指向金黄葡萄球菌表位isaa或isab的抗体或其片段的制作方法

专利名称：指向金黄葡萄球菌表位isaa或isab的抗体或其片段的制作方法
技术领域：
本发明涉及指向金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ( = S. aureus)表位的抗体或其片段，含有这些抗体或片段的试剂盒，这些抗体或片段的用途，产生这些抗体的杂交瘤细胞系以及治疗方法。
背景技术：
根据FEMS Imunol. Med. Microbial. 2000 Oct. ;29 (2)第 145 到 153 页，由耐甲氧西林金黄葡萄球菌(MRSA)引起的脓毒症期间在体内表达的免疫显性结构是已知的。这些结构是29kDa蛋白质IsaA和17kDa蛋白质IsaB。声称的是这些蛋白质可以充当开发指向MRSA的基于抗体的治疗的潜在靶点。
根据摘要"Development of antibody-based therapy targetingimmunodominant antigens of Staphylococcus aureus " , Ohlsen, K.等人，2007 年 9月 Deutsche Gesellschaft fur Hygiene und Mikrobiologie 的第 59 次年度会议出版的摘要集第 128 页，以及根据 Lorenz, U.等人"Therapeutische Effektivitat vonmonoklo—nalen Antikorpern gegen Staphylococcus aureus in einem Sepsis—undAbszess-Mausmodell" , Chirurgisches Forum 2008, Springer Berlin Heidelberg, 2008年5月29日，17期225-226页，两种动物感染模型中靶向免疫显性抗原IsaA的一种第一鼠单克隆抗体的应用是已知的。研究显示了，抗IsaA MAB的应用降低了两种感染模型中的感染负荷。

发明内容
本发明的目的是提供非常适合于治疗由金黄葡萄球菌引起的感染以及适合于检测金黄葡萄球菌的新的抗体或其片段。此外，提供含有这些抗体或片段的试剂盒，这些抗体或片段的用途，分泌这些抗体或片段的杂交瘤细胞系以及治疗方法。权利要求1、8、15、16、17和19的主题解决了这个目的。本发明的实施方式在权利要求2到7、9至Ij 14、18和20到24中公开了。根据本发明，提供了抗体或其片段，其中所述抗体或片段指向金黄葡萄球菌表位，所述表位被杂交瘤细胞系分泌的进一步单克隆抗体(monoclonal further antibodies)识别，所述杂交瘤细胞系以保藏登记号DSM ACC2987或DSM ACC2988保藏于德国Inhoffenstr. 7B,D_38124 Braunschweig的德国微生物和细胞保藏有限公司(DSMZ)。以保藏登记号DSM ACC2987保藏于DSMZ的杂交瘤细胞系进一步被称为“细胞系DSM ACC2987”，以保藏登记号DSM ACC2988保藏于DSMZ的杂交瘤细胞系进一步被称为“细胞系DSMACC2988”。细胞系DSM ACC2987和DSM ACC2988分泌的进一步单克隆抗体是单克隆的小鼠抗体。根据本发明的抗体包括完整免疫球蛋白分子，优选地，IgMs, IgDs, IgEs, IgAs、或IgGs，更优选地的lgGl、lgG2a、lgG2b、lgG3或lgG4，而所述片段包含这样的免疫球蛋白分子的部分，如Fab片段或V区、VH区或CDR区。此外，抗体包括修饰和/或改变的抗体，如嵌合的和人源化的抗体。抗体还包括修饰的或改变的单克隆的或多克隆的抗体，以及重组地或合成地产生的或合成的抗体。片段包括抗体片段以及其部分，例如分离的轻链和重链、Fab、Fab/c、Fv、Fab'、F(ab' )2。根据本发明的抗体还包括抗体衍生物,如双功能抗体以及抗体构建体，如单链Fvs (scFv)、双特异性scFvs或抗体-融合蛋白。所有抗体衍生物展现了衍生出它们的抗体的结合特异性，即，它们指向金黄葡萄球菌表位，所述表位被杂交瘤细胞系DSM ACC2987或DSM ACC2988分泌的进一步单克隆抗体识别。细胞系DSM ACC2987分泌的进一步单克隆抗体识别的表位位于免疫显性S. aureus抗原IsaA上。细胞系DSM ACC2987分泌的进一步单克隆抗体识别的表位位于免疫显性S. aureus抗原IsaB上。本发明的发明人发现，根据本发明的抗体识别的表位在S. aureus上特异性地暴露。指向这些表位的抗体或其片段非常适合于S. aureus的检测以及S. aureus感染的治疗。由于S. aureus的高变异性引起不同的毒株上抗原的不同程度的表达和突变，识别其他抗体不识别的另外表位的每种抗体对于S. aureus的检测以及S. aureus感染的治疗是有用的。
抗体可以是多克隆或单克隆的抗体。特别地，抗体可以是进一步单克隆抗体，即，由杂交瘤细胞系DSM ACC2987或DSM ACC2988分泌的抗体。这些抗体对于S. aureus的检测以及感染的治疗是非常有用的。它们展现了非常高的亲和性和特异性。杂交瘤细胞系DSM ACC2987分泌的抗体对这些抗体识别的表位的高度亲和性，是由所述抗体与所述表位结合的低Kd值所表明的。取决于测定Kd值的方法，这种结合测出了 ( 18pM和I. 7nM的Kd值(参见附图6和7以及相应的文字)。杂交瘤细胞系DSM ACC2987和/或DSM ACC2988分泌的单克隆抗体或抗体可以是IgG型的抗体，特别是IgGl型或IgG2b型的。片段可以是Fab片段、Fab/c片段、Fv片段、Fab'片段或F(ab' )2片段。这些片段对于S. aureus的检测是特别有用的，因为S. aureus的细胞壁含有蛋白A，蛋白A通过它们的Fe部分非特异性地结合免疫球蛋白。抗体可以是动物抗体，即，在动物中产生的抗体，特别是鼠、牛或骆驼抗体、人类抗体，在植物、卵或真菌特别是酵母菌中产生的抗体，在细胞系的细胞中产生的重组抗体、嵌合抗体或人源化的抗体。人源化抗体可以是含有单克隆小鼠抗体，例如，由杂交瘤细胞系DSM ACC2987或DSM ACC2988分泌的单克隆抗体的结合部分，以及人类抗体的非结合部分的单克隆抗体。每种抗体可以具有带有第一可变区的重链和带有第二可变区的轻链，其中所述杂交瘤细胞系是DSM ACC2987，以及其中所述第一可变区包含与序列SEQ ID NO 2至少90%相同的、特别地至少92. 5%相同的、特别地至少95%相同的、特别地至少97. 5%相同的、特别地100%相同的氨基酸序列，以及其中所述第二可变区包含与序列SEQ ID N0:4至少90 %相同的、特别地至少92. 5 %相同的、特别地至少95 %相同的、特别地至少97. 5 %相同的、特别地100%相同的氨基酸序列，或其中所述杂交瘤细胞系是DSM ACC2988，以及其中所述第一可变区包含与序列SEQ ID NO :6至少90%相同的、特别地至少92. 5%相同的、特别地至少95%相同的、特别地至少97. 5%相同的、特别地100%相同的氨基酸序列，以及其中所述第二可变区包含与序列SEQ ID NO :8至少90%相同的、特别地至少92. 5%相同的、特别地至少95%相同的、特别地至少97. 5%相同的、特别地100%相同的氨基酸序列，
上文表征的第一可变区和第二可变区一起形成具有对表位的高亲和性和特异性的结合位点。编码根据SEQ ID NO :2的第一可变区的一种可能的DNA序列是序列SEQ ID NO:I。SEQ ID NO :1是编码细胞系DSM ACC2987分泌的抗体的第一可变区的序列。根据SEQID NO :4的第二可变区可以由序列SEQ ID NO :3编码。SEQ ID NO :3是编码细胞系DSMACC2987分泌的抗体的第二可变区的序列。根据SEQ ID NO :6的第一可变区由序列SEQ ID NO :5编码，其是编码细胞系DSMACC2988分泌的抗体的第一可变区的序列。根据SEQ ID NO :8的第二可变区可以由序列SEQID N0:7编码。SEQ ID NO :7是编码细胞系DSM ACC2988分泌的抗体的第二可变区的序列。 如果杂交瘤细胞系是DSM ACC2987，S卩，如果表位位于免疫显性S. aureus抗原IsaA上，所述表位可以包含至少一个氨基酸序列，所述氨基酸序列与根据序列表的序列SEQID NO 15,17到19,21到26,32到34和57之一至少10个、特别地至少11个、特别地至少12个、特别地至少13个、特别地至少14个、特别地至少15个氨基酸是相同的。表位作图显示了，序列SEQ ID NO :15、17到19,21到26,32到34和57涉及抗体或片段与表位的结合。表位可以包含上文说明的超过一个氨基酸序列。表位甚至可以由在IsaA的氨基酸序列上相互远离的两个或更多个序列形成。根据本发明的抗体或片段可以用作药物。特别是，它们可以用作用于治疗人或动物的药物，所述人或动物具有s. aureus的感染,特别是耐甲氧西林或甲氧西林敏感性S. aureus的感染,或具有得到这样的感染的风险。所述人或动物可以患有由感染引起的乳腺炎或脓毒症。所述乳腺炎可以是牛乳腺炎。如果奶牛患有牛乳腺炎，该奶牛不能产生可用的牛奶，如果奶牛用抗生素治疗，通常在这种情况下，这头奶牛产生的牛奶必需丢弃，直到该奶牛的奶中不含抗生素。常规治疗的这种缺点可以通过使用根据本发明的抗体或片段作为治疗牛乳腺炎的药物来避免。所述药物可以做为全身性和/或局部施用而制备的药物。发明人认识到，使用根据本发明的抗体或片段治疗严重的S. aureus感染引起了死亡率以及治疗的人或动物的器官中S. aureus数量的显著降低。此外，发明人认识到，如果根据本发明的抗体结合到S. aureus细菌,与没有这些抗体的S. aureus细菌相比，多形核白细胞的S. aureus细菌吞曬性杀伤被显著增强了。所述抗体或片段可以在与其他抗体或这些其他抗体的片段的混合物中存在，所述其他抗体指向金黄葡萄球菌的至少一种进一步的表位。这种进一步的表位可以位于所述表位坐落的抗原上，即IsaA或IsaB，或位于进一步的抗原上。这样的混合物作为药物的应用与单独含有根据本发明的抗体或片段的药物的应用相比是更有效的。这可能是由于S. aureus的高度可变性,其引起不同菌株上抗原的不同程度的表达,从而与单独的抗体或片段相比，抗体或片段的混合物识别更多的细菌。所述抗体或片段可以存在于与至少一种抗生素的混合物中。在用所述药物治疗的人或动物中，除了常见的s. aureus之外可能存在突变的S. aureus。突变的S. aureus可以具有不能被根据本发明的抗体或片段识别的突变的IsaA和/或IsaB。在这种情况下，对于所述突变S. aureus抗生素可能是有效的。根据本发明的抗体或片段可以存在于与哺乳动物的血液的血浆、特别是人的血液的血浆的混合物中。发明人发现，与盐水溶液中含有的根据本发明的抗体或片段相比，与血浆混合的根据本发明的抗体或片段相比可能更有效得多。本发明还涉及用于检测S. aureus的、含有根据本发明的抗体或片段的试剂盒。这样的试剂盒可以用于诊断用途。本发明进一步涉及根据本发明的抗体或片段用于检测、特别是S. aureus的高特异性检测的用途。此外，本发明涉及产生根据本发明的抗体的杂交瘤细胞系。所述杂交瘤细胞系可以是以保藏登记号DSM ACC2987或DSM ACC2988保藏于DSMZ的细胞系。 本发明进一步涉及治疗人或动物的方法,所述人或动物患有金黄葡萄球菌,特别是耐甲氧西林或甲氧西林敏感性金黄葡萄球菌的感染，或处于获得这样的感染的风险中，其中根据本发明的抗体或片段被施用给所述人或所述动物。抗体或片段以一定剂量施用，所述剂量足以降低所述人或所述动物中S. aureus的数量,或引起S. aureus的消除。所述抗体或片段可以与适合的载体混合。所述人或动物可以患有由感染引起的乳腺炎或脓毒症。所述抗体或片段可以在与其他抗体或这些其他抗体的片段的混合物中存在，所述其他抗体指向金黄葡萄球菌的至少一种进一步的表位。此外，在被施用之前，所述抗体或片段可以与哺乳动物，特别是人的血液或血浆混合。所述抗体或片段可以全身地，特别是静脉内地、鼻腔地或舌下地施用。它们还可以与至少一种抗生素一起施用。


图la、lb、Ic显示了使用根据本发明的抗体、S. aureus菌株MA12(图la)、IsaA敲除菌株 MAl2 Δ isaA(图 Ib)、以及 S. aureus 蛋白 A 敲除菌株 Cowan I Δ spa: :Tcr (图 Ic)的免疫荧光染色。图2显示了与MAB-UK-66相比MAB_IsaA29克隆215的IsaA结合的ELISA数据。图3显示了在用S. aureus菌株USA300i. V.攻击和用根据本发明的单克隆抗体或同种型对照抗体i. V.治疗之后小鼠的存活率。图4显示了用S. aureus和根据本发明的单克隆抗体处理的小鼠的中央静脉导管和器官的S. aureus菌株MA12的回收率。图5显示了在存在和缺少根据本发明的抗体的情况下多形核白细胞的S. aureus的吞噬作用。图6显示了单克隆抗体MAB-UK-66对固定的IsaA的结合的动力学。图7显示了 IsaA对固定的单克隆抗体MAB_UK_66的结合的动力学。
具体实施例方式图Ia-Ic显示了用指向IsaA的表位的单克隆抗体作为初级抗体染色的结果，所述抗体由杂交瘤细胞系DSM ACC2987产生，被称为MAB-UK-66。针对小鼠IgG的FITC轭合的抗体被用作次级抗体。图Ia和Ic显不了 S. aureus菌株MA12和Cowan I Δ spa: :Tcr的阳性的免疫突光染色，而图Ib显示了 S. aureus菌株MA12 Δ isaA没有免疫突光染色。与天然的S. aureus细菌相比，s. aureus菌株Cowan I Δ spa: =Tclr的细菌不产生蛋白A。蛋白A具有对抗体的Fe部分的高度亲和性。在细菌上蛋白A的存在将引起初级和次级抗体对细菌的强的非特异性结合。菌株Cowan I Δ spa: =Tclr结合初级抗体表明IsaA的存在,但没有与蛋白A的交叉反应性。图2显示了酶联免疫吸附分析(ELISA)的结果，进行ELISA来比较已知的单克隆抗体MAB-IsaA29克隆215的IsaA结合以及MAB-UK-66的IsaA结合。MAB-IsaA29克隆215 是在摘要 〃 Development of antibody-based therapy targeting immunodominantantigens of Staphylococcus aureus" ,0hlsen,K等，2007年9月 Deutsche Gesellschaftfur Hygiene und Mikrobiologie的第59次年度会议出版的摘要集第128页，以及Lorenz, U.等"Therapeutische Effektivitat von monoklonalen Antikorpern gegenStaphylococcus aureus in einem Sepsis-und Abszess-Mausmodell" , ChirurgischesForum 2008, Springer Berlin Heidelberg，2008 年 5 月 29 日，17 期，225-226 页中描述的单克隆抗体。如下进行ELISA。在用磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7. 4)中O. 5 μ g/ml浓度的重组IsaA蛋白质(rlsaA)的100 μ I样品包被微量滴定板的每个反应孔过夜之后，反应孔用I %牛血清白蛋白封闭2小时。上述抗-IsaA抗体以I比4，000的比例稀释，并添加到反应孔。在孵育I小时之后，添加辣根过氧化酶轭合的兔抗小鼠IgG(DAK0，Glostrup, Denmark)并孵育I小时。然后添加ABTS[2，2' -二氮-双(3-乙基苯并噻唑磺酸)]底物(Sigma Chemical Co.,Deisenhofen, Germany),孵育I小时。使用微量培养板自动读取器检测405nm处的光吸收。从图I可以看出，MAB-UK-66对rlsaA的结合与已知的抗体MAB-IsaA29克隆215对rlsaA的结合相比更强烈得多。有效的抗S. aureus免疫治疗应当保护小鼠对抗S. aureus的致死性攻击。为了研究根据本发明的抗体在体内的效力，如下述在小鼠中建立S. aureus脓毒症的存活模型。年龄和性别匹配的NMRI 小鼠(Charles River, Sulzfeld, Germany)在 0 天用5X IO8个集落形成单位(cfu)的S. aureus USA300 (ATCC No. BAA-1556)的静脉内注射攻击。治疗的小鼠接受静脉内的MAB-UK-66或同种型匹配的抗体作为对照(双倍剂量用法在细菌攻击后立即地以及在24小时后，100 μ I体积的PBS、pH 7. 4中15mg/kg)。监视动物8天,记录致死性疾病。测量到显著的保护，Log-Rank/Mantel-Cox测试P = O. 022。结果在图3中示出。为了进一步研究根据本发明的抗体在体内的效力，如下述在小鼠中建立导管相关的S. aureus脓毒症模型。在实验中使用年龄、性别和体重匹配的NMRI小鼠(Charles River WigaDeutschland GmbH,97633 Sulzfeld,Germany)。小鼠用甲苯噻嗪(xylazin) (8mg/kg体重)/氯胺酮(100mg/kg体重)腹膜内地麻痹，在剃光的颈部左侧制作最小的横向皮肤切口。使用手术显微镜(Carl Zeiss Jena GmbH, 07745 Jena, Germany)在 10-16 X 放大率下，分离颂下腺来暴露前部和后部面静脉的分枝。在分离的前部面静脉上松散的缚线之间进行静脉切开术。将无菌的单一内腔聚乙烯导管(内径O. 28mmX外径O. 6mm)通过切口插入，向上腔静脉推进。系紧缚线，皮下地埋入导管，通过中线肩胛骨切口暴露在外。测试闭合性，用肝素溶 液填满导管，用塞子密封，在整个实验中就地放置。手术后二十四小时，小鼠通过导管接种含有 I X 107cfu S. aureus 细菌菌株 MA12 的 100 μ I S. aureus 悬浮液。MA12 是在 Ohlsen,K. , Ziebuhr, ff. , Roller, K. P. , Hell, ff. , ffichelhaus, T. A. , and Hacker, J. " Effects ofsubinhibitory concentrations of antibiotics on alpha-toxin(hla)gene expressionof methici11 in-sensitive and methici11 in-resistant Staphylococcus aureusisolates " , Antimicrob. Agents Chemother. (1998), 42,第 2817 到 2823 页中描述的来自护理人员的粘膜分离物。容许细菌悬浮液滞留在导管腔内15分钟。然后用0.2ml 0.9%盐水将导管的内容物冲洗到小鼠中。治疗的小鼠静脉内接受杂交瘤细胞系DSM ACC2987产生的抗体(双倍剂量用法细菌攻击后立即地和24h在100μ I的体积中15mg/kg)或静脉内盐水(对照组)。在实验期间每天评估体重和一般外观。接种后五天，通过C02吸入来使小鼠安乐死。从安乐死的小鼠无菌地收获器官，在2ml盐水中匀化。此外，确认上腔静脉中导管的位置，用2ml盐水灌洗外植的导管，采集灌洗液。器官组织匀浆和导管流体采集物的连续稀释物在甘露醇盐酚红琼脂平板上在37°C培养至少48小时。按照cfu/器官或cfu/导管计算集落形成单位。结果在图4中示出。数据显示了，用根据本发明的抗体治疗引起了器官的细菌载荷的明显降低。 为了研究根据本发明的抗体对吞曬作用的影响，使用Polymorphprep (Nycomed,Oslo, Norway)根据厂家的说明书分离人类嗜中性粒细胞。补充有O. I % (wt/vol)明胶(HBSS-gel)的 lml Hanks'平衡盐溶液(HBSS)中 I X IO7Cfu 的 S. aureus MA12 和杂交瘤细胞系DSM ACC2987产生的纯化的15% (体积/体积)MAB-UK-66抗体或PBS (对照)在缓慢摇晃的水浴中在37°C孵育30分钟。最终体积I. 5ml的等体积的5X IO6个抗体和PBS处理的S. aureus以及I X IO6个PMN-细胞/ml HBSS-gel在缓慢摇动下在37°C孵育。以零到60分钟的时间间隔，取出这种悬浮液的样品，在250 X g离心4分钟，通过cfu计数来测定上清液中细菌的数量。吞噬作用表示为细胞外细菌的百分比数量的三次测定的平均值土SD。使用非参数的Mann-Whitney U测试进行统计分析。对于所有的比较，< 0. 05的P值被认为是统计学上显著的。值表示为平均值土SD。图5中显示的结果展现了，不管根据本发明的抗体的存在，S. aureus被多形核白细胞吞噬。然而，伴有根据本发明的抗体，与对照相比，吞噬作用过程显著地加快了。抗体作为多形核白细胞的S. aureus吞噬作用的调理素起作用。为了测定单克隆抗体MAB-UK-66对IsaA的亲和性，这些抗体与固定的IsaA的结合的动力学通过利用 BIAC0RE 2000 系统(GE Healthcare Europe GmbH, MunzingerStrasse 5,79111 Freiburg, Germany)测量无标记物表面胞质团共振的方式来测定。对于抗原I saA的固定，通过与等摩尔浓度的硫代-NHS-LC-生物素(Thermo Fi sherScientific, p/a Perbio Science, Adenauerallee 113,53113 Bonn, Germany)孵育来使IsaA N-生物素化。在这些条件下，大部分分子仅在单个位点被生物素化，单克隆抗体MAB-UK-66识别的大部分表位保留不受影响。抗原对生物传感器CM5芯片的链霉抗生物素蛋白包被的基质的固定如 Nickel, J.，Kotzsch, A.，Sebald, ff.，and Mueller, T. D. " Asingle residue of GDF-5 defines binding specificity to BMP receptor IB〃 J. Mol.Biol. (2005)，349，933到947页中描述的进行。通过BIAC0RE : 2000系统测量的，固定的抗原的数量相应于约100个共振单元[RU]。
使用HBS150 缓冲液(IOmM HEPES pH7. 4，150mM NaCl，3. 4mM EDTA)进行相互作用分析。在25°C下以10 μ I/分钟的流速记录sensorgrams。缔合和解离时间设置为10分钟。在每个循环后用不同的再生溶液(A lmM CH3COOH, IM NaCl, pH 3 ；B 4M MgCl2 ；C lmMCH3COOH, IM NaCl，6M尿素，pH 3)2分钟来再生芯片。这些抗体与固定的IsaA的结合的动力学在图6中示出。使用Biaevaluation软件2. 2. 4计算所有明显的结合亲和性。通过将动力学数据km和Iitxff拟合到I : ILangmuir结合模型来计算相互作用亲和性km( < IO6M-1S-1)和让。 (< KT2iT1)。这样，测定了解离常数KD。解离常数Kd表明两相互作用的分子(例如，抗体和相应的抗原)之间的亲和性。低Kd值表明高亲和性，而高Kd值表明低亲和性。这样测定的Kd值的标准偏差低于50%。超过两倍因数的结合亲和性的差异因而被认为是显著的。在如上所述的测量条件下，由于不可评估的缓慢off速率，MAB-UK-66抗体与 29kDa IsaA抗原不可逆地相互作用。由于动力学速率常数的评估限于10_5秒―1，观察到的off速率必定小于该值。通过将off速率设置到10_5秒―1，on速率可以被测定为5. 6 IO5M^1秒'产生I. 8 1(ΓηΜ的解离常数值。因而，这种相互作用的Kd值是彡1.8 1(ΓηΜ。重要地，使用如上所述的所有再生溶液，在与抗原相互作用之后，抗体不能从芯片表面上除去。这表明非常强的和高度特异性的相互作用。为了确认单克隆抗体MAB-UK-66对IsaA的高度亲和性，IsaA与固定的抗体的结合的动力学通过利用BIAC0RE 2000系统(GE HealthcareEurope GmbH, Munzinger Strasse 5,79111 Freiburg, Germany)测量无标记物表面胞质团共振的方式来确认。抗体MAB-UK-66的可逆的固定根据厂家的说明书(Mouse AntibodyCapture Kit, GE Healthcare)利用抗小鼠Fe抗体以高密度共价(18700共振单位RU)偶联到CM5传感器表面进行。在抗小鼠Fe表面上捕获的抗体MAB-UK-66的平均数量相应于约640RU。空白的抗小鼠Fe表面被用作对照表面，用于监视非特异性结合和进行参考减法。利用 HBS-EP 缓冲液(IOmM HEPES pH 7. 4，150mM NaCl,3mM EDTA,0. 005% Tween 20)进行相互作用分析。在251€以3(^1/分钟的流速记录sensorgrams。缔合和解离时间分别设置为3和15分钟。抗-Fe捕获表面在每个循环后利用IOmM甘氨酸pH I. 7的短脉冲来再生。IsaA与固定的单克隆抗体MAB-UK-66的结合的动力学在图7中示出。亲和性和缔合速率常数(kj和解离的速率常数(Iitjff)使用BIAevaluation软件4. 0. I,将获得的sensorgrams拟合到I : I Langmuir结合模型来计算。这样,在两种独立的测量中测定了解离常数Kd为I. 7nM。MAB-UK-66与IsaA之间相互作用的缔合和解离的速率常数分别测定为是I. 8 IO5MiT1 (kj和2. 9 KT4iT1 (koff)。在如上所述的测量条件下，MAB-UK-66与29kDa IsaA抗原以高亲和性和缓慢的off速速率相互作用，确认了已经通过MAB-UK-66抗体与固定的IsaA的结合所测定的强的和高度特异性的相互作用。为了表征被根据本发明的抗体或片段识别的IsaA的表位，进行了表位作图。为此，合成了长度15个氨基酸的寡肽。每个寡核苷酸的序列与IsaA的15个氨基酸的序列相同。每个寡核苷酸与代表总序列的随后部分的寡核苷酸有11个氨基酸的重叠。寡核苷酸的序列是序列表的序列SEQ ID NO 9到64。每种寡核苷酸固定在玻璃载片的小点上。通过荧光标记的次级抗体的结合以及检测荧光强度，杂交瘤细胞系DSM ACC2987分泌的单克隆抗体以及对照抗体与这些点的结合在孵育时进行检查。结果在下表中示出
权利要求
1.指向金黄葡萄球菌表位的抗体或其片段，所述金黄葡萄球菌表位被由杂交瘤细胞系分泌的进ー步单克隆抗体识别，所述杂交瘤细胞系以保藏登记号DSM ACC2987或DSMACC2988保藏在DSMZ中。
2.如权利要求I所述的抗体或其片段，其中，所述抗体是单克隆抗体，特别是进ー步单克隆抗体。
3.如权利要求2所述的抗体或其片段，其中，所述单克隆抗体或所述进ー步单克隆抗体是IgG型的抗体，特别地是IgGl型或IgG2b型的抗体。
4.如前述权利要求的任一项所述的抗体或其片段，其中，所述片段是Fab片段、Fab/c片段、Fv片段、Fab'片段或F(ab' )2片段。
5.如前述权利要求的任一项所述的抗体或其片段，其中，所述抗体是动物抗体，特别是鼠、牛或骆驼抗体，人抗体，在植物、卵或真菌，特别是酵母菌中产生的抗体，在细胞系的细胞中产生的重组抗体，嵌合抗体，或人源化抗体。
6.如前述权利要求的任一项所述的抗体或其片段，其中，每种抗体具有带有第一可变区的重链和带有第二可变区的轻链，其中所述杂交瘤细胞系是DSM ACC2987，以及其中所述第一可变区包含与序列SEQ ID NO :2至少90%相同的、特别地至少92. 5%相同的、特别地至少95%相同的、特别地至少97. 5%相同的、特别地100%相同的氨基酸序列，以及其中所述第二可变区包含与序列SEQ ID NO :4至少90%相同的、特别地至少92. 5%相同的、特别地至少95%相同的、特别地至少97. 5%相同的、特别地100%相同的氨基酸序列，或其中所述杂交瘤细胞系是DSM ACC2988，以及其中所述第一可变区包含与序列SEQ ID NO 6至少90%相同的、特别地至少92. 5%相同的、特别地至少95%相同的、特别地至少97. 5%相同的、特别地100%相同的氨基酸序列，以及其中所述第二可变区包含与序列SEQ ID NO:8至少90%相同的、特别地至少92. 5%相同的、特别地至少95%相同的、特别地至少97. 5%相同的、特别地100%相同的氨基酸序列。
7.如前述权利要求的任一项所述的抗体或其片段，其中，所述杂交瘤细胞系是DSMACC2987，其中所述表位包含至少ー个氨基酸序列，所述氨基酸序列与序列SEQ ID NO:15、17到19、21到26、32到34和57之一至少10个、特别地至少11个、特别地至少12个、特别地至少13个、特别地至少14个、特别地至少15个氨基酸是相同的。
8.如前述权利要求的任一项所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段用作药物。
9.如权利要求8所述的抗体或其片段，其中，所述药物是用于治疗人或动物的药物，所述人或动物患有金黄葡萄球菌的感染，特别是耐甲氧西林或甲氧西林敏感性金黄葡萄球菌的感染，或处于得到这样的感染的风险中。
10.如权利要求9所述的抗体或其片段，其中，所述人类或所述动物患有由感染引起的乳腺炎或脓毒症。
11.如权利要求8 10任一项所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或片段存在干与其他抗体或这些其他抗体的片段的混合物中，所述其他抗体指向金黄葡萄球菌的至少ー种进ー步表位。
12.如权利要求8 11任一项所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或片段存在干与至少ー种抗生素的混合物中。
13.如权利要求8 12任一项所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或片段存在于与哺乳动物、特别是人的血液的血浆的混合物中。
14.如权利要求8 13任一项所述的抗体或其片段，其中，所述药物是应用于全身性和/或局部的药物。
15.如含有权利要求I 7任一项所述的抗体或其片段的试剂盒，试剂盒用于检测金黄葡萄球菌。
16.—种用于检测金黄葡萄球菌的如权利要求I 7任一项所述的抗体或其片段的用途。
17.产生如权利要求I 7任一项所述的抗体的杂交瘤细胞系。
18.如权利要求17中所述的杂交瘤细胞系，其中，所述杂交瘤细胞系是以保藏登记号DSM ACC2987 或 DSM ACC2988 保藏在 DSMZ 的细胞系。
19.一种治疗人或动物的方法，所述人或动物患有金黄葡萄球菌，特别是耐甲氧西林或甲氧西林敏感性金黄葡萄球菌的感染，或处于获得这样的感染的风险中，其中权利要求I到7中任一项所述的抗体或其片段被施用给所述人或所述动物。
20.如权利要求19所述的方法，其中，所述人或动物患有由感染引起的乳腺炎或脓毒症。
21.如权利要求19或20所述的方法，其中，所述抗体或其片段存在干与其他抗体或这些其他抗体的片段的混合物中，所述其他抗体指向金黄葡萄球菌的至少ー种进ー步表位。
22.如权利要求19 21任一项所述的方法，其中，在施用之前，所述抗体或其片段与哺乳动物，特别是人的血液的血浆混合。
23.如权利要求19 22任一项所述的方法，其中，所述抗体或其片段全身地，特别是静脉内地、鼻腔地或舌下地施用。
24.如权利要求19 23任一项所述的方法，其中，所述抗体或其片段与至少ー种抗生素一起施用。
全文摘要
本发明涉及指向金黄葡萄球菌表位的抗体或其片段。
文档编号C07K16/12GK102695724SQ201080021810
公开日2012年9月26日 申请日期2010年5月18日 优先权日2009年5月18日
发明者乌多·洛伦茨, 克努特·奥尔森 申请人:维尔茨堡尤利乌斯·马克西米利安大学