专利名称：：一种快速检测产肠毒素大肠杆菌的试剂盒及方法
技术领域：
：本发明涉及一种快速检测食品质量的方法，具体的说，涉及一种快速检测产肠毒素大肠杆菌的试剂盒及检测方法。
背景技术：
：食品安全突发事件频率高是近年来社会公共安全问题的一个显著特点。在食品污染所引发的肠道疾病中，产肠毒素大肠杆菌是引起食物中毒的常见肠道致病菌之一。有效控制食品污染扩散，对食品质量的监督和检测提出了更高的要求。如何快速、准确的检测食品中的病原菌，是控制食品安全事故发生的基础。目前，国内检测产肠毒素大肠杆菌仍采用传统的方法，其操作繁琐，检测时间长，通常需要35天。环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，简称LAMP)是利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。该技术在Ih内能扩增出IO9靶序列拷贝，扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段的混合物，电泳后在凝胶上显现出由不同大小的区带组成的阶梯式图谱。LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。本发明采用环媒恒温基因扩增技术，建立了快速检测不耐热型产肠毒素大肠杆菌的方法，缩短了检测时间(2-3小时完成)，提高了检测的灵敏性，为快速、准确检测食品是否发生病原菌污染，预防食品安全事故发生提供了可能。
发明内容本发明提供一种检测产肠毒素大肠杆菌的试剂盒，其含有引物SEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNO1attacatttaagagcggcgc；2ggttcctagcattagacatgcttt；3gtgtatggaataataaaacccctaaagcaaactagttttcca；4gtgtccttcatcctttcaatggcaggtcgaagtcccgggcagtc特异性扩增来自产肠毒素大肠杆菌的基因。所述产肠毒素大肠杆菌的基因为编码不耐热肠毒素的基因，其基因序列如SEQIDNO5所示。进一步的，所述试剂盒还含有Mg2+，更进一步的，所述试剂盒还含有显色剂。优选的，所述显色剂是绿色核酸凝胶染液(SYBRGreenI)鉬酸铵或硫酸铜。本发明的另一目的是提供一种快速检测食品是否被产肠毒素大肠杆菌污染的方法，包括以下步骤1)提取待检样本中的DNA；2)用引物对样本中的DNA进行扩增，所述引物如SEQIDNO:14所示；3)对DNA扩增结果进行检测。其中，步骤2)的扩增条件为，dNTPs浓度为0.6mM,Bst酶添加量为8U，扩增温度为55-65°C，扩增反应最短反应时间为40min。步骤3)所述的检测DNA扩增结果的方法是观察是否生成焦磷酸镁沉淀或沉淀显色。根据本发明的另一方面，还提供如SEQIDNO:14所示寡核苷酸序列的用途，其用于扩增或检测来自病原体产肠毒素大肠杆菌的基因。本发明依据不耐热肠毒素(LT)编码基因的6个保守区，采用引物设计软件设计LAMP引物，优化了dNTPs浓度、BstDNA聚合酶浓度、反应温度、反应时间等反应条件，结果理想，并对该方法进行了特异性、敏感性试验，初步探索了可实际应用的试剂盒条件。产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenicΕ.coli，ETEC)的核苷酸序列总长度约为70kb，主要有两类致病基因一类为菌毛蛋白基因(或称粘着素、定居因子)，已知的粘着素有K88，K99，987P，CFA,PCFO166,F41等。另一类为肠毒素基因，ETEC的主要毒力因子为耐热性肠毒素(heat-stableenterotoxin,ST)禾口不耐热性肠毒素(heat-labileenterotoxin,LT)，ST和LT是导致幼龄动物腹泻的直接致病因子。ETEC借助这些粘着素定居于宿主肠道粘膜的上皮细胞上，从而大量繁殖，产生大量肠毒素。LAMP技术的特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)在恒温条件(65°C左右)保温四十分钟，即可完成核酸扩增反应，直接扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度(或颜色反应)进行判断是否发生反应。根据上述原理，发明人进行了下述工作1、LAMP检测方法的建立以本发明设计的特异性引物扩增enterotoxigenicΕ.coli,ETEC特征基因片段。判断是否存在特异性扩增来确定ETEC的存在。2、LAMP反应条件的优化在不同的反应温度、反应时间、镁离子浓度、dNTP浓度、Betaine浓度下扩增。3、特异性试验以本发明建立的方法扩增各产毒素大肠菌参考株及其它细菌，考察该方法的特异性。4、敏感性试验逐步降低样品的菌液浓度，记录特异性条带亮度强弱，直至无扩增产物，以此研究该方法的灵敏性。5、判定LAMP结果阴阳性方法探索1.由于LAMP反应形成大量扩增产物，可以直接向扩增管中加入嵌入剂SYBRGreenI，无扩增反应的管子呈橙色，有扩增反应的管子将变为绿色。2.LAMP检测还可以通过评估扩增副产物焦磷酸镁的白色沉淀物的量来进行。LAMP反应中，在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸镁沉淀。它有极高的特异性，可以用肉眼观察或浊度仪检测反应管中的沉淀浊度就能够判断扩增与否。①鉬酸铵在冷时鉬酸铵与焦磷酸盐溶液无沉淀发生；但在加热时，则有黄色磷鉬酸铵沉淀生成。②硫酸铜硫酸铜与焦磷酸盐生成灰蓝色沉淀。本发明的试剂盒和检测方法可以快速方便地将被病原菌产肠毒素大肠杆菌污染的食品检测出来，为食品生产和销售提供了一种新的监控方法。图1产肠毒素大肠杆菌不耐热肠毒素基因的特异性扩增片段的电泳2限制性内切酶酶切试验M为分子量标记，泳道1-2分别为LAMP产物扩增片段的限制性内切酶酶切产物与LAMP产物扩增片段，LAMP扩增产物被EcoRI限制性内切酶酶切后的DNA片段与预期片段大小一致(372bp，285bp，240bp，200bp)图3特异性实验M为分子量标记，N为无模版对照，泳道1-10分别为C83902产肠毒素大肠杆菌标准株、侵袭性大肠杆菌、普通变形杆菌、福氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、产气杆菌、球形芽孢杆菌、八叠球菌、腊样芽孢杆菌.只有C83902产肠毒素大肠杆菌DNA模版被扩增，其余9种菌株均无LAMP扩增。表明LAMP法对不耐热肠毒素大肠杆菌的检测特异性较好。图4灵敏性实验随着菌液浓度的降低，特异性条带亮度逐渐变弱，至菌液稀释10_8时无扩增产物。M-IOObp分子量标记；泳道1:10_4；泳道2:10_5；泳道3:10_6；泳道4:10_7；泳道5:10_8；泳道6:10_9;ΝΤ:无模板对照具体实施例方式本发明的实验条件1、材料1.1主要菌株实验涉及的主要菌种权利要求一种检测产肠毒素大肠杆菌的试剂盒，其特征是含有下列引物SEQIDNO1attacatttaagagcggcgc；SEQIDNO2ggttcctagcattagacatgcttt；SEQIDNO3gtgtatggaataataaaacccctaaagcaaactagttttcca；SEQIDNO4gtgtccttcatcctttcaatggcaggtcgaagtcccgggcagtc可以特异性扩增来自产肠毒素大肠杆菌的基因。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是所述产肠毒素大肠杆菌的基因为编码不耐热肠毒素的基因。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征是所述的不耐热肠毒素基因序列如SEQIDNO5所示。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是所述试剂盒还含有Mg2+。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征是含有显色剂。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征是所述显色剂是绿色核酸凝胶染液(SYBRGreenI)鉬酸铵或硫酸铜。7.一种快速检测食品是否被产肠毒素大肠杆菌污染的方法，包括以下步骤1)提取待检样本中的DNA;2)用引物对样本中的DNA进行扩增，所述引物如SEQIDNO:14所示；3)对DNA扩增结果进行检测。8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征是步骤2)的扩增条件为，dNTPs浓度为0.6mM,Bst酶添加量为8U，扩增温度为55_65°C，扩增反应最短反应时间为40min。9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征是步骤3)所述的检测DNA扩增结果的方法是观察是否生成焦磷酸镁沉淀或沉淀显色。10.如SEQIDNO:14所示寡核苷酸序列的用途，其特征是其用于扩增或检测来自病原体产肠毒素大肠杆菌的基因。全文摘要本发明公开了一种快速检测产肠毒素大肠杆菌的试剂盒及检测方法。本发明试剂盒含有基因序列如SEQIDNO1～4所示的引物，可以特异性扩增来自产肠毒素大肠杆菌的基因。利用本发明的试剂盒可以快速准确地检测被产肠毒素大肠杆菌污染的食品，为食品生产和销售监督提供了一种简便可靠的方法。文档编号G01N21/78GK101974616SQ20091021668公开日2011年2月16日申请日期2009年12月10日优先权日2009年12月10日发明者万红梅,代娟,何洋,李玉锋申请人:西华大学