专利名称：肠毒素生物电极及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物毒素检测技术的改进，具体讲是一种肠毒素生物电极及其制备方法，其属于生物电化学传感器技术领域。
背景技术：
金黄色葡萄球菌是人类和某些动物的病原菌，它是食物中毒的主要致病因子。其中，金葡菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的50％。金葡菌肠毒素可以污染多种食品，如牛奶、酱肉、米饭、鱼类、粉皮和熟鸡蛋等。现有的金葡菌肠毒素(简称SEC1)检测技术多利用光导纤维、压电石英晶体、声学、微波等手段，这些方法耗时费力，价格昂贵。医学研究中常用的放射免疫法测定SEC1，也非常烦琐且放射性污染严重，投资大，成本高。
(三)技术内容本发明的目的是要提供一种生物电化学传感器，即肠毒素生物电极及其制备方法，来取代上述较繁琐的检测方法。该生物电极具有制样简单，体积小，便于携带，测试时间短，响应速度快，检测灵敏度高，过程稳定，控制容易的特点。
本发明的目的是由以下技术方案实现的，研制了一种肠毒素生物电极，其包括导电的棒状基体，电镀在该基体棒端外表面上的铂黑镀层，固定在该铂黑镀层上的氧化酶膜。在该氧化酶膜上通过戊二醛耦联有肠毒素抗体膜，由该基体～铂黑镀层～氧化酶膜～肠毒素抗体膜，构成用于特异性检测试样溶液中肠毒素抗原含量的肠毒素酶免疫电极。
所述的氧化酶，其或为葡萄糖氧化酶，或为辣根过氧化物酶，或为半乳糖氧化酶，或为氨基酸氧化酶。
所述的导电的棒状基体，其或是玻碳棒状基体，或是石墨棒状基体，或是铝棒状基体。
本肠毒素生物电极的制备步骤如下(1)基体预处理选用嵌入绝缘套管中的导电基体，经金相砂纸打磨该基体棒端外表面，再用湿润的抛光粉抛光该打磨表面，再用酒精棉擦拭该打磨表面，然后在超声波清洗池中清洗5分钟，得到有洁净外表面的导电基体；(2)制备铂黑电极首先将(1)中处理后的导电基体在-300～-600mV(相对于饱和甘汞电极)电位下阴极极化，待该基体的打磨表面析出氢气20分钟后结束阴极极化；再在含2.5％K2Cr2O7和10％HNO3的氧化液中于+2.2V电位下，阳极氧化40秒，并在支持电解质中于-0.8～+0.8V范围内以20mV/s速度循环扫描30分钟；然后在-50～-500mV之间选定一恒电位，在该恒电位下将该基体投入镀铂电镀液中，电镀温度控制在20～30℃内，并以醋酸缓冲液控制电镀液的pH值在5.0～7.5之间，镀铂时间在10～60分钟，取出漂洗，即得到具有粗糙表面铂黑镀层的镀铂电极；(3)制备酶电极取适量的氧化酶溶液，滴注在镀铂电极的粗糙表面铂黑镀层上，放入冰箱过夜或室温反应1～3小时，待凉干后，用蒸馏水轻柔漂洗，漂洗时间不超过20分钟，再擦净残液后，即制得酶电极；(4)制备肠毒素酶免疫电极将(3)制备的酶电极浸入或滴上几滴1～10％的戊二醛溶液，放入冰箱过夜或室温反应30～180分钟，待凉干后取出，用蒸馏水轻柔漂洗，再将耦联有戊二醛的酶电极浸入肠毒素抗体液中反应30～60分钟，取出用蒸馏水轻柔漂洗，漂洗时间不超过10分钟，再擦净残液后，即制得肠毒素酶免疫电极。
所述的(2)制备铂黑电极的镀铂电镀液，其电镀液中含有10～50g/L的氯铂酸(H2PtCl6)和0.5～1.0g/L的弱酸性阴离子。
所述的(3)制备酶电极中滴注的氧化酶溶液，是称取一定量的氧化酶，溶解在pH5.2～5.8的醋酸缓冲溶液中，配制成10～100U的氧化酶溶液，在(3)制备酶电极中，氧化酶滴注量为15～60U。
所述的肠毒素抗体液是用pH7.0～8.0的磷酸缓冲溶液制成，配制浓度为0.2～1.8mg/ml的肠毒素抗体溶液。
本发明的优点在于，从本肠毒素生物电极的制备步骤来看，由于经过金相砂纸打磨、抛光、擦拭和超声波清洗处理的导电基体棒端外表面，再经过阴极极化和阳极氧化，使导电基体棒端有更洁净的适于电镀铂黑的外表面。由于在电镀液中含有10～50g/L的氯铂酸(H2PtCl6)和0.5～1.0g/L的弱酸性阴离子，可以有效恰当地电镀铂黑。再由于在-50～-500mV之间选定一恒电位，并控制在该恒电位下镀铂，又控制电镀温度在20～30℃范围内，并以醋酸缓冲液控制电镀液的pH值在5.0～7.5之间，三管齐下，镀铂时间在10～60分钟，使得铂黑镀层具有牢固的粗糙表面积，从而极大地提高了电极铂黑镀层的表面积，进而使得氧化酶能够更多地牢固固定(吸附)在经过镀铂修饰的基体电极表面上。镀铂效果见表1表1 不同镀铂工艺条件下的玻碳电极表面积
由于本发明肠毒素生物电极的实质是在酶电极的基础上耦联肠毒素抗体而制成的。本发明利用酶的固定化方法先将酶固定(吸附)在经过镀铂修饰的基体电极表面，然后利用双官能团交联剂——戊二醛将肠毒素抗体耦联在氧化酶上，这样即可制得酶免疫电极。本发明肠毒素生物电极的检测机理是肠毒素抗体经戊二醛与氧化酶耦联，由于肠毒素抗体与氧化酶的耦联改变了氧化酶的结构或占据了氧化酶的活性中心，从而降低了氧化酶对底物的催化作用，而肠毒素抗原与肠毒素抗体的结合又部分地恢复了氧化酶固有的构型或部分地释放了氧化酶的催化活性中心，这样就又部分地提高了氧化酶的催化活性。所以肠毒素抗原与肠毒素抗体间的免疫反应对氧化酶的活性有调制作用。肠毒素抗原与肠毒素抗体的结合调制了由氧化酶催化活性的改变而引起的介体电极响应电流的变化，从而达到检测肠毒素抗原的目的。本发明肠毒素生物电极是用来检测样品中微量(痕量)SEC1的生物传感器，其检测灵敏度最低检测下限为6ng/ml，用于检测样品浓度的数量级为ug/ml。本发明肠毒素生物电极兼有酶电极的催化放大作用和免疫电极的抗原与抗体之间分子识别反应的特异性作用，因此具有生物活性、较高的灵敏度和稳定性。用本发明肠毒素生物电极检测样品确实具有制样简单，体积小，便于携带，测试时间短，响应速度快，检测灵敏度高，易于控制的特点。
(四)附图及其实施例，本发明的实施例结合附图进一步说明如下，本发明的保护范围不仅局限于实施例中。
图1为肠毒素生物电极的结构原理示意图。
图2为不同酶量的SEC1酶免疫电极的响应特性图。
图3为不同抗体浓度的SEC1酶免疫电极的响应特性图。
参见图1，制成的一种肠毒素生物电极，其包括导电的棒状玻碳基体1，电镀在该基体1棒端外表面上的铂黑镀层2，固定在该铂黑镀层2上的葡萄糖氧化酶，或为辣根过氧化物酶的氧化酶膜3。在该氧化酶膜3上通过戊二醛耦联有肠毒素抗体膜4，由该基体1～铂黑镀层2～氧化酶膜3～肠毒素抗体膜4，构成用于特异性检测试样溶液中肠毒素抗原含量的肠毒素酶免疫电极。
本肠毒素生物电极的制备步骤如下(1)基体预处理选用嵌入聚四氟乙烯质的绝缘套管5中导电的玻碳基体1，经1#、2#、3#金相砂纸打磨该基体1棒端外表面，再用湿润的氧化铝抛光粉抛光该打磨表面，再用酒精棉擦拭该打磨表面，然后在超声波清洗池中清洗5分钟，得到有洁净外表面的导电的玻碳基体1；(2)制备铂黑电极首先将(1)中处理后的导电的玻碳基体1在-400mV(相对于饱和甘汞电极)电位下阴极极化，待该基体1的打磨表面析出氢气20分钟后结束阴极极化；再在含2.5％K2Cr2O7和10％HNO3的氧化液中于+2.2V电位下，阳极氧化40秒，并在支持电解质中于-0.8～+0.8V范围内以20mV/s速度循环扫描30分钟；然后在-250mV恒电位下，将该基体投入镀铂电镀液中，电镀温度控制在25℃±1℃，并以醋酸缓冲液控制电镀液的pH值为7.0，镀铂时间为30分钟，取出漂洗，即得到具有粗糙表面铂黑镀层的镀铂电极；(3)制备酶电极取适量的葡萄糖氧化酶溶液，滴注在镀铂电极的粗糙表面铂黑镀层上，放入冰箱过夜或室温反应1～3小时，待凉干后，用蒸馏水轻柔漂洗，漂洗时间为15分钟，再擦净残液后，即制得酶电极；(4)制备肠毒素酶免疫电极将(3)制备的酶电极浸入或滴上几滴2.5％的戊二醛溶液，放入冰箱过夜或室温反应60分钟，待凉干后取出，用蒸馏水轻柔漂洗，再将耦联有戊二醛的酶电极浸入肠毒素抗体液中反应30分钟，取出用蒸馏水轻柔漂洗，漂洗时间不超过10分钟，再擦净残液后，即制得肠毒素酶免疫电极。
所述的(2)制备铂黑电极的镀铂电镀液，其中含有30g/L的氯铂酸(H2PtCl6)和0.6g/L的醋酸根阴离子。所述的(3)制备酶电极中滴注的葡萄糖氧化酶溶液，是称取一定量的葡萄糖氧化酶，溶解在pH5.6的醋酸缓冲溶液中，配制成80U的氧化酶溶液，在(3)制备酶电极中，氧化酶滴注量为15～60U。
所述的(4)制备肠毒素酶免疫电极中，肠毒素抗体液是用pH7.2的磷酸缓冲溶液，配制浓度为0.2～1.8mg/ml的肠毒素抗体溶液。
制备本肠毒素生物电极所使用仪器是Model 273A恒电位/恒电流仪，葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，127U/mg)购自日本TOYOBO有限公司，二甲胺基甲基二茂铁(介体)购自美国Aldrich化学公司，SEC1抗体和SEC1抗原由中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所提供。本发明采用循环伏安法检测本肠毒素生物电极的响应特性。
实验中电解池采用三电极体系，研究电极为本肠毒素生物电极，参比电极为Ag/AgCl电极，辅助电极为铂丝。电解液为含2mmol/L二甲胺基甲基二茂铁和120mmol/L葡萄糖的pH7.0的磷酸缓冲溶液，待循环伏安曲线稳定后，加入不同量的SEC1抗原，记录稳定后的循环伏安曲线。
实例1在镀铂电极上分别交联30U、20U、15U、10U的葡萄糖氧化酶之后，用0.8mg/ml的SEC1抗体制成SEC1酶免疫电极，并检测不同SEC1抗原浓度的电极响应曲线，得到如图2所示的响应特性。从图2中可以看出交联30U葡萄糖氧化酶的电极灵敏度较高，这是因为酶量多，耦联的抗体量也多，检测时抗体与抗原结合的几率就大，释放的酶活性也就多，即产生的响应电流也就高，也就是灵敏度高。与之相反，交联20U葡萄糖氧化酶的电极上耦联的抗体量较少，其与抗原结合的几率就小，释放的酶活性也就少。只有当抗原浓度较大时，才能使酶的活性释放量大，所以交联20U葡萄糖氧化酶的免疫电极的灵敏度较低，但检测范围较大。交联15U和10U葡萄糖氧化酶的酶免疫电极，因为酶量少，耦联的抗体量也少，所以它们的灵敏度低，检测范围也不是很大。
实例2将交联30U葡萄糖氧化酶的酶电极，分别耦联0.8mg/ml和3mg/ml的肠毒素抗体，再测定其对不同浓度SEC1抗原的响应曲线，得到如图3所示的响应特性图。从图3中可以看出两支电极的检测范围差不多，但耦联0.8mg/ml的SEC1抗体制成的SEC1酶免疫电极灵敏度高。检测范围较接近是因为两支电极所交联的酶量相同。所以不管抗体浓度相差多大，耦联到电极上的抗体量相差不多，因此能够与抗体结合的最大抗原量就比较接近。而耦联0.8mg/ml抗体的电极灵敏度高是由于在耦联抗体的过程中，高浓度(3mg/ml)的抗体对于酶的活性抑制较大，因此使其在检测过程中酶的催化能力较弱，即加入相同量的抗原时，耦联3mg/ml抗体的电极响应电流就小。
权利要求
1.一种肠毒素生物电极，其包括导电的棒状基体，电镀在该基体棒端外表面上的铂黑镀层，固定在该铂黑镀层上的氧化酶膜，其特征在于在该氧化酶膜上通过戊二醛耦联有肠毒素抗体膜，由该基体～铂黑镀层～氧化酶膜～肠毒素抗体膜，构成用于特异性检测试样溶液中肠毒素抗原含量的肠毒素酶免疫电极。
2.根据权利要求1所述肠毒素生物电极，其特征在于所述的氧化酶，其或为葡萄糖氧化酶，或为辣根过氧化物酶，或为半乳糖氧化酶，或为氨基酸氧化酶。
3.根据权利要求1所述肠毒素生物电极，其特征在于所述的导电的棒状基体，其或是玻碳棒状基体，或是石墨棒状基体，或是铝棒状基体。
4.根据权利要求1所述肠毒素生物电极的制备方法，其特征在于该生物电极的制备步骤如下(1)基体预处理选用嵌入绝缘套管中的导电基体，经金相砂纸打磨该基体棒端外表面，再用湿润的抛光粉抛光该打磨表面，再用酒精棉擦拭该打磨表面，然后在超声波清洗池中清洗5分钟，得到有洁净外表面的导电基体；(2)制备铂黑电极首先将(1)中处理后的导电基体在-300～-600mV(相对于饱和甘汞电极)电位下阴极极化，待该基体的打磨表面析出氢气20分钟后，结束阴极极化；再在含2.5％K2Cr2O7和10％HNO3的氧化液中于+2.2V电位下，阳极氧化40秒，并在支持电解质中于-0.8～+0.8V范围内以20mV/s速度循环扫描30分钟；然后在-50～-500mV之间选定一恒电位，在该恒电位下将该基体投入镀铂电镀液中，电镀温度控制在20～30℃范围内，并以醋酸缓冲液控制电镀液的pH值在5.0～7.5之间，镀铂时间在10～60分钟，取出漂洗，即得到具有粗糙表面铂黑镀层的镀铂电极；(3)制备酶电极取适量的氧化酶溶液，滴注在镀铂电极的粗糙表面铂黑镀层上，放入冰箱过夜或室温反应1～3小时，待凉干后，用蒸馏水轻柔漂洗，漂洗时间不超过20分钟，再擦净残液后，即制得酶电极；(4)制备肠毒素酶免疫电极将(3)制备的酶电极浸入或滴上几滴1～10％的戊二醛溶液，放入冰箱过夜或室温反应30～180分钟，待凉干后取出，用蒸馏水轻柔漂洗，再将耦联有戊二醛的酶电极浸入肠毒素抗体液中反应30～60分钟，取出用蒸馏水轻柔漂洗，漂洗时间不超过10分钟，再擦净残液后，即制得肠毒素酶免疫电极。
5.根据权利要求4所述肠毒素生物电极的制备方法，其特征在于所述的(2)制备铂黑电极的镀铂电镀液，其电镀液中含有10～50g/L的氯铂酸(H2PtCl6)和0.5～1.0g/L的弱酸性阴离子。
6.根据权利要求4所述肠毒素生物电极的制备方法，其特征在于所述的(3)制备酶电极中滴注的氧化酶溶液，是称取一定量的氧化酶，溶解在pH5.2～5.8的醋酸缓冲溶液中，配制成10～100U的氧化酶溶液，在(3)制备酶电极中，氧化酶滴注量为15～60U。
7.根据权利要求4所述肠毒素生物电极的制备方法，其特征在于所述的肠毒素抗体液是用pH7.0～8.0的磷酸缓冲溶液制成的，配制浓度为0.2～1.8mg/ml的肠毒素抗体溶液。
全文摘要
本发明公开了一种肠毒素生物电极，其包括导电的棒状基体，电镀在该基体棒端外表面上的铂黑镀层，固定在该铂黑镀层上的氧化酶膜。在该氧化酶膜上通过戊二醛耦联有肠毒素抗体膜，由该基体～铂黑镀层～氧化酶膜～肠毒素抗体膜，构成用于特异性检测试样溶液中肠毒素抗原含量的肠毒素酶免疫电极。其制备步骤如下(1)基体预处理；(2)制备铂黑电极；(3)制备酶电极；(4)制备肠毒素酶免疫电极。本电极用于检测样品浓度的数量级为ug/ml。其兼有酶电极的催化放大作用和免疫电极的抗原与抗体之间分子识别反应的特异性作用，具有生物活性、较高的灵敏度和稳定性，并具有制样简单，体积小，便于携带，测试时间短，响应速度快，检测灵敏度高，易于控制的特点。
文档编号G01N27/327GK1442690SQ03111928
公开日2003年9月17日 申请日期2003年3月7日 优先权日2003年3月7日
发明者董飒英 申请人:中国船舶重工集团公司第七二五研究所