专利名称：：一种金葡菌肠毒素b型(seb)胶体金试纸条及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物检测领域，具体涉及一种金葡菌肠毒素B型(SEB)的检测试纸及其制备方法和在金葡菌肠毒素B型(SEB)中的应用。
背景技术：
：金黄色葡萄球菌(金葡菌)是引起感染和中毒性疾病的主要病原菌，其致病性主要与其产生多种致病物质有关，金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcalen2terotoxinB,SEB)是其中一种重要的致病物质。目前测定金葡菌肠毒素B型的方法有ELISA法，需要借助梅标仪在实验室完成，不适合现场检测(李琦，陈立杰，董邦权等，双抗体夹心ELISA检测SEB方法的建立及在不同基质中检测的应用[J]细胞与分子免疫学杂志，1007-8738(2007)08-0761-02);动物毒理实'验，操作繁瑣，检测时间长，需要丰富的经验及指定的实验环境，不适合现场检测。(张靖，张军，应天翼等，应用SELDI-TOF-MS技术分析SEB染毒小鼠血清蛋白质组学变化J世界华人消化杂志，2006年4月18日(11):1111-1114)。
发明内容本发明的目的是提供一种方便、快捷地检测金葡菌肠毒素B型(SEB)的试纸，同时可利用金标免疫分析仪进行的半定量纟全测方法。该试纸的工作原理是利用特异性抗原-抗体的结合，用胶体金标记抗体，与待检抗原结合后，使与试纸上结合的捕获抗体显色。本发明还涉及制备上述检测试纸的制备方法。本发明能够基于一份标本和一个试纸，快速方便地检测出标本中的金葡菌肠毒素B型(SEB)，节省了大量人力物力，方便、快速、简捷。本发明涉及一种方便、快捷地检测金葡菌肠毒素B型(SEB)的检测试纸，它包含4(1)反应支持物；(2)吸水垫；(3)硝酸纤维膜，该膜包被有SEB抗体(例如兔抗SEB多克隆抗体，或SEB鼠源单抗)的检测条带和质控条带(例如羊抗兔的IgG);(4)金标抗体吸附膜，其中含有胶体金标记的兔抗SEB。本发明涉及的上述金葡菌肠毒素B型的检测试纸，它还包含样品垫。本发明涉及的上述金葡菌肠毒素B型的检测试纸，其中反应支持物选用PVC板。本发明涉及的上述金葡菌肠毒素B型的检测试纸，其中吸水垫选用滤纸。本发明涉及的上述金葡菌肠毒素B型的检测试纸，其中金标抗体吸附膜选用聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维。另一方面，本发明涉及的上述金葡菌肠毒素B型的检测试纸，其中吸水垫、硝酸纤维膜、金标抗体吸附膜、样品垫和反应支持物按照附图1所示方式构成；反应支持物5位于底层，硝酸纤维膜2位于反应支持物5上的中部，该膜的T处是兔抗SEB多克隆抗体包被的检测条带，并且C处是羊抗兔IgG包被的质控条带；金标抗体吸附膜3位于硝酸纤维膜上部的一侧并与之部分重叠，该膜含有胶体金标记的兔抗SEB多克隆抗体；吸水垫1位于硝酸纤维膜2上部的相对于金标抗体吸附膜3而言的另一侧并与2部分重叠；样品垫4位于2上与1相反的一侧并与3部分重叠。又一方面，本发明涉及的上述金葡菌肠毒素B型的检测试纸，以吸水垫一侧为起始端，样品垫一侧为末端，兔抗SEB多克隆抗体的检测条带位于接近末端，羊抗兔IgG包被的质控条带接近于起始端。本发明再一个目的是提供制备所述检测金葡菌肠毒素B型的试纸的方法，该方法包括以下步骤胶体金探针的制备，金标抗体吸附膜的制备，硝酸纤维膜的喷涂包被。1、胶体金探针的制备(1)将HAuCl4先配制为0.01%水溶液。石兹力搅拌下准确加入lml1%的HAuCl4，同时加入l.5-3ml1%的片宁檬酸三钠水溶液。颜色稳、定后继续加热，冷却至室温后加纯水补足至IOOml,4。C避光保存。5(2)用LC03调PH值为约7-9，优选为约7.8-8.9，更优选约8.2-8.5。(3)将胶体金调至pH8.2-8.5，用5mMPB(pH7.2)稀释抗体至0.2mg/ml。(4)保持胶体金稳定。本发明还在于提供一种获得维持胶体金稳定的抗体最佳标记剂量的方法，该方法包才舌a.取10支洁净的1.5ml离心管，分别加入月交体金溶液lml。b.在I-IO号管内分别加入IOpl、20)nl、30pl、40)ul、50pl、60pl、70pl、80pl、90|iil、100pl的PBS，再依次加入稀释好的O.2mg/ml的待标记抗体90pl、80jal、70pl、60pl、50pl、40pl、30pl、20pl、10pl、0pl，混匀，静置2分钟。c.在10个管内分别加入10y。NaCl溶液IOO混勾后室温静置2小时，观察颜色变化。未加抗体及加入量不足以稳定胶体金的试管中的液体颜色呈现由红变蓝的变化，而加入抗体量达到或超过最低稳定剂量的试管则保持红色不变。与对照管(1号管)相比，颜色最接近、含抗体剂量最低的试管所含的抗体剂量，即为lml胶体金所必须的抗体稳定剂量，在此基础上再加20y。抗体，即为抗体最佳标记剂量。本发明经过反复试验和分析，得出的结果表明维持胶体金溶液适宜抗体量为3-8ug,优选抗体量4-6ug，更优选4.5-5.5ug，最优选为5ug。2、金标抗体吸附膜的制备取上述pH的胶体金以lml/管分装于1.5ml的离心管中。每支管中加入3-8ug标记剂量t优选抗体量4-6ug，更优选4.5-5.5ug，最优选为5ug的抗体，轻摇混匀后放置。每管中加入10。/。的BSA100pi,混匀放置。将上面初步制得的胶体金探针在12000rpm、4。C下离心30分钟，弃上清液。每支离心管中加入lml重悬液悬浮沉淀后同上离心。弃上清液，管底得到暗红色的疏;卩>状沉淀，加入500pl重悬液重悬后于4°C,1000rpm,离心10分钟；取上清液，均匀滴加在lcm宽的玻璃纤维上，37。C干燥。3、硝酸纤维膜的喷涂包被(1)利用隔流喷金划线机以50mm/s的喷膜速度包被兔抗SEB多克隆抗体和质控羊抗兔IgG两个条带的硝酸纤维膜；在该喷涂包被膜的步骤中，喷膜速度优选是10-100mm/s，更优选是45-55mm/s，最优选是50mm/s;所述兔抗SEB多克隆抗体，其加入量为l-5mg/ml,该多克隆抗体的稀释液可以为PB;质控羊抗兔IgG可以购自鼎国生物技术公司，其浓度为0.1-5mg/ml更优选是0.5-2.5mg/ml,最优选为lmg/ml;(2)制备一种含有胶体金标记的兔抗SEB的玻璃纤维膜，将胶体金标记的兔抗SEB均匀涂布在玻璃奸维膜上。抗体用PBS稀释，pH为7-9,优选7.5-9，最适PH值为8.5。本发明还公开了所述试纸在检测金葡菌肠毒素B型中的应用，参见附图2。在本发明检测金葡菌肠毒素B型的方法中，先将待测标本放入装有稀释液的小瓶内，再用移液器将样品混合液加入试纸"4"处(即末端)，样品中的液体依靠虹吸作用上行，一般需10-15分钟判读结果如标本中含有金葡菌肠毒素B型，则它将与试纸上胶体金标记的金葡菌肠毒素B型多克隆抗体形成相应的复合物，液体展开上行并与硝酸纤维膜上的金葡菌肠毒素B型多克隆抗体结合，形成红色线条，即在"T"处形成红色条带。无论是否含有相对应的抗原，胶体金标记多克隆抗体继续随液体继续上行并与该膜上的羊抗兔IgG形成红色沉淀线，即在"C"处形成红色条带。此线是质控线，如胶体金失效，此线就不会出现，说明试纸失效。阳性结果会出现2条红色沉淀线，阴性结果出现1条红色沉淀线，如不出现线条说明试纸失效。如若肉眼无法辨别T处红色条带，可利用金标免疫分析仪进行半定量检测。本发明的技术方案是采用纯化的金葡菌肠毒素B型多克隆抗体、和羊抗兔IgG分别固相于硝酸纤维膜上，结合胶体金标记的兔抗SEB多抗，应用膜层析双抗体夹心法的原理;险测标本中的SEB。图IA本发明试纸的正面示意图。图1B本发明试纸的侧面示意图。其中，图1A和1B:1:吸水垫；2:硝酸纤维膜(T:包被兔抗SEB多克隆抗体检测条带；C:包被羊抗兔IgG的质控条带)；3:含有胶体金标记兔抗SEB多克隆抗体的玻璃纤维膜；4:样品垫；5:反应支持物。图2:检测结果示意图；T、C两条线阳性；C一条线阴性；无效。具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例l、检测金葡菌肠毒素B型的胶体金试纸的制备1、胶体金探针的制备(1)将HAuCl4先配制成0.01%水溶液,取IOOml纯水加热至沸腾。磁力搅拌下准确加入lmlP/。的HAuCU,同时加入L5ml质量分#1为1%的柠檬酸三钠水溶液。颜色稳定后继续加热煮沸15分钟，冷却至室温后加纯水补足至lGQml,4t:避光保存。(2)LC03调PH值为8.2-8.5左右。(3)将胶体金调至适宜的pH，优选8.0-8.5,更优选8.2，用5mMPB(pH7.2)稀释抗体至O.2mg/ml。2、金标抗体吸附膜的制备取pH8.2的胶体金以lml/管分装于1.5ml的离心管中。每支管中加入最佳标记剂量的抗体，轻摇混匀后放置5分钟或稍长，此步为抗体与胶体金颗粒结合。每管中加入10。/。的BSA100混匀》文置15分钟或稍长，此步为封闭。将上面初步制得的胶体金^:针以12000rpm,离心30分钟，4。C，弃上清液。每支离心管中加入lml重悬液悬浮沉淀后同上离心。弃上清液，留下管底暗红色疏松状沉淀，加入500nl重悬液重悬后于4。C,1000rpm,离心10分钟；取上清液，均匀的滴加在lcm宽的玻璃纤维上，37°干燥2.5-3小时。3、硝酸纤维膜的喷涂包被(1)利用隔流喷金划线机以50mm/s的喷膜速度包被兔抗St多克隆抗体(2mg/ml+iy。BSA)和质控羊抗兔IgG(购自鼎国生物4支术公司，lmg/ml)两个条带的硝酸纤维膜；(2)含有胶体金标记兔抗SEB5ug的玻璃纤维膜，PBS稀释；最适PH值为8.5。实施例2、金葡菌肠毒素B型检测试纸参见图1,反应支持物为6.2cmx0.4cmPCV板；吸水垫为2cmx0、4cm的滤油纸;1.8cmx0.4cm的硝酸纤维膜依次包被羊抗兔IgG(购自鼎国生物技术公司，lmg/ml)，兔抗SEB多克隆抗体2mg/ml(含有1%BSA封闭剂)，含有0.4cmx0.4cm胶体金标记的兔抗SEB多克隆抗体(标金浓度5ugPBS稀释；最适PH值为8.5)玻璃纤维膜；样品垫为2.7cmx0.4cm的玻璃纤维膜；即形成了金葡菌肠毒素B型检测试纸。实施例3、检测方法参见附图2，将待测标本与样品稀释液混匀，再用移液器将样品混合液加入试纸样品孔处，样品中的液体依靠虹吸作用上行，10-15分钟判读结果如含有金葡菌肠毒素B型抗原，则与试纸上胶体金标记的兔抗SEB多抗形成相应的复合物，上行与包被在硝酸纤维膜上的流兔抗SEB多抗结合，形成红色线条，即在"T"处形成红色条带。无论是否含有相对应的抗原，胶体金标记多抗继续向上爬行与包寻皮在膜上的羊抗兔IgG形成红色沉淀线，即在"C"处形成红色条带。此线是质控线，如胶体金失效，此线就不会出现，说明试纸失效。阳性结果会出现2条红色沉淀线，阴性结果出现1条红色沉淀线，如不出现线条"i兌明试纸失效。实施例4、DJM-3定量金标免疫分析仪半定量检测1、可先用检测法检测金葡菌肠毒素B型试纸条20个阴性值，利用金标仪检测试其T/C的比值平均计算出金葡菌肠毒素B型试纸条的定阈值。2、其次利用定阈值来用金标仪机器检测金葡菌肠毒素B型试纸条能达到的最低浓度。3、判读结果时大于或等于定阈值为阳性，小于定阈值为阴性。本实验中9得到的定阈值为0.0243。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>本发明优点本发明所述的试纸可以配合小型仪器进行半定量检测，不需专业培训，结果清晰易辨并能客观保存数据，操作简单，易于推广，适合基层，适合于突发事件的现场检测，适合流行病学调查，并对炭疽芽孢杆菌的感染诊断起到辅助作用。权利要求1、一种检测试纸，其特征在于，它包含(1)反应支持物；(2)吸水垫；(3)硝酸纤维膜，该膜包被有金葡菌肠毒素B型抗体和质控抗体的检测条带和质控条带；(4)金标抗体吸附膜，其中含有胶体金标记的金葡菌肠毒素B型抗体；(5)样品垫。2、根据权利要求1所述的试纸，其中，吸水垫选用滤纸，反应支持物选用PVC板，金标抗体吸附膜的材料选自聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维，样品垫的材料选自聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维。3、根据权利要求l一2任一项所述的试纸，其中，反应支持物(5)位于底层，硝酸纤维膜(2)位于反应支持物(5)上的中部，该膜的T处是兔抗SEB多克隆抗体包被的检测条带，并且C处是羊抗兔IgG包被的质控条带；金标抗体吸附膜(3)位于硝酸纤维膜上部的一侧并与之部分重叠，该膜含有胶体金标记的兔抗SEB多克隆抗体；吸水垫(l)位于硝酸纤维膜(2)上部的相对于金标抗体吸附膜(3)而言的另一侧并与硝酸纤维膜(2)部分重叠；样品垫(4)位于硝酸纤维膜(2)上与吸水垫(1)相反的一侧并与金标抗体吸附膜(3)部分重叠。4、根据权利要求1一3任一项所述的试纸，其中，吸水垫一侧为起始端，样品垫一侧为末端，检测抗体的条带位于接近末端，质控条带接近于起始端。5、根据权利要求1-4任一项所述的试纸，其中，所述抗SEB的抗体可以是多抗，也可是单抗；多抗可是兔抗SEB、鼠抗SEB等；质控抗体才艮据金标抗体的免疫源可选捧羊抗兔、鼠抗兔、人抗兔、兔抗羊、鼠抗羊、人抗羊、羊抗鼠、人抗鼠、兔抗鼠等的IgG。6、根据权利要求1-5任一项所述的试纸，其中，所述抗SEB多克隆抗体的浓度为3-8mg/ml。7、根据权利要求1-6任一项所述的试纸，其中，质控抗体浓度为0.1-5mg/ml。8、根据权利要求1-7任一项的试纸，其中，所述抗SEB抗体标记lml胶体金的量为5-20ug。9、一种制备权利要求1-8任一项所述的金葡菌肠毒素B型的检测试纸的制备方法，该方法包4舌(1)用隔流喷金划线机以一定喷膜速度喷涂抗SEB抗体和质控抗体两个条带的硝酸纤维膜；(2)制备一种含有胶体金标记的抗SEB抗体的玻璃纤维膜，将胶体金标记的抗SEB抗体均匀涂布在玻璃纤维膜上，并烘干或冷冻干燥。10、根据权利要求1-8任一项所述的试纸在检测金葡菌肠毒素B型中的应用，其中包括将待测标本与样品稀释液混勻，再将样品混合液加入试纸样品孔处，样品中的液体依靠虹吸作用上行，10-15分钟判读结果。11、由权利要求10所述的方法制备的检测金葡菌肠毒素B型的试纸。全文摘要本发明公开了一种检测试纸，该试纸包含(1)反应支持物；(2)吸水垫；(3)硝酸纤维膜，该膜包被有金葡菌肠毒素B型抗体和质控抗体的检测条带和质控条带；(4)金标抗体吸附膜，其中含有胶体金标记的金葡菌肠毒素B型抗体；(5)样品垫。本发明试纸可以配合小型仪器进行半定量检测，不需专业培训，结果清晰易辨并能客观保存数据，操作简单，易于推广，适合基层，适合于突发事件的现场检测，适合流行病学调查，并对金葡菌肠毒素B型的感染诊断起到辅助作用。文档编号G01N33/558GK101561435SQ20091008496公开日2009年10月21日申请日期2009年6月5日优先权日2009年6月5日发明者姜永强,孙肖红,张晓龙,宇杨,静王,胡孔新申请人:中国检验检疫科学研究院