鸡新城疫病毒f蛋白和肠毒素ltb的融合蛋白及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种截短的鸡新城疫病毒F蛋白和肠毒素LTB的融合蛋白及应用，所述的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ?ID?NO:1。本发明的融合蛋白用于制备鸡新城疫病毒基因工程亚单位疫苗。本发明将筛选的鸡新城疫病毒基因VIId型的毒株的F蛋白部分序列与具有免疫增强作用的肠毒素LTB蛋白通过Lingker序列连接获得的融合蛋白，并将该融合蛋白进一步制备成疫苗。动物试验结果表明制备的基因工程亚单位疫苗免疫原性良好，可以高效的引起雏鸡的免疫应答。
【专利说明】鸡新城疫病毒F蛋白和肠毒素LTB的融合蛋白及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种鸡新城疫病毒F蛋白和肠毒素LTB的融合蛋白及应用。
【背景技术】
[0002]新城疫(Newcastle disease, NDV)是当今世界上最严重的禽类传染病之一，被世界动物卫生组织(0IE)列为必须报告的传染病。NDV是单链负股RNA病毒，整个基因组全长15586个核苷酸，分子量约为51~57 KD。NDV编码6种结构蛋白，分别是核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,NP)、憐蛋白(Phosphate protein,P)、基质蛋白(Matrix,M)、融合蛋白(Fusionprotein, F)、血凝素神经氨酸酶(Haemagglutinin Neuraminidase Protein,HN)和高分子量的RNA聚合酶(Large protein，L)，其顺序为3’-NP-P-M-F-HN-L_5’。随着现在养殖集约化、规模化的发展，新城疫病毒变异很快，近几年临床上流行的毒株以新城疫基因VIId型为主，现有Lasota等疫苗株已无法对临床野毒提供有效保护，免疫失败的案例时有发生，急需开发新一代疫苗。F蛋白是构成新城疫病毒(NDV)致病性的分子基础之一，为新城疫病毒的主要保护性抗原，常被用为新城疫病毒基因工程疫苗的候选基因。F蛋白基因编码一条由553个氨基酸组成的蛋白，包括信号序列(SS)、位于羧基端附近疏水的跨膜结构域(TM)和一个由25~30个氨基酸组成的细胞质结构域(CT)，其3个主要的抗原决定簇位于72、161、343位。1995年美国农业部正式批准重组新城疫病毒F基因的鸡痘病毒活载体苗商品化，该重组活疫苗免疫效果与常规ND疫苗相当，并且一次免疫即可保护鸡抵抗NDV强毒的攻击。因新城疫病毒F蛋白过大，原核中难于表达，而真核表达系统的成本又过高，针对新城疫病毒F蛋白研制的基因工程亚单位疫苗迟迟没有实现商品化。因此，对新城疫病毒F蛋白质结构进行预测，筛选新城疫病毒F蛋白主要抗原表位进行表达成为新城疫病毒病毒基因工程亚单位疫苗开发的一个热点。王杰等(2013年)采用大肠杆菌对含有主要抗原表位的新城疫病毒F蛋白部分序列实现了高效表达，进一步制备的疫苗可对免疫的鸡群实现保护，但其保护率偏低，仅为50%。
[0003]产肠毒素大肠埃希菌(ETEC)是一类致人和幼畜腹泻的最常见的致病性大肠埃希菌，其产生不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin, LT)不仅具有毒性作用，而且还具有良好的免疫原性和免疫佐剂作用。LT为寡聚蛋白，由一个A亚(28 KD)和5个B亚基(I 1.5KD)经非共价键结合。B亚基(LTB)是LT的免疫原性部位，是受体结合部位，具有良好的免疫佐剂作用，已有多篇文献报道其用于疫苗的免疫佐剂。李润成等(2009年)将肠毒素LTB蛋白基因与口蹄疫VPl蛋白基因进行融合表达，发现LTB可有效促进口蹄疫VPl蛋白的免疫效果，增效明显。
[0004]本发明即是基于肠毒素LTB优良的免疫佐剂作用和新城疫病毒株F蛋白良好的免疫原性设计的。
【发明内容】
[0005]本发明涉及一种鸡新城疫病毒F蛋白和肠毒素LTB的融合蛋白及应用，即将筛选的鸡新城疫病毒基因VIId型的毒株的F蛋白部分序列与具有免疫增强作用的肠毒素LTB蛋白通过Lingker序列连接获得的融合蛋白，并将该融合蛋白作为疫苗用于免疫应答。
[0006]本发明一个方面涉及一种融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID N0:1。
[0007]本发明的融合蛋白用于制备鸡新城疫病毒亚单位疫苗。
[0008]上述制备的亚单位疫苗，其制备方法如下:将96份融合蛋白与灭菌的4份吐温80搅拌混合作为水相；将94份注射用白油，6份加司本80、2份硬脂酸铝，混合均匀，高压灭菌后作为油相；按水相和油相体积比1:3比例混合乳化即可制备鸡新城疫病毒基因工程亚单位疫苗。
[0009]本发明的亚单位疫苗用于对雏鸡的免疫应答。
[0010]本发明是基于肠毒素LTB优良的免疫佐剂作用和新城疫病毒株F蛋白良好的免疫原性设计的。其具有以下几个优点:1、选用的鸡新城疫病毒从国内临床养殖的病鸡中分离，属于国内外文献报道的近几年国内流行的鸡新城疫基因VIId型毒株，以其制备的疫苗针对性更强、疗效更确切；2、表达的鸡新城疫病毒F蛋白的部分序列，既包含了 F蛋白的主要抗原表位又实现了原核的高效表达，大大降低了生产成本；3、本发明将筛选的含主要抗原表位的鸡新城疫病毒F蛋白基因与具有免疫增强作用的肠毒素LTB蛋白基因通过Lingker序列连接获得融合蛋白。一次免疫操作就可以使雏鸡可以获得高效免疫保护。
[0011]【具体实施方式】:
本发明涉及一种截短的鸡新城疫病毒F蛋白和肠毒素LTB的融合蛋白。其中肠毒素LTB蛋白3'端的108个氨基酸与含主要抗原表位的鸡新城疫病毒F蛋白145个氨基酸通过Lingker序列GGGGS连接起来，其具有序列为SEQ ID NO:1的氨基酸序列和序列为SEQID N0:2的核苷酸序列。所述的融合蛋白`可通过本领域技术人员所熟知的基因重组的方法进行制备。
[0012]将重组制备的鸡新城疫病毒F蛋白和肠毒素LTB的融合蛋白经白油佐剂乳化制成鸡新城疫病毒基因工程亚疫苗。按兽用生物制品规程的检验方法进行性状、无菌检验、安全检验均合格。再将制备的疫苗免疫SPF雏鸡，结果显示制备的疫苗免疫原性良好，可有效引起雏鸡的免疫应答。
[0013]下面结合【具体实施方式】来进一步描述本发明，但这些实例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的技术方案实质的情况下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明保护范围内。
一、截短的鸡新城疫病毒F蛋白的筛选与原核表达 包括有如下的步骤:
1、 申请人:首先从临床分离的疑似鸡新城疫的病料处理后接种9日龄SPF鸡胚，盲传三代后PCR扩增鸡新城疫病毒F基因，引物序列如下:
Pl:5' — GTTAGAAAAAACACGGGTAGAAGA —3'
P2:5 ' — TCCAAATAGGTGGCACGCATA —3'
扩增的条件如下:94°C 5min 变性，94°C 30S,55°C 30S,72°C lmin，30 个循环，72°C延伸 IOmin0[0014]扩增产物进行测序，基因序列部分在NCBI上Blast比对，同源性最高为100%，建立的进化树显示其属于新城疫病毒基因VIId型，为近几年国内临床流行毒株。
[0015]2、通过生物软件分析选取分离的鸡新城疫病毒F蛋白基因的部分序列，该序列位于F基因N端，含有F蛋白的主要抗原表位，并将该段蛋白与免疫佐剂LTB蛋白通过Lingker序列GGGGS连接起来，其具有序列为SEQ ID NO:1的氨基酸序列和序列为SEQ ID NO: 2的核苷酸序列。将获得的融合蛋白基因的5'端和3'端分别加上BamH I和Hind III酶切位点，送基因公司进行全基因合成。
3、将合成得到的基因双酶切后连入pET30a载体相应的酶切位点，构建pET30a/NDV-LTB表达载体。用CaCl2法将pET30a/NDV_LTB表达载体转化入大肠杆菌BL21 (DE3)，涂布于含50iig/ml卡那霉素的琼脂平板，37°C过夜培养。选取10个单菌落提取质粒，BamH I和Hind III双酶切验证阳性的菌落进一步测序鉴定。将测序验证后的阳性克隆在LB培养基中发酵培养至0.6~0.8时加入0.3mM IPTG诱导4~5小时，离心收集菌体跑SDS-PAGE电泳，同时设立未诱导菌体作为对照。结果诱导后阳性克隆比对照菌在33KD处多出一条蛋白条带，与重组蛋白理论分子量一致，表达量约为32%以上。经新城疫病毒F蛋白抗体免疫印迹检定，显示阳性反应。证明获得的阳性克隆为高效表达基因工程蛋白的工程菌。
[0016]二、发酵、纯化与鸡新城疫病毒基因工程亚单位疫苗的制备
1、重组蛋白发酵与纯化
I) LB培养基作为种子培养基，含5g/L葡萄糖和5g/L MgSO4 ? 7H20的LB培养基作为发酵培养基，补料为葡萄糖400g/L、蛋白胨24g/L、酵母提取物10 g/L, NaCl 5 g/L、MgSO4 ? 7H20 5 g/L。
[0017]2)发酵过程·
挑取鉴定过的工程菌接种于含卡那霉素的浓度为50ii g/ml的LB培养基，37°C振荡培养8小时，作为种子液。将种子液按2%接种量接种于发酵罐中，调节好各参数，37°C，200转，溶氧控制在20%以上。发酵4小时后开始流加补料，发酵6小时后加入0.3mmol/L IPTG进行诱导表达，表达后6小时发酵结束。
[0018]3)镍柱纯化、脱盐
4)亲和层析
采用镍离子金属螯合层析柱，重组蛋白可以用含350mmol/L咪唑的洗脱液洗下来，纯度达到92%以上
5)脱盐
收集的重组蛋白洗脱液放入透析袋，PBS液作为透析外液，透析脱盐即得重 组蛋白液。
[0019]2、鸡新城疫病毒基因工程亚单位疫苗的制备
将制备的重组蛋白96份与灭菌的4份吐温-80充分搅拌混合作为水相。同时注射用白油94份，加6份的司本80、硬脂酸铝2份，混合均匀，高压灭菌后作为油相。按水相和油相1:3比例混合乳化即可制备鸡新城疫病毒基因工程亚单位疫苗。按兽用生物制品规程的检验方法进行性状、无菌检验、安全检验均合格。
[0020]三、鸡新城疫病毒基因工程亚单位疫苗的免疫试验
将制备的鸡新城疫病毒基因工程亚单位疫苗经肌肉接种20日龄SPF雏鸡20羽，另取20羽注射无菌PBS作为对照。免疫后0、7、14、21、28、60天采血，测血清中新城疫的HI效价。结果免疫组在21后效价维持在8、左右，且鸡群抗体滴度分布均匀，而对照组则全程维持在3~4左右。证明制备的鸡新城疫病毒基因工程亚单位免疫效果良好。
[0021]四、鸡新城疫病毒基因工程亚单位疫苗的攻毒试验
将制备的鸡新城疫病毒基因工程亚单位疫苗经肌肉接种20日龄SPF雏鸡20羽，另取20羽注射无菌PBS作为对照。免疫28日后在负压隔离器中进行攻毒试验，口服新城疫强毒北京株，IO5EID5tl/羽，观察14日。结果对照组鸡群全部发病、死亡，剖检有典型新城疫病毒感染症状，免疫组鸡只接种部位、精神、采食正常，未见明显变化，保护率达到100%。结果显示制备的重组蛋白免疫原性良好，其进一步制备的鸡新城疫病毒基因工程亚单位疫苗可以引起雏鸡的免疫应答 ，可有效保护雏鸡抵抗新城疫强毒北京株的攻击。
【权利要求】
1.一种鸡新城疫病毒F蛋白和肠毒素LTB的融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID N0:1。
2.权利要求1所述的融合蛋白在制备鸡新城疫病毒基因工程亚单位疫苗中的应用。
3.一种鸡新城疫病毒基因工程亚单位疫苗，其制备方法如下:将96份权利要求1所述的融合蛋白与灭菌的4份吐温80搅拌混合作为水相；再将94份注射用白油，6份加司本80、2份硬脂酸铝混合均匀，高压灭菌后作为油相；按水相和油相体积比1:3比例混合乳化后制成亚单位疫苗。
4.权利要求3所 述的亚单位疫苗用于对雏鸡的免疫应答。
【文档编号】C07K19/00GK103626878SQ201310652273
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年12月9日 优先权日:2013年12月9日
【发明者】侯竹美, 方华华, 丰艳妮, 王凤舞, 王金叶 申请人:青岛农业大学