专利名称：壳聚糖新城疫疫苗纳米粒的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种壳聚糖新城疫疫苗纳 米粒的制备方法。
背景技术：
新城疫(Newcastle disease, ND)是由新城疫病毒 (Newcastle disease virus, NDV)引起的鸡和火鸡的一种急性、高度接触性、致死性传染病，常呈败血症，是危害养禽业的最重要传染病之一，被国际兽医局定为I类传染病。控制ND最根本的措施是进行有效的疫苗接种，目前常用的疫苗是弱毒活疫苗和灭活疫苗，但二者在实际应用中均存在一定的局限性。ND油乳剂灭活疫苗通过注射免疫鸡体后可产生较高水平的血液循环抗体，但在抵抗呼吸道和消化道病原感染的黏膜系统中却有局限性，很难阻止病原通过黏膜组织侵入动物体内，且对已经进入细胞的病毒很难发挥作用；ND弱毒活疫苗虽然可以产生一定的黏膜免疫和体液免疫，但受免疫方法和途径影响，产生的循环抗体较低，维持期短。饮水免疫很容易造成疫苗被消化道降解，导致疫苗吸收效率低；滴鼻点眼也只能使疫苗在鼻腔内存在 15min，致使疫苗不能有效进入机体激发有效的黏膜免疫；气雾免疫产生的黏膜免疫效果较好，但容易诱导慢性呼吸道疫病，且弱毒苗均不能产生较高的血清抗体等。因此，如何提高新城疫疫苗的免疫效果，研制出既能产生较强的体液免疫抗体又能产生高效的局部黏膜免疫的新型疫苗已成为ND疫苗研究的焦点。近年来随着新型材料学和制剂新技术的发展，迫切需要一种新的疫苗递送方法以降低传染病的死亡率。目前，国内外尚未有利用NDV进行纳米疫苗研究的报道。
发明内容
本发明提供一种壳聚糖新城疫疫苗纳米粒的制备方法。本发明壳聚糖新城疫疫苗纳米粒的制备方法，按以下步骤进行一、将壳聚糖分散于灭菌的蒸馏水中，在磁力搅拌下，加入体积浓度为36%乙酸，继续搅拌5 15min，用 0. 22 μ m滤器过滤，静置至气泡消去，即得到壳聚糖溶液；二、取5mL步骤一制备的壳聚糖溶液，向其中滴加2 3mL病毒含量为IO8 5EID5tl的新城疫L-系病毒液，搅拌混合均勻后，再滴加2 3mL浓度为1. Omg/mL的交联剂三聚磷酸钠，然后在常温、无菌条件下于1000 1400r/min磁力搅拌10 15min，得溶液A ；三、将溶液A于4°C、10000 15000r/min离心 30 40min，取沉淀，将沉淀经无菌水洗3 5次，然后真空冷冻干燥22 25h，即得到壳聚糖新城疫疫苗纳米粒(NDV-CS-NPs)；其中步骤一中壳聚糖的质量与蒸馏水的体积比为 Ig 900 920mL，步骤一中壳聚糖的质量与乙酸的体积比为Ig 80 85mL。本发明壳聚糖新城疫疫苗纳米粒具有巨大的应用潜力，本发明制备的壳聚糖新城疫疫苗纳米粒(NDV-CS-NPs)与传统疫苗相比，其优势在于稳定性强、释药时间长；同时，在保证药物作用的前提下，减少了给药剂量、减轻或避免了毒副反应、可延长免疫保护期，避免了多次反复给药，且载体材料壳聚糖本身无毒，生物相容性好，可生物降解，可通过体内的水解或酶解反应，最终降解为水和CO2，被人体吸收或排出体外，因而是一种具有广阔应用前景的新型载体疫苗。本发明制备的壳聚糖纳米粒疫苗的免疫途径不受限制，可肌注、点目艮，也可口服，且能提高机体免疫力，延长药物在体内作用时间，减少给药次数。另外，本发明也为新城疫疫苗在临床上广泛应用提供了一个免疫效果好和安全性能高的递药系统；在此基础上可将该研究成果应用到更多的动物疫苗和药物体系中，促进疫苗的在畜牧业和临床的实际应用。经透射电子显微镜观察本发明制备的NDV-CS-NPs形态规则、外形圆整、表面光滑、分散性好，无明显粘连、破损、塌陷等现象(如图1所示)，NDV-CS-NPs粒径为147. 72 594. 4nm,平均粒径为371. Inm,粒径分布较窄，Zeta电位为+2. 84mV。本发明制备的 NDV-CS-NPs经黏膜免疫能显著增强T细胞的免疫效果，产生较强的体液免疫和局部的黏膜免疫，且与La Sota活疫苗组相比，NDV-CS-NPs组抗体水平持续时间明显延长，NDV-CS-NPs 在鸡体内起到了缓释作用；同时克服了常规疫苗在储存和运输过程中易失活等缺点，且用本发明方法所制备处的NDV-CS-NPs易于保存，稳定性高、包封率高、毒性小、药物生物利用度高、成本低、易于工业化生产。使用本发明方法制备的DNA疫苗纳米粒在保证DNA疫苗稳定性的条件下具有较高的包封率，包封率为74. O士3.7%，可以保持体内最佳的药物浓度，并且延长药物作用的时间。因此，本发明方法制备的DNA疫苗纳米粒可实现药物的缓释。本发明方法具有工艺简便、制备成本低、工艺重现性好、样品需要量少，较好保持了 ND病毒结构蛋白的抗原性等优点，试验筛选的NDV-CS-NPs制备方法也可放大到生产应用，因而对产业化的应用具有指导意义。本发明制备的NDV-CS-NPs中病毒含量为108_5EID5(1/0. lmL，符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》中新城疫低毒力活疫苗制苗用毒液标准。NDV-CS-NPs可用于鸡新城疫免疫，经口服给药，给药量为每只鸡0. 25mL
图1为本发明NDV-CS-NPs的透射电子显微镜观察图；图2为具体实施方式
一制备的NDV-CS-NPs的粒径分布图；图3为具体实施方式
一制备的NDV-CS-NPs的Zeta电位图； 图4为具体实施方式
一中通过Western-blotting分析比较包裹前后纳米粒中NDV体外免疫原性图；其中M为蛋白marker，1为NDV原液，2为从纳米粒中回收的NDV。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式壳聚糖新城疫疫苗纳米粒的制备方法，按以下步骤进行一、将壳聚糖分散于灭菌的蒸馏水中，在磁力搅拌下，加入体积浓度为36%乙酸，继续搅拌5 15min，用0. 22 μ m滤器过滤，静置至气泡消去，即得到壳聚糖溶液；二、取5mL步骤一制备的壳聚糖溶液，向其中滴加2 3mL病毒含量为108_ 5EID5tl的新城疫 L-系病毒液， 搅拌混合均勻后，再滴加2 3mL浓度为1. Omg/mL的交联剂三聚磷酸钠(TPP)，然后在常温、无菌条件下于1000 1400r/min磁力搅拌10 15min，得溶液A ；三、将溶液A于4°C、 10000 15000r/min离心30 40min，取沉淀，将沉淀经无菌水洗3 5次，然后真空冷冻干燥22 25h，即得到壳聚糖新城疫疫苗纳米粒；其中步骤一中壳聚糖的质量与蒸馏水的体积比为Ig 900 920mL，步骤一中壳聚糖的质量与乙酸的体积比为Ig 80 85mL。本实施方式步骤二所述新城疫L-系病毒液中病毒为La Sota株。
本实施方式制备的壳聚糖新城疫疫苗纳米粒(NDV-CS-NPs)在_20°C条件下可保存3个月，经透射电镜观察，本实施方式方法制备的NDV-CS-NPs粒径为147. 72 594. 4nm, 平均粒径为371. Inm(如图2所示)，粒径分布较窄，Zeta电位为+2. 84mV(如图3所示)。取5mL本实施方式制备的NDV-CS-NPs溶液在4°C、13000r/min条件下离心lOmin， 取上清液，记录体积后，采用考马斯亮蓝法(CBB法)测定上清中游离病毒蛋白浓度，计算 NDV-CS-NPs 包封率EE(%) = [(Wtl-W1)/W。] X 100%，其中W。为加入的总病毒中的蛋白总量A为上清中游离的病毒中的蛋白总量。本实施方式制备的NDV-CS-NPs的包封率为74. O士3. 7%。本实施方式制备的NDV-CS-NPs中病毒含量测定通过测定鸡胚半数感染量(EID5tl)来计算病毒含量。取冻干NDV-CS-NPs 100 μ g， 加入至IOmL pH7. 2的PBS缓冲液中，再加入2mL质量浓度为0. 25%的胰酶，置2 8°C冰箱处理72h。之后，以2000r/min离心5min，取上清液用灭菌生理盐水做10倍系列稀释， 取10-6、10_7、10-8三个稀释度，分别接种10日龄SPF鸡胚5个，置37°C孵化器继续孵化，弃去24h内死亡的鸡胚，此后每6h照蛋一次，及时将死亡鸡胚取出置2 8°C保存，至120h 将鸡胚全部取出，逐个检测鸡胚尿囊液的HA效价，HA ^ 71og2判为阳性。按Reed-Muench 法计算EID5tlt5同时，设未接种的10日龄SPF鸡胚5个做空白对照。结果是本发明制备的 NDV-CS-NPs中病毒含量为IO8 5EID5tlA). ImL(如表1所示)，符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》中新城疫低毒力活疫苗制苗用毒液标准。表1病毒含量测定结果
权利要求
1.壳聚糖新城疫疫苗纳米粒的制备方法，其特征在于壳聚糖新城疫疫苗纳米粒的制备方法，按以下步骤进行一、将壳聚糖分散于灭菌的蒸馏水中，在磁力搅拌下，加入体积浓度为36 %乙酸，继续搅拌5 15min，用0. 22 μ m滤器过滤，静置至气泡消去，即得到壳聚糖溶液；二、取5mL步骤一制备的壳聚糖溶液，向其中滴加2 3mL病毒含量为108_5EID5tl的新城疫L-系病毒液，搅拌混合均勻后，再滴加2 3mL浓度为1. Omg/mL的交联剂三聚磷酸钠， 然后在常温、无菌条件下于1000 1400r/min磁力搅拌10 15min，得溶液A ；三、将溶液A 于4°C、10000 15000r/min离心30 40min，取沉淀，将沉淀经无菌水洗3 5次，然后真空冷冻干燥22 25h，即得到壳聚糖新城疫疫苗纳米粒；其中步骤一中壳聚糖的质量与蒸馏水的体积比为Ig 900 920mL，步骤一中壳聚糖的质量与乙酸的体积比为Ig 80 85mL。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖新城疫疫苗纳米粒的制备方法，其特征在于步骤一中壳聚糖的质量与蒸馏水的体积比为Ig 917mL。
3.根据权利要求1或2所述的壳聚糖新城疫疫苗纳米粒的制备方法，其特征在于步骤一中壳聚糖的质量与乙酸的体积比为Ig 83mL。
4.根据权利要求3所述的壳聚糖新城疫疫苗纳米粒的制备方法，其特征在于步骤二中取5mL步骤一制备的壳聚糖溶液，向其中滴加2. 5mL病毒含量为108_5EID5tl的新城疫L-系病毒液。
5.根据权利要求4所述的壳聚糖新城疫疫苗纳米粒的制备方法，其特征在于步骤二中滴加2. 5mL浓度为1. Omg/mL的交联剂三聚磷酸钠。
6.根据权利要求5所述的壳聚糖新城疫疫苗纳米粒的制备方法，其特征在于步骤二中于UOOr/min磁力搅拌lOmin。
7.根据权利要求6所述的壳聚糖新城疫疫苗纳米粒的制备方法，其特征在于步骤三中于 40C、13000r/min 离心 30min。
全文摘要
壳聚糖新城疫疫苗纳米粒的制备方法，涉及一种壳聚糖新城疫疫苗纳米粒的制备方法。方法一、将壳聚糖分散于灭菌的蒸馏水中，在磁力搅拌下，加入乙酸搅拌，过滤，静置至气泡消去，即得到壳聚糖溶液；二、取壳聚糖溶液，向其中滴加新城疫L-系病毒液，搅拌混合均匀后，再滴加交联剂，然后在常温、无菌条件下搅拌得溶液A；三、将溶液A离心取沉淀，将沉淀经无菌水洗涤，然后真空冷冻干燥，即得到壳聚糖新城疫疫苗纳米粒。本发明的疫苗纳米粒稳定性强、释药时间长，在保证药物作用的前提下，减少了给药剂量、减轻或避免了毒副反应、可延长免疫保护期。
文档编号A61P31/14GK102327228SQ20111028879
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月26日 优先权日2011年9月26日
发明者赵凯 申请人:黑龙江大学