，是指至少50 %，至少70 %，至少80 %，至少90 %，或至少95 %无这些物质。杂交反应可在不同“严格度”条件下进行。熟知增加杂交反应的严格度的条件。见例如，"Molecular Cloning :A Laboratory Manual，，，第 2 版(Sambrook 等人，1989)。关联条件的例包括(为了增加严格度):25°〇，371，501和681的温育温度；10XSSC，6XSSC， 1 X SSC, 0. 1 X SSC的缓冲液浓度(其中SSC是0. 15M NaCl和15mM柠檬酸盐缓冲液)和使用其他缓冲液系统的它们的相当体；0^,25%, 50%和75%的甲酰胺浓度；温育时间自5分钟到24小时；1，2或更多次洗涤步骤；1，2或15分钟的洗涤温育时间；及6XSSC，1XSSC， 0. IXSSC或去离子水的洗涤溶液。本发明还包括编码流感多肽的功能性地相当的变体和衍生物和可增强，降低或不显著影响由此编码的多肽的固有性质的功能性地相当体片段的多核苷酸。这些功能性地相当的变体，衍生物和片段显示保留流感活性的能力。例如，不改变编码的氨基酸序列的DNA 序列的变化，以及导致氨基酸残基的保守性置换，一个或更少氨基酸缺失或添加，及氨基酸残基被氨基酸类似物置换的那些是不会显著影响编码的多肽的性质的那些。保守性氨基酸置换是甘氨酸/丙氨酸；缬氨酸/异亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺；天冬氨酸/谷氨酸；丝氨酸/苏氨酸/甲硫氨酸；赖氨酸/精氨酸；及苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸。在一实施方式中，变体与目标流感多核苷酸或多肽具有至少50%，至少55 %，至少60 %，至少65 %， 至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少 98%或至少99%同源性或同一性。
一方面，本发明提供流感多肽，特别禽流感多肽。在另一方面，本发明提供具有SEQ ID NO 15,17，19，21或23所示的序列的多肽，及其变体或片段。在另一方面，本发明提供多肽与本发明的禽HA多肽，特别与具有SEQ ID NO :15， 17，19，21或23所示的序列的多肽具有至少70 %，至少75 %，至少80 %，至少85 %，至少 90%，至少 95%，96%，97%，98%或 99%序列同一性。在再一方面，本发明提供以上鉴定的流感多肽的片段和变体(SEQ ID NO =15,17, 19，21和23)，其可由本领域技术人员使用良好-知道的分子生物学技术容易制备。变体是具有与本发明的抗原性多肽，特别与SEQ ID NO 15，17，19，21或23所示的氨基酸序列具有至少约75 %，80 %，85 %，90 %，95 %，96 %，97 %，98 %或99 %同一性的氨基酸序列的同源多肽。流感多肽的免疫原性片段包括具有SEQ ID NO :2,4,5,8,10，12或14所示的序列的流感多肽的至少8，10，15或20个连续氨基酸，至少21个氨基酸，至少23个氨基酸，至少 25个氨基酸，或至少30个氨基酸，或其变体。在另一实施方式中，流感多肽的片段包括见于全长流感多肽的特定抗原性表位。在另一方面，本发明提供编码流感HA多肽的多核苷酸，例如编码具有SEQ ID NO 15，17，19，21或23所示的序列的多肽的多核苷酸。在再一方面，本发明提供编码与具有SEQ ID NO 15，17，19，21或23所示的序列的多肽，或保守性变体，等位基因变体，同源物或包含这些多肽之一的至少8或至少10连续氨基酸的免疫原性片段，或这些多肽的组合具有至少 70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，96%，97%，98%或99%序列同一性的多肽的多核苷酸。编码流感HA多肽的多核苷酸可经密码子-优化用于在特定动物种中表达。HA蛋白可在自高度病原性禽流感序列(多碱性氨基酸RERRRKKR-SEQ ID NO 25)到低病原性禽流感序列(RETR-SEQ ID NO 26)的切割位点修饰。在另一方面，本发明提供具有如SEQ ID NO :14，16，18，21，22所示的核苷酸序列， 或其变体的多核苷酸。在再一方面，本发明提供与具有SEQ ID N0:14，16，18，21，22所示的序列的多核苷酸之一，或其变体具有至少70 %，至少75 %，至少80 %，至少85 %，至少90 %， 至少95 %，至少95 %，96 %，97 %，98 %或99 %序列同一性的多核苷酸。为本发明的目的，通过当比对以最大化重叠及同一性而最小化序列间隔时比较序列来测定序列同一性或同源性。尤其是，序列同一性可使用许多数学算法之任何测定。用于比较2个序列的数学算法的非限制性例是如在Karlin等人，1993中修饰的Karlin等人， 1990的算法。用于序列比较的数学算法的另一例是Myers等人，1988的算法。该算法合并入 ALIGN程序O. 0版)，其为GCG序列比对软件包装的部分。当利用用于比较氨基酸序列的 ALIGN程序时，可使用PAM120加权残基表，12的间隔长度罚分，及4的间隔罚分。用于鉴定局部序列相似性区和比对的再一有用的算法是描述于Pearson等人，1988的FASTA算法。一般而言，氨基酸序列的比较通过将已知的结构的多肽的氨基酸序列与未知结构的多肽的氨基酸序列比对来实现。然后比较序列中的氨基酸及同源的氨基酸组分在一组。 此方法检测多肽的保守的区及解释氨基酸插入和缺失。氨基酸序列之间的同源性可通过使用可商购的算法(也见以上同源性描述)测定。除了本文另外提及的那些之外，提及由美国生物技术信息中心提供的程序BLAST，空位BLAST，BLASTN，BLASTP和PSI-BLAST。这些程序在本领域中为此目的广泛使用，和可比对2个氨基酸序列的同源区。
套件中的全部搜索程序，空位比对常规整合到数据库搜索本身。如果需要，空位可关闭。长度1的间隔的默认罚分⑴)，对于蛋白和BLASTP是Q = 9，及对于BLASTN是Q = 10，但可在任何整数中变化。对于延伸间隔(R)的默认每-残基罚分，对于蛋白和BLASTP是 R = 2，及对于BLASTN是R = 10，但可在任何整数中变化。可使用Q和R的值的任何组合以便比对序列，以最大化重叠及同一性而最小化序列间隔。默认氨基酸比较矩阵是BL0SUM62， 但可利用其他氨基酸比较矩阵例如PAM。 替代性地或额外地，术语“同源性，，或“同一性”，例如，有关核苷酸或氨基酸序列， 可指2个序列之间的同源性的定量测量。百分率序列同一性可计算为(NMf-Ndif)*100/Nref， 其中 是当比对时2个序列中非-同一残基的总数，且其中是序列之一中的残基数。 因此，DNA序列AGTCAGTC会与序列AATCAATC (NMf = 8 ；Ndif = 2)具有75%的序列同一性。替代性地或额外地，“同源性”或“同一性”有关序列可指具有同一核苷酸或氨基酸的位置数除以2个序列中较短者的核苷酸或氨基酸数，其中2个序列的比对可根据Wilbur 和Lipman算法测定(Wilbur等人，1983，通过引用并入本文)，例如，使用20个核苷酸的窗口大小，4个核苷酸的字长，及4的间隔罚分，及包括比对的序列数据的计算机-辅助的分析和解析可使用可商购的程序(例如，Vector NTI软件TM，Invitrogen Inc. CA,USA)便利地进行。当说到RNA序列类似，或与DNA序列具有一定程度的序列同一性或同源性，DNA序列中的胸苷⑴认为是等于RNA序列中的尿嘧啶(U)。由此，RNA序列在本发明的范围内，且可源于DNA序列，通过DNA序列中的胸苷(T)认为是等于RNA序列中的尿嘧啶(U)。并且，无需过度实验，本领域技术人员可借助许多其他程序或参照用于测定百分率同源性。本发明还包括含有在载体分子或表达载体内和运作性连接到启动子元件和任选地连接到增强子的流感多核苷酸。“载体”指包含待体外或体内递送到靶细胞的异源多核苷酸的重组DNA或RNA质粒，噬菌体或病毒。异源多核苷酸可包含预防或治疗目的的目标序列，及可任选地以表达盒形式。如本文使用，载体不需能在最后靶细胞或受试者中复制。术语包括用于克隆的载体以及病毒载体。术语“经加工的”或“重组的”是指不天然存在或以不见于天然的排列连接到另一多核苷酸的半合成，或合成起源的多核苷酸。“异源”是指源于自相比较的其余实体遗传不同的实体。例如，多核苷酸可通过遗传加工技术合并到源自不同来源的质粒或载体，且由此是异源多核苷酸。自其天然编码序列移出的且运作性连接到非天然序列的编码序列的启动子是异源启动子。本发明的多核苷酸可在相同的转录单元内包含附加序列，例如额外的编码序列， 控制元件例如启动子，核糖体结合位点，5’ UTR, 3' UTR，转录终止子，多聚腺苷酸化位点，在相同的或不同启动子控制下的额外的转录单元，允许克隆，表达，同源重组，及宿主细胞转化的序列，及可期望提供本发明的实施方式的任何该构建体。本发明的载体中有利地存在用于表达流感多肽，抗原，表位或免疫原的元件。以最小方式，此包含起始密码子(ATG)，终止密码子和启动子，及任选地用于某些载体的多聚腺苷酸化序列，例如质粒和某些病毒载体，例如，非痘病毒的病毒载体，基本上由其组成或由其组成。当多核苷酸有利地，在载体中编码多聚蛋白片段，例如流感肽时，ATG放置在阅读框的5'处，和终止密码子放置在3'处。可存在用于控制表达的其他元件，例如增强子序列，稳定化序列，例如内含子及或未翻译的5 ‘或3 ‘序列和允许蛋白分泌的信号序列。
制造和/或施用用于体内或体外表达本发明的基因的基因产物的载体或重组体或质粒的方法可为任何期望的方法，例如，方法是通过或类似于公开于下列文献，或公开于下列文献中引用的文献的方法美国专利No. 4，603，112 ；4, 769，330 ；4, 394，448 ；4, 722，848 ； 4，745，051 ；4，769，331 ；4，945，050 ；5，494，807 ；5，514，375 ；5，744，140 ；5，744，141 ； 5，756，103 ；5，762，938 ；5，766，599 ；5，990，091 ；5，174，993 ；5，505，941 ；5，338，683 ； 5，494，807 ；5，591，639 ；5，589，466 ；5，677，178 ；5，591，439 ；5，552，143 ；5，580，859 ；
6，130，066 ；6，004，777 ；6，130，066 ；6， 6，387，376 ；6，376，473 ；6，368，603 ；6， 6，217，883 ；6，207，166 ；6，207，165 ；6，
497，883 ；6，464，984 ；6，451，770 ；6，391，314 348，196 ；6，306，400 ；6，228，846 ；6，221，362 159，477 ；6，153，199 ；6，090，393 ；6，074，649
6，045，803 ；6，033，670 ；6，485，729 ；6，103，526 ；6，224，882 ；6，312，682 ；6，348，450 ； 6，312，683，及6，596，279 ;1986年10月16日提交的美国专利申请系列No. 920，197 ；WO 90/01543 ；W091/11525 ；WO 94/16716；WO 96/39491 ；WO 98/33510 ；EP 265785 ；EP 0 370 573 ；Andreansky 等人，1996 ；Ballay 等人，1993 ；Feigner 等人，1994 ；Frolov 等人，1996 ； Graham, 1990 ；Grunhaus 等人，1992 Ju 等人，1998 ；Kitson 等人，1991 ；McClements 等人， 1996 ；Moss,1996 ；Paoletti，1996 ；Pennock 等人，1984 ；Richardson(Ed)，1995 ；Smith 等人，1983 ；Robertson 等人，1996 ；Robinson 等人，1997 ；及 Roizman, 1996。本文引用的及通过引用文献并入本文的，除了提供本发明的实践中有用的载体的例之外，也可提供用于待由在本发明的组合物中或在本发明的组合物中包括的载体表达的非-流感肽或其片段的源。本发明也涉及包含载体，例如表达载体的制备物，例如，预防剂或治疗组合物。制备物可包含一种或更多包含一种或更多流感多肽，抗原，表位或免疫原，基本上由其组成或由其组成(及有利地表达)的载体，例如，表达载体，例如体内表达载体，基本上由其组成或由其组成。载体在药学或兽医学可接受的载体，赋形剂或媒质中含有及表达包含编码(及有利地表达)流感抗原，表位或免疫原的多核苷酸，基本上由其组成或由其组成的多核苷酸。由此，根据本发明的实施方式，制备物中的其他载体包含编码，及在适当的环境下，载体表达一种或更多流感多肽，抗原，表位或免疫原(例如，血凝素，神经氨酸酶，核蛋白)或其片段的其他蛋白的多核苷酸，或基本上由其组成或由其组成，。根据另一实施方式，制备物中的载体包含编码流感多肽，抗原，表位或免疫原的一种或其更多蛋白或片段的多核苷酸，表达多核苷酸的载体，或基本上由其组成或由其组成。 本发明的制备物包含至少2种包含自编码相同的蛋白和/或不同蛋白的不同流感分离物的多核苷酸，基本上由其组成或由其组成，及有利地在适当的条件或适合的条件下或在适合的宿主细胞中体内表达的载体，基本上由其组成或由其组成。制备物含有一种或更多载体包含流感多肽，抗原，融合蛋白或其表位，基本上由其组成或由其组成多核苷酸编码，及有利地体内表达。本发明也针对载体混合物，其含有，基本上由其组成或由其组成，编码，及表达，不同流感蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原，例如，自不同物种例如但不限于人，马，猪，海豹，鲸，除了包括鸡，火鸡，鸭和鹅的禽物种之外的流感多肽，抗原，表位或免疫原。
术语质粒覆盖任何DNA转录单元，其包含根据本发明的多核苷酸和在期望的宿主或靶细胞内体内表达必需的元件；及，在这点上，需知，超螺旋的质粒和全部其拓扑异构体，开环质粒，以及质粒的线性形式，旨在在本发明的范围内。各质粒包含或含有或基本上由其组成，除了编码重组蛋白，抗原，表位或免疫原的异源多核苷酸之外，任选地与编码异源肽序列，变体，类似物或片段的多核苷酸融合，运作性连接到启动子或在启动子控制下或依赖于启动子。一般而言，有利地采用在真核细胞中发挥功能的强启动子。优选的强启动子是人或鼠起源，或任选地具有另一起源例如大鼠或豚鼠的立即早期巨细胞病毒启动子(CMV-IE)。CMV-IE启动子可包含实际启动子段，其可或可不相联于增强子段。可参考EP-A-260 148，EP-A-323 597，美国专利No. 5，168，062， 5，385，839和4，968，615，以及参考PCT申请No W087/03905。CMV-IE启动子有利地是人 CMV-IE(Boshart 等人，1985)或鼠 CMV-IE。在更通常情况下，启动子是病毒或细胞起源的。可在本发明的实践中有用地采用的非CMV-IE的强病毒启动子是SV40病毒的早期/晚期启动子或Rous肉瘤病毒的LTR启动子。在本发明的实践中有用地采用的强细胞启动子可为细胞骨架基因的启动子，例如结蛋白启动子(Kwissa等人，2000)，或肌动蛋白启动子(Miyazaki等人，1989)。这些启动子的功能亚片段，S卩，维持充足的启动活性的这些启动子的部分，包括在本发明内，例如根据PCT申请No. W098/00166或美国专利No. 6，156，567的截短的CMV-IE 启动子可用于本发明的实践。在本发明的实践中启动子随之包括维持充足的启动活性和因此发挥启动子的作用，优选基本上类似于衍生出衍生物或亚片段的实际或全长启动子的启动活性，例如，类似于美国专利No. 6，156，567的截短的CMV-IE启动子的活性，类似于全长 CMV-IE启动子的活性的全长启动子的衍生物及亚片段。由此，在本发明的实践中CMV-IE启动子可包含全长启动子的启动子部分和/或全长启动子的增强子部分，以及衍生物及亚片段，或基本上由其组成或由其组成。优选地，质粒包含其他表达控制元件，或基本上由其组成。特别有利地合并稳定化序列，例如，内含子序列，优选hCMV-IE的第1内含子(PCT申请No.W089/01036)，兔β-珠蛋白基因的内含子II (van Ooyen等人，1979)。作为质粒和非痘病毒的病毒载体的多聚腺苷酸化信号(多聚A)，可利用牛生长激素(bGH)基因的聚(A)信号(见美国专利No. 5，122，458)，或兔β-珠蛋白基因的聚(A)信号或SV40病毒的聚(A)信号。根据本发明的另一实施方式，表达载体是用于在适当的细胞系统中体外表达蛋白的表达载体。表达的蛋白可在分泌之后或非在分泌之后(如果无分泌，细胞裂解一般发生或进行)在培养上清中或自培养上清收获，任选地通过浓缩方法例如超滤浓缩和/或通过纯化手段，例如亲和性，离子交换或凝胶过滤-类型层析方法纯化。“宿主细胞”表示已遗传改变的，或能通过施用外源多核苷酸，例如重组质粒或载体遗传改变的原核生物或真核细胞。当指遗传改变的细胞时，术语兼指原本改变的细胞和其后代。有利的宿主细胞包括，但不限于，幼仑鼠肾(BHK)细胞，结肠癌(Caco-2)细胞，C0S7 细胞，MCF-7 细胞，MCF-10A 细胞，Madin-Darby 狗肾(MDCK)系，貂肺(MvlLu)细胞，MRC-5 细胞，U937细胞和VERO细胞。包含期望的序列的多核苷酸可插入适合的克隆或表达载体， 及载体，进而可导入用于复制和扩增的适合的宿主细胞。可通过任何本领域知道的手段将多核苷酸导入宿主细胞。可通过许多适当的手段之任何将含有目标多核苷酸的载体导入宿主细胞，包括直接摄取，胞吞，转染，交配，电穿孔，采用氯化钙，氯化铷，磷酸钙，DEAE-葡聚糖或其他物质的转染；微投射物轰击；脂转染；及感染(其中载体是感染性的，例如，反转录病毒载体)。引导载体或多核苷酸的选择会常常依赖于宿主细胞的特征。在本发明的一实施方式中，载体是新城疫病毒(NDV)载体。也称之为禽副粘病毒1的新城疫病毒(APMV1，副粘病毒科(Paramyxoviridae)，副粘病毒亚科 (Paramyxovirinae)，禽副粘病毒属(Avulavirus))是禽病原体，其天然存在的株呈现广范围的疾病严重性。NDV作为用于兽医学使用的疫苗载体特别有利，因为载体本身作为需要的家禽疫苗。NDV株致病型是无症状肠性(例如Ulster2C，Queensland V4)，缓发型(例如，Hitchner Bi, F(例如，Asplin)，La Sota)，中发型(例如，株 H，Mukteswar, Roakin, Beaudette C)或速发型(例如，Texas GB,NY parrot 70181，Italien，Milano，Herts33/56) 的。基于NDV载体的禽流感载体疫苗的优势包括，但不限于，(1)诱导广免疫，包括体液，细胞和粘膜应答⑵不表达NP和M蛋白，由此与DIVA(区分自免疫接种的动物感染的)策略相容，(3)诱导免疫的快速发作，(4) 二价，和( 产生位置相比意外释放中灭活的疫苗对环境风险更少。NDV的某些特征提示，表达外源病毒蛋白的重组NDV (rNDV)或经加工的NDV会是非常良好的疫苗候选体。NDV在许多细胞系和蛋中生长到非常高滴度，及其引发强体液和细胞免疫应答体内。NDV天然地感染经呼吸道和食道粘膜表面，因此，递送呼吸性疾病病原体，例如AIV的保护性抗原尤其有用。此外，在美国和多数其他国家广泛使用可商购的活NDV疫苗。基于活NDV重组体的疫苗也可相比其他活重组疫苗载体具有优势。首先，外源蛋白随仅少量NDV蛋白表达。相反，痘和疱疹病毒载体自它们的大-尺寸基因组表达大量的额外的蛋白。对于疫苗应用中特定免疫应答的产生，可有利地使仅有限数量的蛋白表达。第2， NDV无DNA期地在感染的细胞的细胞质中复制，其消除病毒基因组整合到宿主细胞DNA的问题。病毒不经历可检测的遗传重组。反向遗传学的另一应用是开发如本文所述的更有效和更佳NDV疫苗。当前NDV疫苗利用天然存在的缓发型株，例如Hitchner Bl和LaSota。如其他活衰减的疫苗所面对的， 当前NDV疫苗仍可由于毒力逆转而导致疾病。NDV疫苗株作为载体的选择是重要的，由于以 Hitchner BlNDV株报道的首次数据是令人失望的。其后，以LaSotaNDV株获得的数据是鼓舞人心，且基于此株的疫苗候选体现场用于中国和墨西哥。本发明描述了申请人利用NDV AVINEW 疫苗株作为用于将源于重组体的抗原递送到禽的载体。更特别抗原可为禽流感病毒(AIV)抗原。AVINEW 是全世界使用的由Merial Ltd.开发的活NDV疫苗。此疫苗株天然地无毒力，且呈现双呼吸和肠向性。禽中的趋异向性可给重组NDV (rNDV)或经加工的NDV疫苗提供独特生物学特征，其利用AVINEW 主链用于在禽中基因递送，有关自母源抗体(MDA)到NDV本身的干涉。该对MDA的抗性可允许可固有地具有显著水平的NDV-特异性MDA和另外反抗更常规重组NDV免疫的商业和野生型禽的活跃的免疫。此外，AVINEW 株属于可感染鸭的NDV基因组或类型O类，基因型I)。相比 LaSota (其向性基本上针对呼吸道)，AVINEW 株不诱导呼吸性副反应。在一实施方式中，NDV载体是NDV AVINEW 。NDV载体也可为美国专利No. 5，118，502的载体，尤其是作为ATCC No. VR 2239保藏的株。本发明的一实施方式提供AVINEW的基因组DNA序列及编码的蛋白序列。AVINEW NDV株的基因组DNA序列具有SEQ ID NO 1所示的多核苷酸序列。AVINEW基因组cDNA序列(SEQ ID NO 1)不同于 VG/GA 序列(GenBank 登录 No. EU289028)。AVINEff (SEQ ID NO: 1)和VG/GA(EU289028)基因组序列之间的序列同一性是89. 6 %。Avinew株和VG/GA株的蛋白之间的氨基酸序列同一性是对于NP蛋白(Avinew的SEQ ID NO :3和GenBank No. ABZ80386)是 95. 9%，对于 P 蛋白(Avinew v.的 SEQ ID NO 5 GenBankABZ80387)是 89. 7%，对于 M 蛋白(Avinew v.的 SEQ ID NO :7GenBank No. ABZ80388)是 94. 2%，对于 F 蛋白(Avinew v.的 SEQ ID NO :9GenBank No. ABZ80389)是 92. 4%，对于 HN 蛋白(Avinew v.的 SEQ ID NO 11 GenBank No. ABZ80390)是 88. 1 %，及对于 L 蛋白(Avinew v.的 SEQ ID NO 13 GenBank No. ABZ80391)是 96. 9%。Avinew株及 VG/GA株的基因之间的核酸序列同一性是对于NP基因(Avinew v.的 SEQ ID NO :2E似890 的 122 1591bp)是90. 6%， 对于 P 基因(Avinew v.的 SEQ ID NO :4E似890 的 1887 3074bp)是 88. 6%，对于 M 基因(Avinew v.的 SEQ ID NO :6E似890 的 3290 4384bp)是90. 1%，对于F基因(Avinew v.的 SEQ ID NO :8E似890 的 4544 6205bp)是 90. 0%，对于 HN基因(Avinew v.的 SEQ ID NO :10EU289028 的 6412 8145bp)是 84. 7%，及对于 L 基因(Avinew v.的 SEQ ID NO: 12EU289028的8381 149%bp)是90. 9%。完全基因组和个体基因序列与其他可得到的 NDV参照序列的比较显示，AVINEW NDV株与澳大利亚缓发型株98-1154和Queensland V4 遗传紧密相关。NDV 98-1154全基因组序列示于GenBank AY935491。ANIVEW (SEQ ID NO: 1)和AY93M91基因组序列之间的序列同一性是98. 8%。Avinew株和VG/GA株的蛋白之间的氨基酸序列同一性是对于NP蛋白(Avinew v.的SEQ ID NO 3 GenBank No. AAX45376) 是 99. 8%，对于 P 蛋白(Avinew v.的 SEQ ID NO 5 GenBank No. AAX45377)是 97. 7%， 对于 M 蛋白(Avinew v.的 SEQ ID NO 7 GenBank No. AAX45378)是 98. 4%，对于 F 蛋白 (Avinew v.的 SEQ ID NO 9 GenBank No. AAX45379)是98. 7%，对于HN蛋白(Avinew v.的 SEQ ID NO: IlGenBank No. AAX45380)是 92. 4%，及对于 L 蛋白(Avinew v.的 SEQ ID NO: 13 GenBank No. AAX45381)是99. 5 %。Avinew株及VG/GA株的基因之间的核酸序列同一性是对于 NP 基因(Avinew v.的 SEQ ID NO :2AY935491 的 122 1591bp)是 99. 0%，对于 P 基因(Avinew v.的 SEQ ID NO :4AY935491 的 1887 3074bp)是 98. 2%，对于 M 基因 (Avinew v.的 SEQ ID NO :6AY935491 的 3290 4384bp)是 98. 6%，对于 F 基因(Avinew v.的 SEQ ID NO :8AY935491 的 4544 6205bp)是 98. 8%，对于 HN基因(Avinew v.的 SEQ ID NO :10AY935491 的 6412 8154bp)是 93. 1%，及对于 L 基因(Avinew v.的 SEQ ID NO: 12AY935491 的 8381 14995bp)是 98. 8%。对于 Queensland V4，仅部分序列可在 GenBank 得到。在另一实施方式中，本发明提供具有SEQ ID而1，2，4，6，8，10，12或对所示的序列，及其变体或片段的多核苷酸。本发明还包括与本文所述的多核苷酸的互补链。在再一实施方式中，本发明提供具有SEQ ID N0:3，5，7，9，ll或13所示的序列的多肽，及其变体或片段。在另一方面，本发明提供具有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO M所示的序列的AVINEW 的基因组cDNA。在再一实施方式中，多核苷酸是具有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO : 所示的序列的多核苷酸的反向互补链。在再一实施方式中，本发明的多核苷酸或多核苷酸的反向互补链与具有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO : 所示的序列的多肽具有至少70%，至少75%， 至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，96%，97%，98%或99%序列同一性。在一实施方式中，本发明提供编码AVINEW多肽的多核苷酸的片段，例如编码具有 SEQ ID N0:3，5，7，9，ll或13所示的序列的多肽的多核苷酸。在再一方面，本发明提供编码与具有SEQ ID NO :3,5,7,9,11或13所示的序列的多肽，或保守性变体，等位基因变体， 同源物或包含这些多肽之一的至少8或至少10个连续氨基酸的免疫原性片段，或这些多肽的组合具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，96%，97%， 98%或99%序列同一性的多肽的多核苷酸。在另一方面，本发明提供具有SEQ ID而1，2，4，6，8，10，12或对所示的核苷酸序列的多核苷酸，或其变体。在再一实施方式中，多核苷酸是具有SEQ ID NO :1，2，4，6，8，10， 12或对所示的序列的多核苷酸的反向互补链。在再一方面，本发明提供与具有SEQ ID NO 1，2，4，6，8，10，12或M所示的序列的多核苷酸之一，或其变体具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，96%，97%，98%或99%序列同一性的多核苷酸或多核苷酸的反向互补链。一方面，本发明涉及用于在用疫苗或组合物接种的宿主动物中诱导免疫学应答的药物组合物或疫苗，组合物包括药物可接受的载体和修饰的AVINEW重组病毒。在本发明的再一方面，经加工的AVINEW病毒，在病毒基因组的非必要区内，包括编码源自病原体的抗原性蛋白的异源DNA序列，其中当疫苗施用给宿主时，能诱导特异于由病原体编码的蛋白的免疫学应答。术语“非必要区”指对于病毒在组织培养中的复制和繁殖不是必要的及其缺失或灭活可减少在各种动物系统中的毒力的病毒基因组区。任何非必要区或其部分可自AVINEW 基因组缺失或外源序列可插入其中，及由缺失或插入所致的经加工的AVINEW的活力和稳定性可用于确定是否删除的区或其部分的确非必要。在另一实施方式中，AVINEW基因组的非必要区是AVINEW基因组的P基因和M基因之间的区，或M基因和F基因之间的区。在再一实施方式中，非必要区可在SEQ ID NO :1的第3075 第3289核苷酸或第4385 第4543 核苷酸，SEQ ID NO 24的第3115 第3353核苷酸或第4449 第4607核苷酸的区内。本发明的一方面涉及表达禽抗原的NDV载体。抗原可为禽流感抗原。禽流感抗原可为血凝素，例如H5HA。本发明也涵盖表达禽流感基因的NDV载体，例如兼有自HPAIV野生鸟分离物的野生型及突变的HA开放阅读框(ORF)，A/斑头雁/青海/3/2005 (H5m)插入到LaSota NDV疫苗株的P和M基因之间的基因间区的表达H5亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA) 的 NDV 的构建体(例如，Ge et al.，Journal of Virology, Jan. 2007，vol. 81，no. 1， pp. 105-158)，以登录号No. AF375823提交到GenBank的表达流感病毒的新城疫病毒(NDV) 疫苗株 Hitchner Bl 的完全 cDNA 克隆(见，例如，Nakaya et al.，Journal of Virology, Dec. 2001，pp. 11868-11873)，表达 HPAIV A/鸡 / 越南/P41/05 (H5m)的 H5 蛋白的 NDV 重组体(NDVH5Vm)(见例如，Romer-OberdSrfer et al. ,Vaccine. 2008 May2 ；26 (19) 2307-13. Epub 2008 Mar 18)，使用有自禽流感病毒(AIV) A/鸡/NY/13142-5/94 (H7N2)的血凝素(HA)基因插入的缓发型副粘病毒1型载体(NDV Bl株)构建的rNDV-AIV-H7(见，例如，Swayne et al. ,Avian Diseases 47 1047-1050，2003)，通过反向遗传学构建的亚型H5 的 NDV-表达禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)(见，例如，Veits et al. ,PNAS5May 23，2006， vol. 103，no. 21，pp. 8197-8202)和基于缓发型 NDV 疫苗株 Clone 30 的 AIV A/ 鸡 / 越南 / P41/2005(H5N1)的表达HA基因的重组NDV-H5 (见，例如，Veits et al.，Vaccine (2008) 26， 1688-1696)。在本发明的再一实施方式中，也涵盖表达NDV基因的禽流感病毒，例如代替表达 H7禽流感病毒血凝素的胞外域的H5W禽流感病毒或二价疫苗的神经氨酸酶蛋白表达NDV 的血凝素-神经氨酸酶基因的胞外域的嵌合禽流感病毒到成融及衰减的NDV基因(含仅其胞外域，具有源自NDV的F蛋白的跨膜和细胞质结构域)(见，例如，Park et al. ,PNAS,May 23，2006，vol. 103，no. 21，pp.8203—8308)。在一实施方式中，本发明用于将治疗有效量的用于递送和表达蛋白，抗原，表位或免疫原的制剂施用到靶细胞。预防性地或治疗有效量的确定是本领域普通技术人员的常规实验。在另一实施方式中，制剂包含包含表达流感抗原，表位或免疫原的多核苷酸表达载体的和药学或兽医学可接受的载体，媒质或赋形剂。在另一实施方式中，药学或兽医学可接受的载体，媒质或赋形剂辅助转染和/或改善载体或蛋白的保存。本领域技术人员熟知药学或兽医学可接受的载体或媒质或赋形剂。例如，药学或兽医学可接受的载体或媒质或赋形剂可为无菌水，0.9% NaCl (例如，盐水)溶液或磷酸盐缓冲液。可用于本发明的方法的其他药学或兽医学可接受的载体或媒质或赋形剂包括，但不限于，聚-(L-谷氨酸)或聚乙烯吡咯烷酮。药学或兽医学可接受的载体或媒质或赋形剂可为辅助载体施用的任何化合物或化合物的组合(或自本发明的载体外表达的蛋白)；有利地，载体，媒质或赋形剂可辅助转染和/或改善载体(或蛋白)的保存。本文在一般描述中讨论了剂量体积，且也可由本领域技术人员自本公开以及本领域中的知识，无需任何过度实验确定。有利地但不排他性地适于质粒的含有季铵盐的阳离子脂质，有利地是具有以下式的那些
CH3
I +
R1-O- CH2- CH-CH2-N-R2-X
II
OR1CH3其中Rl是具有12 18个碳原子的饱和的或不饱和的直链脂肪族自由基，R2是含有2或3个碳原子的另一脂肪族自由基，且X是胺或羟基，例如DMRIE。在另一实施方式中阳离子脂质可与中性脂质，例如DOPE相联。这些阳离子脂质中，偏好DMRIE(N42-羟乙基)_N，N-二甲基_2，3_双(十四烷基氧基)"I"丙烷铵；W096/34109)，有利地与中性脂质关联，有利地为DOPE ( 二油酰-磷脂酰-乙醇胺；Behr, 1994)，以形成 DMRIE-D0PE。有利地，无准备地及有利地与施用制备物同时或在施用制备物之前不久形成具有佐剂的质粒混合物；例如，在施用之前不久或之前，形成质粒-佐剂混合物，有利地为了施用之前给足够的时间用于混合物形成复合物，例如施用之前约10和约60分钟之间，例如施用之前约30分钟。当DOPE存在时，DMRIE DOPE摩尔比有利地为约95 约5 约5 约95，更有利地约1 约1，例如，1 1。DMRIE或DMRIE-D0PE佐剂质粒重量比可为约50 约1和约1 约10之间，例如约10 约1和约1 约5之间，及有利地约1 约1和约1 约2之间，例如，1 1和 1 2之间。在另一实施方式中，药学或兽医学可接受的载体，赋形剂或媒质可为油包水乳剂。 适合的油包水乳剂的例包括基于油的油包水疫苗乳剂，其稳定和于4°C流动，其含有6 50V/V%的含有抗原的水相，优选12 25V/V%，50 94V/V%的含有(总共或部分)非-可代谢的油(例如，矿物油例如石蜡油)和/或可代谢的油(例如，植物油或脂肪酸，多元醇或醇酯)的油相，0. 2 20p/v%的表面活性剂，优选3 8p/v%，后者总共或部分，或以混合物是聚甘油酯，所述聚甘油酯优选为聚甘油(聚)蓖麻油酸酯，或聚氧乙烯蓖麻毒素油或氢化的聚氧乙烯蓖麻毒素油。可用于油包水乳剂的表面活性剂的例包括乙氧基化的山梨糖醇酐酯(例如，聚氧乙烯(20)单油酸山梨糖醇酐(Tween 80 )，可得自AppliChem, Inc.，Cheshire，CT)和山梨糖醇酐酯(例如，单油酸山梨糖醇酐(Span 80 )，可得自Sigma Aldrich Jt. louis，M0)。此外，有关油包水乳剂，也见US专利No. 6，919，084，例如，其实施例8，通过引用并入本文。在一些实施方式中，含有抗原的水相包含盐溶液包含一种或更多缓冲剂。适合的缓冲溶液的例是磷酸盐缓冲的盐水。在有利的实施方式中，油包水乳剂可为水/油/水(W/0/W)三层乳剂(见，例如，美国专利No. 6，358，500，通过引用并入本文)。 其他适合的乳剂的例描述于美国专利No. 7，371，395，通过引用并入本文。免疫学组合物和疫苗根据本发明可包含一种或更多佐剂，或基本上由其组成。本发明的实践中使用的适合的佐剂是(1)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，马来酐和烯基衍生聚合物，( 免疫刺激序列(ISS)，例如具有一个或更多非-甲基化的CpG单元的寡脱氧核苷酸序列(Klinman等人，1996 ；W098/16247), (3)水包油乳剂，例如描述于由M. Powell， Μ. Newman, Plenum Press 1995 出版的“Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach”的ρ 147的SPT乳剂，及描述于相同的文章的ρ 183的MF59乳剂，(4)含有季铵盐的阳离子脂质，例如，DDA(5)细胞因子，(6)氢氧化铝或磷酸铝，(7)皂苷或⑶引用的及通过引用合并到本申请的任何文献中讨论的其他佐剂，或⑶)其任何组合或混合物。水包油乳剂(3)，其尤其适于病毒载体，可基于轻液体石蜡油(欧洲药典类型)， 类异戊二烯油，例如角鲨烷，角鲨烯，由烯，例如异丁烯或癸烯的寡聚化产生的油，具有直链烷基的酸或醇的酯，例如植物油，油酸乙酯，丙二醇，二(辛酸酯/癸酸酯)，甘油三(辛酸酯 /癸酸酯)和丙二醇二油酸酯，或分支的，脂肪醇或酸的酯，尤其是异硬脂酸酯。油与乳化剂联用而形成乳剂。乳化剂可为非离子表面活性剂，例如一方面是山梨糖醇酐的酯，二缩甘露醇(例如无水甘露糖醇油酸酯)，甘油，聚甘油或丙二醇，而另一方面是油酸，异硬脂酸，蓖麻油酸或羟基硬脂酸，所述酯任选地是乙氧基化的，或聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，例如Pluronic，例如，L121。类型(1)佐剂聚合物中，偏好交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，尤其通过糖或多元醇的聚烯基醚的交联。这些化合物已知名称为卡波姆(Pharmeuropa，vol.8, No. 2, 1996年6月)。本领域技术人员也可参考美国专利No. 2，909，462，其提供通过具有至少3个羟基，优选不多于8个该基团，被具有至少2个碳原子的不饱和的，脂肪族自由基取代的至少3个羟基的氢原子的聚羟基化合物交联的该丙烯酸聚合物。优选的自由基是含有2 4个碳原子的那些，例如乙烯基，烯丙基和其他乙烯键合地不饱和基团。不饱和的自由基也可含有其他取代基，例如甲基。尤其适合以名称卡波泊尔售的产品(BF Goodrich, Ohio, USA)。它们通过烯丙基蔗糖或通过烯丙基季戊四醇交联。它们之中，参考卡波泊尔974P， 934P 和 971P。有关马来酐-烯基衍生共聚物，偏好EMA(Monsanto)，其是直链或交联的乙烯-马来酐共聚物，且它们，例如，通过二乙烯基醚交联。也参考J. Fields等人，1960。有关结构，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和EMA优选通过具有以下式的基本单元形
成
权利要求
1.组合物，其包含(i)经加工的NDV载体、和( )药学或兽医学可接受的载体。
2.权利要求1的组合物，其中经加工的NDV载体包含编码禽流感HA抗原的异源多核苷酸或其变体。
3.权利要求1或2的组合物，其中经加工的NDV载体包含与具有SEQ ID NO :1所示的序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸、或和与具有SEQ ID NO :1所示的序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸。
4.权利要求2或3的组合物，其中禽流感HA抗原是H5HA多肽。
5.权利要求2 4中任一项的组合物，其中HA抗原具有修饰的切割位点。
6.权利要求2 5中任一项的组合物，其中HA抗原与具有SEQID NO :15，17，19，21或 23所示的序列的多肽具有至少80%氨基酸序列同一性。
7.权利要求2 6中任一项的组合物，其中异源多核苷酸与具有SEQID NO =14,16, 18,20或22所示的序列的多核苷酸具有至少80%序列同一性。
8.修饰NDV的基因组来产生经加工的NDV载体的方法，其中方法包括将分离的多核苷酸在NDV基因组的非必要区内导入NDV基因组中。
9.权利要求8的方法，其中NDV包含与具有SEQ ID NO :1所示的序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸、或和与具有SEQ ID NO :1所示的序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸。
10.权利要求8或9的方法，其中非必要区选自由下列组成的区位于NP基因上游， APMV基因组的2个基因之间，及L基因的下游的非翻译区。
11.权利要求8 10中任一项的方法，其中非必要区位于P和M基因之间或M和F基因之间。
12.引发禽的保护性应答或针对至少一种禽病原体而给禽免疫接种的方法，包括给禽施用表达至少一种抗原的经加工的NDV载体和药学或兽医学可接受的载体，赋形剂或媒质。
13.权利要求12的方法，其中NDV载体包含与具有SEQ ID NO :1所示的序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸、或和与具有SEQ ID NO :1所示的序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸。
14.权利要求12或13的方法，其中抗原是禽流感抗原。
15.权利要求14的方法，其中禽流感抗原是血凝素(HA)。
16.权利要求15的方法，其中禽HA抗原与具有SEQID NO 15，17，19，21或23所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性。
17.权利要求12 16中任一项的方法，其中施用是通过眼滴，喷雾，饮用水，卵内，肌内或皮下施用。
18.权利要求12 17中任一项的方法，其中施用是初施-追施。
19.权利要求18的方法，其中初施-追施包括 初次施用权利要求1 7中任一项的组合物，及追加-施用包含含有及体内表达禽病原体抗原的重组病毒载体的疫苗或组合物，或包含禽病原体抗原的灭活的病毒疫苗，或包含禽病原体抗原(亚基)的疫苗或组合物，或含有或表达禽病原体抗原的DNA质粒疫苗或组合物。
20.权利要求18的方法，其中初施-追施包括 初次施用包含含有及体内表达禽病原体抗原的重组病毒载体的疫苗或组合物，或包含禽病原体抗原的灭活的病毒疫苗，或包含禽病原体抗原(亚基)的疫苗或组合物，或含有或表达禽病原体抗原的DNA质粒疫苗或组合物，及追加-施用权利要求1 7中任一项的组合物。
21.权利要求20的方法，其中，初次施用包括包含含有及表达禽流感抗原的痘病毒的组合物，而追加施用包括包含禽流感抗原的权利要求1 7中任一项的组合物。
22.权利要求18的方法，其中初施-追施包括 初次施用权利要求1 7中任一项的组合物，和追加施用权利要求1 7中任一项的组合物。
23.权利要求12 22中任一项的方法，其中禽是鸡或鸭。
24.经加工的NDV载体，其包含与SEQID NO :1具有至少90%序列同一性的多核苷酸。
25.分离的多核苷酸，其选自(a)与具有SEQID NO :1，2，4，6，8，10，12或M所示的序列的多核苷酸具有至少90% 序列同一性的多核苷酸；(b)与编码具有SEQID N0:3，5，7，9，ll或13所示的序列的多肽的多核苷酸具有至少 90%序列同一性的多核苷酸；以及(c)与(a)或(b)的多核苷酸互补的多核苷酸。
全文摘要
本发明包括经加工的新城疫病毒(NDV)疫苗或组合物。疫苗或组合物可为重组疫苗。本发明也包括编码及表达禽病原体抗原，更特别禽流感蛋白，表位或免疫原的重组载体。该疫苗或组合物可用于保护动物，尤其是禽，免于疾病。
文档编号C07K14/11GK102428099SQ201080022159
公开日2012年4月25日 申请日期2010年4月2日 优先权日2009年4月3日
发明者F·雷纳尔, F-X·勒格罗斯, M·巴布洛特 申请人:梅里亚有限公司