一种以壳聚糖为母体的纳米基因复合物以及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种以壳聚糖为母体的纳米基因复合物以及制备方法。
【背景技术】
[0002]从基因的角度对肿瘤进行治疗成为目前肿瘤研宄的热点。RNA干扰技术(RNAi)作为一种新兴的基因阻断技术，在后基因组时代的功能基因研宄和特异性基因治疗中具有广阔的应用前景。这个转录后的基因沉默过程可以由短小干扰RNA(SiRNA)诱发。利用RNA干扰技术沉默致病基因，可实现快速、高效、特异的基因治疗，为肿瘤的基因治疗提供了具有潜力的新手段。近年来，RNA干扰技术用于肝癌治疗的研宄越来越多，有望为肝癌的诊断和治疗提供新的措施。
[0003]基因治疗包括RNAi技术等都需要将外源的基因导入目的细胞并且高效表达，从而达到治疗的目的。理想的基因转运系统应该具有良好的靶向性和生物安全性、较好的稳定性、较高的基因转染效率及生物可降解性。目前，基因载体主要包括病毒型基因载体和非病毒型基因载体两大类。病毒型载体由于生物安全性等问题，限制了其应用。非病毒型载体，比如纳米载体，逐渐成为了基因治疗的研宄重点。纳米载体可以提高所包载的寡核苷酸或DNA的稳定性，使被包裹的寡核苷酸免受核酸酶的降解。纳米颗粒子体积小，能够随血液参与血液循环，从而较容易透过细胞屏障进入生物机体的细胞，能够高效介导DNA转染，并使其在细胞内高水平和长时间表达，为功能基因的研宄和疾病的基因治疗提供了新的技术和手段。
[0004]壳聚糖(chitosan，CS)是一种来源于海洋生物的天然高分子多糖，具有良好的生物安全性，生物可降解性，在组织工程支架材料、药物缓释载体材料等领域具有广泛应用。其分子结构中的氨基带有正电荷，可以与带负电荷的核酸通过静电相互作用形成复合物，使DNA被压缩为结构相对致密的纳米级粒子。但是壳聚糖作为基因载体的主要问题之一是壳聚糖的转染效率较低。因此近年来很多研宄者在壳聚糖上接枝一些如蛋白质或多肽的聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)之类的特征性基团，增强基因的稳定性、构建长循环并增加其靶向性等。改性壳聚糖纳米载体已成为基因传递中一种主要的载体材料。目前国内外关于壳聚糖纳米基因运载系统的研宄已有较多报到。
【发明内容】
[0005]本发明旨在解决现有技术中的问题。
[0006]为了解决上述问题，本发明采取的技术方案如下:
[0007]本发明提供一种以壳聚糖为母体的纳米基因复合物，壳聚糖分子经化学修饰引入聚乙二醇和半乳糖基配体合成mPEG-Gal-CS，所述mPEG-Gal-CS的纳米颗粒与质粒复合而制备出所述以壳聚糖为母体的纳米基因复合物。
[0008]本发明还提供一种所述的以壳聚糖为母体的纳米基因复合物的方法，所述方法包括以下步骤:
[0009]步骤一:制备mPEG-Gal-CS纳米颗粒:取冰乙酸加入四蒸水中，混勾制成醋酸溶液；取CS粉末溶于所述醋酸溶液中制成CS溶液；用NaOH溶液调节所述CS的pH ;称取TPP粉末加入四蒸水中制成TPP溶液；取两只烧杯盛放所述CS溶液，向所述CS溶液中缓慢滴加所述TPP溶液，直至出现乳光现象为止，然后将出现所述乳光现象的溶液在磁力搅拌器上搅拌；
[0010]步骤二:制备出以壳聚糖为母体的纳米基因复合物:先使所述mPEG-Gal-CS纳米颗粒与所述质粒pEGFP-Nl混勾，然后使混勾的所述mPEG-Gal-CS纳米颗粒与所述质粒pEGFP-Nl在一定温度下保温一定时间，或者先将所述mPEG-Gal-CS纳米颗粒与所述质粒pEGFP-Nl分别在一定温度下保温一定时间，然后将在所述温度下保温所述时间后的所述mPEG-Gal-CS纳米颗粒与所述质粒pEGFP-Nl混匀。
[0011]本发明还提供一种所述的以壳聚糖为母体的纳米基因复合物的方法，本方法包括以下步骤:
[0012]步骤一 AljgmPEG-Gal-CS纳米颗粒:取冰乙酸加入四蒸水中，混勾制成的醋酸溶液；称取CS粉末溶于所述醋酸溶液中制成的CS溶液；称取TPP粉末加入四蒸水中制成TPP溶液；取两只干净的烧杯盛放所述CS溶液，向所述CS溶液中缓慢滴加所述TPP溶液，直至出现乳光现象为止，然后将出现所述乳光现象的溶液在超声仪中超声处理；
[0013]步骤二:制备出以壳聚糖为母体的纳米基因复合物:先使所述mPEG-Gal-CS纳米颗粒与所述质粒pEGFP-Nl混勾，然后使混勾的所述mPEG-Gal-CS纳米颗粒与所述质粒pEGFP-Nl在一定温度下保温一定时间，或者先将所述mPEG-Gal-CS纳米颗粒与所述质粒pEGFP-Nl分别在一定温度下保温一定时间，然后将在所述温度下保温所述时间后的所述mPEG-Gal-CS纳米颗粒与所述质粒pEGFP-Nl混匀。
[0014]进一步的，所述TPP溶液的浓度为0.5?2g/L，所述pH为3?5，所述所述醋酸溶液的体积分数为2%，并且所述CS溶液的浓度为2g/L。
[0015]本发明的有益效果在于，本发明通过化学修饰，在壳聚糖(chitosan，CS)分子中引入PEG和半乳糖(Galactose，Gal)基配体，增加壳聚糖的水溶性、缓释性和肝靶向性，提高基因转染效率，从而获得一种高效、缓释、肝靶向的基因载体系统。
【附图说明】
[0016]图1所示为根据本发明的mPEG-Gal-CS纳米颗粒红外光谱结构表征图；
[0017]图2A与图2B示意性示出不同pH、不同TPP浓度对mPEG-Gal-CS纳米颗粒粒径的影响；
[0018]图3示出根据不同复合方法的mPEG-Gal-CS纳米颗粒与质粒复合物的凝胶电泳结果;
[0019]图4示出不同pH下mPEG-Gal-CS纳米颗粒与质粒复合物的凝胶电泳结果；
[0020]图5示出根据不同体积比的mPEG-Gal-CS纳米颗粒与质粒复合物的凝胶电泳结果;
[0021]图6示出mPEG-Gal-CS纳米颗粒与质粒复合物的DnaseI抗性实验的凝胶电泳结果；
[0022]图7A与图7B示出mPEG-Gal-CS纳米颗粒与质粒复合物的血清稳定性试验的凝胶电泳结果。
【具体实施方式】
[0023]下文将结合具体实施例详细描述本发明。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。
[0024]以下将结合附图详细描述本发明。
[0025]mPEG-Gal-CS 的合成
[0026]通过化学修饰，在壳聚糖(chitosan，CS)分子中引入聚乙二醇(polyethyleneglycol, PEG)和半乳糖(Galactose，Gal)基配体合成mPEG-Gal-CS，用于纳米颗粒的制备。
[0027]Gal-CS的制备:壳多糖通过活性醋中间体在1_乙基_3_ (3_ 二甲氛基丙基)_碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的催化下与乳糖酸(LA)进行在CS分子上接枝Gal基团的反应。CS(130mg)溶解于40ml of0.6% (v/v)醋酸溶液中。具体操作如下:将LA(260mg)溶解于1ml蒸馏水中，加入NHS (120mg)/EDC (280mg)以活化LA的羧基基团。然后将活化的LA溶液加入至上述CS溶液中，室温搅拌反应72hr。反应结束后，将反应液用透析袋(MWC0 = 8000)进行透析72hr，期间经常更换蒸馏水。最后将透析液进行冷冻干燥，获得纯化的Gal-CS，用红外光谱进行结构鉴定。
[0028]mPEG-Gal-CS的制备:首先通过DMSO/醋酸酐氧化mPEG法制备单甲氧基聚乙二醇醛(mPEG-CHO)，然后将mPEG_CH0和Gal-CS以一定摩尔比例加入到少量的双蒸水中，在氮气氛围中搅拌混匀，溶液粘稠浑浊，然后向其中加入2%的乙酸，溶液呈淡黄色，再加入甲醇(乙酸/甲醇=2/lv/v)后反应体系变成白色浑浊粘稠状并有大量气泡产生，测pH值为3，于室温下氮气保护搅拌反应40min至溶液变澄清，此后用lmol/L的NaOH调pH至4.6?5.6后，将适量的NaCNBH3溶于5ml双蒸水中逐滴缓慢加入到反应体系中(NaCNBH3/mPEG的摩尔比例为20/1)，室温下搅拌反应22hr。反应结束后，将反应液透析干燥，获得纯化的mPEG-Gal-CS，用红外光谱进行结构鉴定。
[0029]在图1中，横轴表示波数(cnT1)，纵轴表示透射率(％ )。如图1所示，比较CS与Gal-CS可以发现大概在CS的1630cm-l的位置处为-NH2的剪刀振动吸收峰而在Gal-CS的红外光谱中发现该波长处无吸收峰，说明-NH2收到了破坏，而在1400cm-l，IlOOcm-1的位置处波长明显尖锐，是因为Gal接枝到CS上，引入了 -OH的缘故。再看mPEG-CHO的红外图谱，在3500cm的位置处出现了宽而平坦的吸收峰，是因为-OH存在的而且形成氢键的缘故，在2820cm，2735cm的位置处为-CHO的伸缩振动吸收峰。在1727cm的位置处为C = O的伸缩振动吸收峰，1390cm处为CHO的弯曲振动吸收峰。这几处吸收峰的存在均能证明mPEG已经被醛基化了。比较Gal-CS与mPEG-Gal-CS可以发现在mPEG-Gal-CS的红外图谱上在以上描述的3500cm，2820cm，2735cm，1727cm的位置处均出现了 -CHO的特征吸收峰。由此判断mPEG-CHO已经成功接枝到Gal-CS上，从而形成了 mPEG-Gal-CS纳米颗粒。
[0030]mPEG-Gal-CS纳米颗粒的制备
[0031](l)mPEG-Gal-CS纳米颗粒的制备方法
[0032]①配制溶液:用量桶量取2ml的冰乙酸加入98ml的四蒸水中，混匀制成体积分数为2%的醋酸(HAC)溶液；称取0.04g的mPEG-Gal-CS粉末溶于2% HAC溶液中制成2g/L的CS溶液，用lmol/L的NaOH溶液将配制好CS溶液调节成不同pH的溶液，非别为3.0和5.0 ;称取0.5g的TPP粉末加入500ml的四蒸水制成lg/L的多聚磷酸钠(TPP)溶液。
[0033]②取两只刷洗干净的50ml的烧杯盛放壳聚糖溶液，向壳聚糖溶液中缓慢滴加TPP溶液，直至出现乳光现象为止；两杯壳聚糖溶液中的一者在磁力搅拌器上搅拌15min(磁力搅拌法)。另外一者放在超声仪中超声处理15min (超声波法)。
[0034]③分别取出经步骤2处理过的壳聚糖溶液进行粒径测定。
[0035](2)不同pH、不同TPP浓度对mPEG-Gal-CS纳米颗粒粒径的影响
[0036]如图2A中所示，在pH为3.0的情况下，浓度分别为0.5g/L、lg/L与2g/L的TPP溶液对应的磁力搅拌法制备的mPEG-Gal-CS纳米颗粒粒径分别为约270mm、440mm与560mm ；在pH为5.0的情况下，浓度分别为0.5g/L、lg/L与2g/L的TPP溶液对应的磁力搅拌法制备的mPEG-Gal-CS纳米颗粒粒径分别为约200mm、190mm与350mm。
[0037]如图2B中所示，在pH为3.0的情况下，浓度分别为0.5g/L、lg/L与2g/L的TPP溶液对应的超声