专利名称：一种检测新城疫病毒的荧光抗体的制备方法及固相免疫荧光检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测新城疫病毒的荧光抗体的制备方法及固相免疫荧光检测试 剂盒，属于免疫荧光检测领域。
背景技术：
新城疫是严重危害养殖业的烈性传染病，被国际兽医局列为A类动物传染病，同 时它还是人兽共患病，威胁人类的公共卫生安全。新城疫病毒检测是禽类及其动物性制品 出入境检验检疫的必检项目，国际兽医局要求禽类及其动物制品中一旦检出新城疫病毒必 须就地销毁。快速、灵敏的检测方法对疫病的及时确诊、疫情的有效防控及预测、预警至关 重要。目前新城疫的检测方法主要有(1)病毒分离鉴定；(2)血清学检测，如HA-HI等；(3) 分子生物学检测，如RT-PCR等。但是，上述检测方法各有优缺点，如病毒分离和血清学鉴定 耗时长，血清学检测需要发病初期和康复期双份血清，PCR检测灵敏度高，对实验条件和操 作者技术水平要求较高，常用的HA-HI法简便易行，但灵敏度低。免疫荧光检测法是一种历史悠久的标记分析方法，兼具抗原_抗体反应的特异性 和荧光检测的灵敏性，灵敏度高达10-6mg/mL，广泛应用于传染病诊断。免疫荧光检测法的 特异性和敏感性依赖于抗体的特异性、亲和力、滴度以及荧光染料的特性。荧光检测常受 血清和其他生物样品中本底荧光的影响。以血清为例，400-600nm波段的本底荧光与常用 的FITC的荧光发射光谱相重叠，干扰过大，影响检测结果；另一方面，传统的荧光染料(如 FITC等)具有毒性、易淬灭，上述因素造成长期以来免疫荧光分析方法相对落后于ELISA、 化学发光法等标记法。提高免疫荧光检测法灵敏度和特异性的途径有(1)寻找优秀的荧 光染料，如选用摩尔消光系数大、荧光量子产率高、斯托克位移大、发射红色荧光的染料； (2)结合使用单克隆抗体、抗体夹心法、抗体包被技术、微粒富集荧光免疫分析法等免疫学 技术；(3)采用固相检测法，如以惰性材料微球、96孔板等为固相载体。固相免疫荧光检 测法可用于检测可溶性抗原或抗体，常规的固相载体如尼龙膜、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素 膜、96孔板等通常具备较低的本底荧光，会干扰或降低荧光检测的灵敏度。本发明采用的固 相载体为一种微球，由琼脂糖经溴化氰活化制备，无本底荧光，由于球形载体的表面积大， 具有信号富集作用，能显著提高荧光检测的灵敏度。藻红蛋白是红藻细胞中的一类主要的水溶性的光合色素蛋白，能够发出明亮的桔 黄色荧光，与传统的荧光染料相比，藻红蛋白具有水溶性、无毒性、摩尔消光系数大、荧光量 子产率高、斯托克位移大、发射桔黄色荧光、背景光干扰小、不易淬灭等特点，是一类理想的 荧光染料。多管藻是我国沿海分布较广的野生海洋红藻，含有大量的典型的三峰型R-藻 红蛋白(R-phycoerythrin, RPE)，RPE的稳定态为(α β)6γ , RPE的组成和晶体结构特点 决定了其高稳定性。多管藻RPE的分子量约为240kDa，最大吸收波长分别位于498、540、 565nm,最大荧光发射峰位于575nm。1个多管藻RPE分子含有34个色基，摩尔消光系数为 24. 1 X IO5Cm-1M-1，荧光量子产率为82 %，1分子的藻红蛋白的荧光强度在可比波长内至少相
4当于30个FITC或100个罗丹明分子，藻红蛋白的斯托克位移高达75nm，且发射荧光位于近 红光区，因而背景光干扰小，有助于提高荧光检测的灵敏度，藻红蛋白荧光检测的灵敏度是 FITC的5-10倍。而传统的荧光染料(如FITC等)的斯托克位移小，发射荧光与激发光谱 部分重叠，生物质本底荧光干扰严重。藻红蛋白的发现和应用使免疫荧光检测法的灵敏度 显著提高。藻红蛋白优于传统的合成荧光染料，可取代FITC用于免疫荧光检测或配合FITC 使用实现单一激发光源下的双色荧光鉴别检测。RPE等荧光染料用于荧光检测时需与抗体等生物大分子交联成荧光抗体探针，蛋 白质交联时普遍存在难以定量控制的缺点，往往造成荧光标记物的得率低，标记物中混杂 有大量的未结合的荧光染料，导致标记物的生产成本居高不下，荧光检测灵敏度降低。而且 交联剂浓度多高还会导致荧光染料结构改变、蛋白活性损失甚至荧光丧失，同时交联剂浓 度过高还会影响抗体的免疫活性，因此选择适宜的交联剂种类、交联剂的浓度、交联方法等 直接影响荧光探针的质量，从而影响荧光检测的灵敏度。化学交联剂SPDP为异型双功能化 学交联剂，反应条件温和，引入的化学基团具有吸光性，利于交联过程的控制。通过控制适 宜的摩尔比进行RPE与抗体的液相交联，能使研制的荧光标记物交联得率大于90%，探针 的效率、质量显著提高，成本大幅降低，促进其用于疾病的免疫荧光检测。
发明内容
本发明涉及一种检测新城疫病毒的荧光抗体的制备方法及固相免疫荧光检测试剂盒。本发明设计的检测新城疫病毒的荧光抗体使用的多管藻R-藻红蛋白(RPE)为三 峰型藻红蛋白，在498nm处有强吸光性，最大荧光发射峰位于575nm，在蓝绿光激发下，RPE 能发射明亮的桔黄色荧光，因此多管藻RPE优于其它来源的三峰型和二峰型藻红蛋白，它 具有无毒性、水溶性大、荧光明亮且不易淬灭、稳定性高等优点，检测灵敏度显著高于传统 的荧光染料，是优秀的荧光染料。以异型双功能化学交联剂SPDP将RPE、抗体衍生后以适当 摩尔比液相交联，制备的RPE标记的荧光抗体交联效率高、纯度高、荧光明亮、抗体活性好、 稳定性好。本发明涉及的固相免疫荧光检测试剂盒使用的固相载体为一种微球，由琼脂糖经 溴化氰活化制备，冻干保存，微球直径为60-200um，无本底荧光，购自Amersia公司。该微 球载体在使用前需用ImM稀盐酸溶液溶胀30min，以同样浓度的盐酸冲洗多次，最后用50mM PH 8PBS(含IOOmM NaCl)快速冲洗得到活化凝胶。活化的微球应立即与抗体或抗原结合。本发明的解决方案如下RPE制备采用阴离子交换层析法从海洋红藻_多管藻中分离纯化。取冷冻保存 的多管藻，加入6倍体积的20mM醋酸缓冲液(pH5. 8)，4°C下溶胀24h，多层纱布过滤、挤压 获得褐色浸提液，浸提液中加入固体硫酸铵至浓度为60% (w/v)，4°C放置24h，离心收集沉 淀，将沉淀溶于20mM的醋酸缓冲液(pH5. 8)中，然后用20mM的醋酸缓冲液(pH5. 8)透析，透 析液阴离子交换纯化，DEAE Sepharose Fast Flow柱用20mM醋酸缓冲液(pH5. 8)(含50mM NaCl)预平衡，用20mM醋酸缓冲液(pH5. 8)冲洗掉阴离子交换柱上过量的样品和杂质，用 20mM醋酸缓冲液(pH4. 0)(含50mMNaCl) —步洗脱可得到大量纯的RPE，纯化的多管藻RPE 纯度达电泳纯，纯度指数A62tZA28tl >5. 2，结构式为(α 3)6[分子量约为2401^^，最大吸收峰分别位于498、540、565nm，室温荧光发射峰位于575nm，纯化的RPE硫酸铵沉淀4°C避光 保存，使用前用50mM pH7. 5PBS充分透析除盐，调整浓度为10mg/mL。新城疫病毒多克隆抗体制备新城疫病毒La Sota株IO4倍稀释，尿囊腔接种9-10 日龄SPF鸡胚，每胚0. 2mL，37-38°C孵育，收集接种24_120h的死胚、存活胚的尿囊液，红细 胞凝集试验检测滴度>1 256，无菌检验合格，以0.3%甲醛37°C灭活24h，按1 3比例 加入灭菌10号白油和吐温-80，用胶体磨乳化成油包水型油乳剂灭活疫苗。制备的新城疫 油乳剂灭活苗免疫4周龄SPF鸡，颈部皮下注射1. OmL/只，首免10天后相同剂量加强免疫 一次，二免1周后采血，测定血清中新城疫病毒HI抗体，当HI效价> 1 256时采集血清， 阴离子交换层析纯化得到抗新城疫病毒多克隆抗体，-20°C冷冻保存。RPE标记荧光抗体的制备利用异型双功能交联剂SPDP分别在RPE、抗体上衍生吡 啶二硫基团，然后用DTT还原抗体的衍生物引入游离-SH，将携带吡啶二硫基的RPE与携带 巯基的抗体按一定摩尔比交联制备荧光抗体。将SPDP按50-100 1的摩尔比分别与RPE、 抗体混勻，铝箔封好后于室温旋转反应2h，超滤离心除去多余的SPDP。取DTT按50-100 1 的摩尔比与抗体衍生物充分混勻，室温静置反应lh，超滤离心除去多余的DTT。抗体-HS与 RPE衍生物以摩尔比1 1混勻，铝箔封好后于20-25°C振荡反应20h。加NEM封闭多余巯 基，室温旋转反应60min。RPE标记的荧光抗体的纯化采用HPLC法，液相色谱工作站上进行。采用分子筛高 压液相色谱柱纯化，液相柱型号TSK G3000SW(规格7. 5mmX60cm)，流动相为50mM PBS pH 了^，流速化日！^/！！^！！，检测波长丨卯^。。!!!!!。荧光标记抗抗体最先被洗脱下来。收集第一个 洗脱峰，进行光谱学、抗体活性、电泳检测。目标产物的洗脱峰面积占所有洗脱峰面积的比 例即为交联效率。RPE标记荧光抗体的光谱检测吸收光谱在紫外_可见光分光光度计上测定，扫描 波长区间250-700nm。吸收光谱检测可判定交联是否成功及交联反应是否导致RPE变性。室 温荧光发射光谱在荧光分光光度计上测定，激发波长498nm，荧光扫描范围为520-700nm。 在紫外区，RPE标记荧光抗抗体的吸光度明显高于对照RPE，吸收峰位置相同，这是因为RPE 表面交联了抗体分子，而抗抗体在280nm有较强的光吸收；在400-700nm范围内，交联物的 吸收光谱与对照RPE的吸收峰及吸光度相似，是由于抗体在此范围内无光吸收。RPE标记光 抗体与对照RPE在498nm激发光的激发下，室温荧光发射波长均位于575nm，没有发生斯托 克位移的改变，仍具有RPE的特征荧光发射光谱，且荧光亮度无明显降低。RPE标记荧光抗体的效价检测抗体效价采用微量血凝抑制试验方法(HI)测定。 用灭活的对应新城疫尿囊毒制备4单位检测抗原，反应在V型96孔板上进行。以红细胞凝 集抑制的最高稀释度为荧光抗体的效价。荧光标记抗体的HI效价应 16，浓度低时可 通过离心超滤浓缩。RPE标记荧光抗体的电泳检测=SDS-PAGE在垂直板不连续电泳装置上进行，分离 胶浓度为12.5%，浓缩胶浓度为5 %，218V恒压电泳，考马斯亮蓝R-250染色，脱色后观察结 果。电泳发现RPE标记荧光抗体既具有RPE的α、β、γ亚基条带，又具有抗体的H、L链 条带，表明RPE与抗体交联成功。RPE标记荧光抗体的稳定性检测纯化的RPE标记荧光抗体中加入0. 02%叠氮 化钠，4°C避光保存，每隔30天测定-次荧光光谱和抗体效价，室温荧光发射光谱在荧光分光光度计上测定，抗体效价采用血凝抑制试验方法测定，观察荧光亮度和抗体活性的变化。 RPE标记的荧光抗体稳定性较好，在0. 05mol/L的磷酸缓冲液中4°C保存120天，荧光抗体 的荧光强度未出现降低，荧光抗体的抗体效价维持在1 32。固相免疫荧光检测试剂盒组装及使用固相免疫荧光检测试剂盒由溴化氰活化的 琼脂糖微球载体、RPE标记的抗新城疫病毒荧光抗体、抗新城疫病毒多克隆抗体、洗涤液、稀 盐酸等组成。固相免疫荧光检测试剂盒的使用方法为微球载体使用时需用稀盐酸溶胀， 取0. 3g溴化氰活化的琼脂糖凝胶冻干粉，置于ImM盐酸中溶涨30min，以同样浓度的盐酸 冲洗5次，用50mM pH 8PBS (含IOOmMNaCl)快速冲洗得到ImL活化凝胶，立即与2mL浓度 为5mg/ml的抗新城疫病毒多克隆抗体混勻，20°C缓慢振荡作用12h，加入2mL 0. IM的乙醇 胺封闭，20°C缓慢振荡作用4h，离心去上清，用50mM pH 8PBS反复冲洗凝胶，离心获得偶联 有抗体的琼脂糖凝胶，用IOOmM pH 7. 5的PBS配成10% (ν/ν)的悬浮液。取偶联有抗新 城疫病毒抗体的琼脂糖凝胶50uL，置于洁净的试管中，加待检病毒液100uL，37°C温育2h， 用IOOmM pH7. 5的PBS冲洗10次。加入5ug/ml浓度的荧光抗体100uL，37°C温育2h，用 IOOmM pH 7. 5的PBS冲洗5次。吸取少量微球，滴于低荧光背景的玻片上，盖片，甘油缓冲 液封片，荧光显微镜下以蓝绿光激发，观察、判定结果。阳性微球在红光激发下发射明亮的 桔黄色荧光，阴性微球无荧光。将荧光强度与背景染色强度以+表示，分为++++(最强阳 性)、+++(强阳性)、++(较强阳性)、+(弱阳性)、_(阴性)五级。荧光强度达到++以上 判定为阳性。试验设SPF鸡血清阴性对照和PBS空白对照。敏感性、特异性、重复性检测(1)以PBS将新城疫病毒连续稀释，利用固相免疫荧 光检测试剂盒对各稀释度逐一进行荧光检测，以能检测出的病毒最高滴度作为检测的灵敏 度。(2)分别以禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性喉气管炎病 毒、鸡痘病毒等取代新城疫病毒，按上述固相免疫荧光检测试剂盒进行荧光检测，在蓝绿光 激发下均未检测到荧光，证明试剂盒的特异性好。(3)利用试剂盒对同一个稀释度的新城疫 病毒样品重复检测3次，结果一致，表明试剂盒的重复性较好。与FITC标记荧光抗体检测新城疫病毒比较纯化的新城疫抗体用50mM pH 9的碳 酸缓冲液透析过夜，调整浓度为10mg/ml。用上述碳酸缓冲液配制0. lmg/ml的FITC。将抗 体置于10倍抗体体积的FITC溶液中4°C缓慢搅拌透析24h，然后迅速将标记抗体置于50mM PH 7. 2的磷酸缓冲液透析，经常更换缓冲液。以FITC标记的抗体探针代替RPE标记的抗体 探针，用建立的固相免疫荧光检测法对新城疫病毒检测。总之，RPE标记的荧光抗体荧光明亮，长期保存无明显衰减，与FITC标记的荧光抗 体相比，荧光更明亮，灵敏度更高，受生物质本底荧光干扰小。本发明采用的微球载体自身 无本底荧光，不会干扰荧光检测结果，而且由于球形载体的表面积大，能包被更多的抗体或 抗原，从而结合更多的荧光探针，利于信号富集，能够提高免疫荧光检测的灵敏度。与硝酸 纤维膜、96孔板等现有固相载体相比，本底荧光干扰更小，荧光更亮，检测灵敏度更高。
附图1为RPE标记抗新城疫病毒荧光抗体的HPLC纯化图。液相柱型号为TSK G3000sw，流动相为50mM pH7. 5的PBS，流速0. 5mL/min, RPE标记抗新城疫病毒荧光抗体、 抗新城疫病毒抗体、RPE的洗脱时间为分别为19. 57min、27. 32,31. 26min。
附图2为RPE标记荧光抗体(虚线)及RPE (实线)的荧光光谱。RPE标记荧光抗 体与对照RPE在498nm激发光的激发下，室温荧光发射波长均位于575nm，没有发生斯托克 位移改变，仍具有RPE的特征荧光发射光谱。附图3为RPE标记抗新城疫病毒荧光抗体的SDS-PAGE电泳结果。RPE标记荧光抗 体既具有RPE的α、β、γ亚基条带，又具有抗体的H、L链条带。附图4为RPE标记荧光抗体固相免疫荧光检测结果。RPE标记荧光抗体阳性微球 发射明亮桔黄色荧光，而阴性微球检测不到荧光。
具体实施例方式RPE制备冷冻保存的多管藻加入6倍体积的20mM醋酸缓冲液(pH5. 8)，4°C下溶 胀24h，多层纱布过滤、挤压获得褐色浸提液，浸提液加入固体硫酸铵至浓度为60% (w/v), 4°C放置24h，离心收集沉淀，将沉淀溶于20mM的醋酸缓冲液(pH5. 8)中，然后用20mM的醋 酸缓冲液(PH5. 8) 4°C透析过夜，透析液加到用20mM醋酸缓冲液(pH5. 8)(含50mM NaCl)预 先平衡的DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，用20mM醋酸缓冲液(pH5. 8)冲洗掉 阴离子交换柱上过量的样品和杂质，用20mM醋酸缓冲液(pH4. 0)(含50mM NaCl) 一步洗脱 就可得到大量纯的RPE，纯化的多管藻RPE纯度达电泳纯，纯度指数A62tlA28tl >5.2,结构式 为(α β)6Υ，分子量约为240kDa，最大吸收峰分别位于498、540、565nm，室温荧光发射峰位 于575nm，纯化的RPE硫酸铵沉淀4°C避光保存，使用前用50mM pH7. 5PBS充分透析除盐，调 整浓度为10mg/mL。新城疫病毒多克隆抗体制备新城疫病毒La Sota株IO4倍稀释，尿囊腔接种9-10 日龄SPF鸡胚，每胚0. 2mL，37-38°C孵育，收集接种24_120h的死胚、存活胚的尿囊液，红细 胞凝集试验检测滴度>1 256，无菌检验合格，以0.3%甲醛37°C灭活24h，按1 3比例 加入灭菌10号白油和吐温-80，用胶体磨乳化成油包水型油乳剂灭活疫苗。制备的新城疫 油乳剂灭活苗免疫4周龄SPF鸡，颈部皮下注射1. OmL/只，首免10天后相同剂量加强免疫 一次，二免1周后采血，测定血清中新城疫病毒HI抗体，当HI效价> 1 256时采集血清， DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析纯化，50mM pH7PBS+0_lM NaCL梯度洗脱得到 纯的抗新城疫病毒多克隆抗体，-20°C冷冻保存。RPE标记新城疫病毒抗体荧光探针的制备SPDP按100 1的摩尔比分别与RPE、 新城疫病毒抗体混勻，铝箔封好后于室温旋转反应2h，超滤离心除去多余的SPDP。取DTT 按100 1的摩尔比与新城疫病毒抗体衍生物充分混勻，室温静置反应lh，超滤离心除去多 余的DTT。新城疫病毒抗体-HS与RPE衍生物以摩尔比1 1混勻，铝箔封好后于20-25°C 振荡反应20h。用10mg/ml的NEM溶液20ul封闭多余巯基，室温旋转反应60min。反应中 的NEM不用除去。RPE标记的荧光抗体的纯化和交联效率分析液相色谱工作站上采用HPLC法 进行荧光抗体的交联效率分析和纯化，分子筛高压液相色谱柱型号TSK G3000SW(规格 7. 5mm X 60cm)，流动相为 50mM PBS pH7. 5，流速 0. 5mL/min，检测波长 190_800nm。荧光标记 抗抗体于19.57min最先被洗脱下来。收集第一个洗脱峰。目标产物的洗脱峰面积占所有 洗脱峰面积的比例即为交联效率，分析表明荧光探针的交联得率为95%。RPE标记荧光抗体的光谱检测吸收光谱在紫外_可见光分光光度计上测定，扫描波长区间250-700nm。吸收光谱检测可判定交联是否成功及交联反应是否导致RPE变性。室 温荧光发射光谱在荧光分光光度计上测定，激发波长498nm，荧光扫描范围为520-700nm。 在紫外区，RPE标记荧光抗体的吸光度高于对照RPE，吸收峰位置相同，这是因为RPE表面交 联了抗体分子，而抗体在280nm有较强的光吸收；在400-700nm范围内，交联物的吸收光谱 与对照RPE的吸收峰及吸光度相似，是由于抗体在此范围内无光吸收。RPE标记光抗体与对 照RPE在498nm激发光的激发下，室温荧光发射波长均位于575nm，没有发生斯托克位移的 改变，仍具有RPE的特征荧光发射光谱，且荧光亮度无明显降低。RPE标记荧光抗体的效价检测抗体效价采用微量血凝抑制试验方法(HI)测定。 用灭活的对应新城疫尿囊毒制备4单位检测抗原，反应在V型96孔板上进行。以红细胞凝 集抑制的最高稀释度为荧光抗体的效价。荧光标记抗体的HI效价为1 32。RPE标记荧光抗抗体的电泳检测=SDS-PAGE在垂直板不连续电泳装置上进行，分 离胶浓度为12. 5%，浓缩胶浓度为5%。恒压电泳，电压为218V。用0. 25% (w/v)考马斯亮 蓝R-250染色，脱色后观察结果。SDS-PAGE电泳发现RPE标记荧光抗体既具有RPE的α、 β、Y亚基条带，又具有抗体的H、L链条带，电泳结果证实RPE与抗体交联成功。RPE标记荧光抗体的稳定性检测纯化的RPE标记荧光抗体中加入0. 02%叠氮化 钠，4°C避光保存，每隔30天测定一次荧光光谱和抗体效价，室温荧光发射光谱在荧光分光 光度计上测定，抗体效价采用血凝抑制试验方法测定，观察荧光亮度和抗体活性的变化。保 存试验证实研制的RPE标记的荧光抗体稳定性好。RPE标记荧光抗体在0. 05mol/L的磷 酸缓冲液中4°C保存120天，荧光抗体的荧光强度保持不变，荧光抗体的抗体效价维持在 1 32，未出现降低。固相免疫荧光检测试剂盒组装及使用固相免疫荧光检测试剂盒由溴化氰活化的 琼脂糖微球载体、RPE标记的抗新城疫病毒荧光抗体、抗新城疫病毒多克隆抗体、洗涤液、稀 盐酸等组成。固相免疫荧光检测试剂盒的使用方法为微球载体使用时需用稀盐酸溶胀， 取0. 3g溴化氰活化的琼脂糖凝胶冻干粉，置于ImM盐酸中溶涨30min，以同样浓度的盐酸冲 洗5次，用50mM pH 8PBS (含IOOmM NaCl)快速冲洗得到ImL活化凝胶，立即与2mL浓度为 5mg/ml的抗新城疫病毒多克隆抗体混勻，20°C缓慢振荡作用12h，加入2mL 0. IM的乙醇胺 封闭，20°C缓慢振荡作用4h，离心去上清，用50mM pH 8PBS反复冲洗凝胶，离心获得偶联有 抗体的琼脂糖凝胶，用IOOmM pH 7. 5的PBS配成10% (ν/ν)的悬浮液。取偶联有抗体的琼 脂糖凝胶50uL，置于洁净的试管中，加待检病毒液100uL，37°C温育2h，用IOOmM pH 7. 5的 PBS冲洗10次。加入5ug/ml浓度的荧光标记抗体lOOuL，37°C温育2h，用IOOmM pH 7. 5的 PBS冲洗5次。吸取少量微球，滴于低荧光背景的玻片上，盖片，甘油缓冲液封片，荧光显微 镜下以蓝绿光激发，观察、判定结果。阳性微球在红光激发下发射明亮的桔黄色荧光，阴性 微球无荧光。将荧光强度与背景染色强度以+表示，分为++++(最强阳性)、+++(强阳性)、 ++(较强阳性)、+(弱阳性)、_(阴性)五级。荧光强度达到++以上判定为阳性。试验设 SPF鸡血清阴性对照和PBS空白对照。在蓝绿光激发下阳性微球呈明亮的桔黄色荧光，阴性 结果无荧光。制备新城疫病毒尿囊毒，测定病毒的红细胞凝集价为29，EID50为10_7 2，病毒的蛋 白浓度为40. 3mg/mL。以PBS将尿囊毒连续稀释，利用建立的固相免疫荧光法对每个稀释度 逐一进行荧光检测。试剂盒能检测出新城疫病毒的最低浓度为4. 03X 10-7mg/mlο
分别以禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性喉气管炎 病毒、鸡痘病毒等取代新城疫病毒，按上述固相免疫荧光检测试剂盒进行荧光检测，在蓝绿 光激发下均未检测到荧光，证明试剂盒的特异性好。利用固相免疫荧光检测试剂盒对同一个稀释度的新城疫病毒样品重复检测3次， 结果一致，表明检测试剂盒的重复性较好。FITC标记抗体荧光探针检测新城疫病毒纯化的新城疫病毒抗体用50mM pH 9的 碳酸缓冲液透析过夜，调整浓度为10mg/ml。用上述碳酸缓冲液配制0. lmg/ml的FITC。将 抗体置于10倍抗体体积的FITC溶液中4°C缓慢搅拌透析24h，然后迅速将标记抗体置于 50mM pH 7. 2的磷酸缓冲液透析，经常更换缓冲液。以FITC标记的抗体探针代替RPE标记 的抗体探针，用固相免疫荧光检测试剂盒检测新城疫病毒。FITC标记探针检测阳性微球在 蓝光激发下发射绿色荧光，能检测出新城疫的最低浓度为4. 03X 10_6mg/ml，灵敏度比RPE 标记探针低10倍。表IRPE标记抗体荧光探针检测新城疫病毒
权利要求
一种检测新城疫病毒的荧光抗体的制备方法，包括阴离子交换层析法纯化多管藻RPE，用摩尔比50 100∶1的化学交联剂SPDP分别将RPE、抗新城疫病毒抗体衍生，DTT以50 100∶1的摩尔比还原抗体衍生物产生游离 HS，抗体 HS与RPE衍生物以摩尔比1∶1液相交联，经HPLC纯化制备RPE标记的抗新城疫病毒荧光抗体，本发明制备的RPE标记的抗新城疫病毒荧光抗体纯度高、桔黄色荧光明亮、性质稳定，可用于新城疫病毒的快速、鉴别检测。
2.根据权利要求1的方法，其中RPE的制备由多管藻中采用阴离子交换层析法分离纯 化，制备过程为取冷冻保存的多管藻，加入20mM醋酸缓冲液(pH5. 8)，4°C下溶胀24h，多层 纱布包裹、挤压、过滤获得褐色浸提液，浸提液加入固体硫酸铵至浓度为60% (w/v)，4°C放 置24h，离心收集沉淀，将沉淀溶于20mM的醋酸缓冲液(pH5. 8)中，然后对20mM的醋酸缓冲 液(PH5. 8)透析，透析液加到用20mM醋酸缓冲液(pH5. 8)(含50mM NaCl)预平衡的阴离子 交换柱，用20mM醋酸缓冲液(pH5. 8)冲洗掉阴离子交换柱上过量的样品及杂质，用20mM醋 酸缓冲液(PH4. 0)(含50mM NaCl) 一步洗脱就可得到大量纯的RPE，纯化的多管藻RPE纯度 达电泳纯，纯度指数A62tlA28tl >5. 2，结构式为(α 0)6^，分子量约为2401^ 最大吸收峰分 别位于498、540、565nm，室温荧光发射峰位于575nm，纯化的RPE硫酸铵沉淀4°C避光保存， 使用前用50mM pH7. 5PBS充分透析除盐，调整浓度为5mg/mL。
3.根据权利要求1的方法，其中抗新城疫病毒抗体采用灭活的新城疫病毒抗原免疫 SPF鸡，经阴离子交换层析纯化制备，制备过程为新城疫病毒IO4倍稀释，尿囊腔接种9-11 日龄SPF鸡胚，每胚0. 2mL，37-38°C孵育，收集接种24_120h的死胚、存活胚的尿囊液，红细 胞凝集试验检测滴度>1 256，无菌检验合格，以0.3%甲醛37°C灭活24h，再按1 3比 例加入灭菌10号白油和吐温-80，用胶体磨乳化成油包水型油乳剂灭活疫苗，制备的禽流 感病毒油乳剂灭活苗免疫4周龄SPF鸡，颈部皮下注射1. OmL/只，首免10天后相同剂量加 强免疫一次，二免1周后采血，测定血清中新城疫病毒HI抗体，当HI效价> 1 256时采 集血清，阴离子交换层析纯化，电泳鉴定无杂带，即为合格的新城疫病毒多克隆抗体，"200C 冷冻保存。
4.根据权利要求1的方法，其中荧光抗体采用化学交联法制备，制备过程为SPDP按 50-100 1的摩尔比分别与RPE、抗体混勻，铝箔封好后于室温旋转反应2h，超滤离心除去 多余的SPDP，DTT按50-100 1的摩尔比与抗体衍生物充分混勻，室温静置反应lh，超滤 离心除去多余的DTT，抗体-HS与RPE衍生物以摩尔比1 1混勻，铝箔封好后于20_25°C 振荡反应20h，加NEM封闭多余巯基，室温旋转反应60min，HPLC纯化，收集交联物洗脱峰， 荧光分光光度计上检测交联物的室温荧光发射光谱，微量血凝抑制法测定交联物的抗体效 价，检测合格加0. 02%叠氮化钠4°C保存。
5.一种检测新城疫病毒的固相免疫荧光检测试剂盒，其中包括权利要求1制备的RPE 标记的抗新城疫病毒荧光抗体及溴化氰活化的琼脂糖微球载体、抗新城疫病毒多克隆抗 体、洗涤液、、稀盐酸等，本发明的试剂盒检测灵敏度高，可用于新城疫病毒的快速免疫荧光 检测。
6.根据权利要求5的方法，其中固相载体为微球载体，由琼脂糖经溴化氰活化制备，直 径60-200um，冻干粉，购自Amersia公司，使用前用稀盐酸溶液溶胀处理，溶胀处理步骤为 取0. 3g溴化氰活化的琼脂糖凝胶冻干粉，置于ImM盐酸中溶涨30min，以同样浓度的稀盐酸溶液冲洗多次，用50mM pH 8PBS (含IOOmM NaCl)快速冲洗得到ImL活化凝胶，活化凝胶应 立即与抗体或抗原结合。
7.根据权利要求5的方法，其中固相免疫荧光检测试剂盒的使用方法包括取ImL活 化凝胶立即与2mL浓度为5mg/ml的抗新城疫病毒抗体混勻，20°C缓慢振荡作用12h，加入 2mL 0. IM的乙醇胺封闭，20°C缓慢振荡作用4h，离心去上清，用50mM pH 8PBS反复冲洗凝 胶，离心获得偶联有抗新城疫病毒抗体的琼脂糖凝胶，用IOOmM pH 7. 5的PBS配成10% (ν/ ν)的悬浮液，取偶联有抗新城疫病毒抗体的琼脂糖凝胶50uL，置于洁净的试管中，加待检 新城疫病毒液lOOuL，37°C温育2h，用IOOmM pH 7. 5的PBS冲洗10次。加入5ug/ml的荧光 标记抗体lOOuL，37°C温育2h，用IOOmM pH 7. 5的PBS冲洗5次。吸取少量微球，滴于低荧 光背景的玻片上，盖片，甘油缓冲液封片，荧光显微镜下以蓝绿光激发，观察、判定结果。阳 性微球在蓝绿光激发下发射明亮的桔黄色荧光，阴性微球无荧光。
全文摘要
本发明涉及一种检测新城疫病毒的荧光抗体的制备方法及固相免疫荧光检测试剂盒。用交联剂SPDP分别将R-藻红蛋白(RPE)、抗新城疫病毒(NDV)抗体衍生，衍生物以适宜摩尔比交联，经HPLC纯化制备RPE标记的抗NDV荧光抗体。荧光抗体与抗NDV抗体、琼脂糖微球、稀盐酸、洗涤液组成固相免疫荧光检测试剂盒。试剂盒的检测流程为微球溶胀活化后用抗体包被，洗涤后与待测样品结合，洗涤后再与荧光抗体结合，充分洗涤后荧光显微镜下蓝绿光激发，观察、判定结果。本发明制备的荧光抗体得率高、纯度高、荧光呈明亮的桔黄色、稳定性好；试剂盒采用球形载体具有信号富集作用，能提高检测灵敏度。本发明适于新城疫病毒的快速检测。
文档编号C07K16/06GK101975856SQ20101028433
公开日2011年2月16日 申请日期2010年9月17日 优先权日2010年9月17日
发明者吕爱杰, 朱丽萍, 颜世敢, 颜士勇 申请人:颜世敢