一种检测食品中金黄色葡萄球菌及肠毒素a基因的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食品安全领域，尤其涉及一种定量检测食品中金黄色葡萄球菌活菌及 肠毒素 A基因的内标PMA-qPCR方法，及其检测靶基因、引物对和探针。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)是一种重要的食源性和临床致病菌， 由其引起的食物中毒是一个世界性的卫生问题，对公共健康和食品安全带来巨大威胁。 2011年我国对速冻米面制品的《食品安全国家标准》进行了修订，其中金黄色葡萄球菌由不 得检出调整为限量检出，生制品和熟制品中金黄色葡萄球菌的最高检测限分别为l〇 4cfu/g 和103cfu/g。虽然国家限量标准进行了新的调整，但其配套的检测方法依然为传统的选择 平板培养法，该方法不仅耗时久，需要5~7天，而且操作复杂，不能满足目前对食品进行快 速风险评估以及致病菌溯源的要求。因此，食品安全监控行业急需开发一套与新国家限量 标准相配套的，快速准确定量食品中金黄色葡萄球菌的检测技术。
[0003] 荧光定量PCR(qPCR)技术，和传统培养方法相比，在检测时间、灵敏度、成本以及 高通量方面都具有很大优势，可实现对致病菌的快速定性和定量检测。但是目前应用PCR 技术检测致病菌无法区分活菌与死菌，降低了致病菌检测的准确有效性。叠氮溴化丙锭 (propidium monoazide，PM)是一种具有高亲和力的光敏反应DNA结合染料，它可以和定 量RT-PCR联合使用，进行选择性的扩增活细胞DNA，不扩增死细胞DNA，提高检测的准确有 效性。此外对于PCR检测技术，检测靶点的特异性对于致病菌的准确检测格外重要。由于 靶点序列的变异、基因水平的转移等因素，往往会导致假阴性、假阳性等误检结果，检测靶 点的特异性和数量限制了基于核酸分子检测金黄色葡萄球菌的能力。因此不断发掘新的金 黄色葡萄球菌特异检测靶点势在必行。
[0004] 多重qPCR技术能在一个反应中同时检测多种致病菌或者多个致病因子，具有更 高效快速的优势。金黄色葡萄球菌分泌的肠毒素 A被认为是引起食物中毒的最主要致病因 子，90%以上的金黄色葡萄球菌食物中毒菌株都携带肠毒素 A基因。与大部分肠毒素不同， 肠毒素 A不受群体感应系统（agr)的调控，在细菌数目比较低的时候也能产生肠毒素蛋白， 而且94ng的肠毒素 A就能导致食物中毒，因此在允许食品中较低数目金黄色葡萄球菌存在 的同时，有必要对食品中肠毒素 A基因进行检测，来评估食品中污染肠毒素 A的风险。因 此，本领域的技术人员致力于开发一种能同时检测金黄色葡萄球菌活菌和筛查肠毒素 A基 因的多重荧光定量PCR体系，来准确检测食品中金黄色葡萄球菌的污染及和肠毒素 A的筛 查。
【发明内容】
[0005] 有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种能快速定量 检测食品中金黄色葡萄球菌活菌，筛查肠毒素 A基因，并指示PCR反应假阴性PMA-qPCR检 测方法。通过一次多重qPCR就能够对食品中污染的金黄色葡萄球菌活菌进行快速定量，并 同时筛查污染的金黄色葡萄球菌是否携带有肠毒素 A基因。能同时检测金黄色葡萄球菌活 菌和筛查肠毒素 A基因的多重荧光定量PCR体系，来准确检测食品中金黄色葡萄球菌的污 染及和肠毒素 A的筛查。
[0006] 本发明不论对食品工业生产流程中金黄色葡萄球菌的监测和终产品的质量控制， 还是对政府部门食品安全的管理和监控都具有很重要的意义。
[0007] 为实现上述目的，本发明提供了一种检测食品中金黄色葡萄球菌及肠毒素 A基因 的方法，包括以下步骤：
[0008] a)对待测样品进行前处理；
[0009] b)提取待测样品中的菌体DNA，优选采用Qiagen DNA提取试剂盒；
[0010] c)以步骤（b)中提取的菌体DNA为模板，用优化建立的PMA-qPCR反应体系
[0011] 和反应条件，进行实时荧光定量Real-time PCR检测；
[0012] d)反应结束后，根据荧光定量PCR的扩增曲线和Ct值，依据预先建立的金黄色
[0013] 葡萄球菌和肠毒素 A基因的定量标准曲线，计算检验样品中金黄色葡萄球菌活
[0014] 菌数量及判定肠毒素 A基因的携带情况。
[0015] 进一步地，步骤（a)中的前处理为用PMA处理待测样品，即利用叠氮嗅化丙锭 (PM)，共价结合食品中死菌的DNA，去除死菌的DNA，达到活菌检测的目的包括以下步骤：
[0016] 1)称取食品样品，加入无菌生理盐水，样品与无菌生理盐水的质量与体积比为：
[0017] 1 :9,均质拍打100s，吸取均质液，然后10000rpm/min离心lmin，弃上清；
[0018] 2)加入 TE (10% TritonXlOO)缓冲液，TE (10% TritonXlOO)缓冲液与步骤（1)
[0019] 中的均质液体积相同，振荡混均，然后10000rpm/min离心lmin，弃上清，；
[0020] 3)加入 TE(10% TritonXlOO)缓冲液，体积为步骤⑵中 TE(10% TritonXlOO)
[0021] 缓冲液体积的一半，振荡混均后，加入PM工作液，使其终浓度为50 μ M。混
[0022] 均后，暗室孵育5min，然后置于PMA-Iite LED光分解仪器上作用15min。
[0023] 进一步地，步骤（c)中PCR反应体系包含，金黄色葡萄球菌特异检测靶点RpiR的 特异引物和探针，肠毒素 A基因的特异引物和探针，及扩增内标的模板和探针。
[0024] 进一步地，所述金黄色葡萄球菌特异检测靶基因 RpiR的碱基序列如SEQ ID NO: 1 所示。
[0025] 发掘本发明中金黄色葡萄球菌特异检测靶点RpiR过程如下：通过公用数据检索 下载搜集，建立关于金黄色葡萄球菌和非金黄色葡萄球菌的基因组数据库。选取一株金黄 色葡萄球菌的基因组作为目标基因组，然后利用本实验室开发的食源性致病菌特异靶点发 掘软件SMM-system进行金黄色葡萄球菌特异祀点的发掘。先把金黄色葡萄球菌目标基因 组在金黄色葡萄球菌基因组数据库中进行BLASTN比对，所有与金黄色葡萄球菌基因组数 据库中完全匹配的CDS序列，被判定为金黄色葡萄球菌同源的CDS序列。然后将金黄色葡 萄球菌同源CDS序列作为查询序列，进一步与由非金黄色葡萄球菌建立的本地基因组数目 库进行BLASTN比对，返回结果最低e-value多0. 1的⑶S序列最终鉴定为金黄色葡萄球菌 特异靶点序列。然后对这些筛选出来的特异靶点序列设计引物，分别进行特异性和灵敏度 评价，最后证明RpiR基因对应的引物特异性和灵敏度最佳，因此选定RpiR基因作为金黄色 葡萄球菌的检测靶标。
[0026] 从NCBI GenBank下载RpiR基因的所有核酸序列，进行同源比对分析，查找RpiR基 因的保守区域。同时从GenBank下载金黄色葡萄球菌肠毒素 A基因（sea)的碱基序列，然 后进行同源比对分析，查找该基因的保守区域。分别在RpiR和sea的保守核酸序列区域， 设计特异引物和目标探针。本发明用于检测特异靶基因 RpiR核酸保守序列以及肠毒素 A 基因的保守核酸序列的引物对如下所示：
[0027] 金黄色葡萄球菌特异检测靶点RpiR的正向引物RpiR-F序列为：
[0028] 5, -GATTGCATGATTTTTGTGACGAA-3'
[0029] 金黄色葡萄球菌特异检测靶点RpiR的反向引物RpiR-R序列为：
[0030] 5, -GGCCACCTGTGCAATTGACT-3'
[0031] 肠毒素 A基因的正向引物Sea-F序列为：
[0032] 5, -GTGGTACACCAAACAAAACAGCTT-3，
[0033] 肠毒素 A基因的反向引物Sea-R序列为：
[0034] 5' -TCTCTTCGGTCAATCGATTATTATCA-3'。
[0035] 本发明的PMA-qPCR反应体系中的目标探针序列如下所示：
[0036] 金黄色葡萄球菌特异检测靶点RpiR的探针序列为：
[0037] FAM-5, -CAAGGTAGTCATAGTGAATTG-3, -MGB ;
[0038] 肠毒素 A基因 sea的探针序列为：
[0039] VIC-5' -TGTATGGTGGTGTAACGTTA-3' -MGB ;
[0040] 扩增内标探针IAC探针序列为：
[0041] NED-5' -ATTGGTGCTGAATAGTGTGT-3' -MGB。
[0042] 发明采用DNA Random Shuffling方法改组肠毒素 A基因的探针序 列，构建扩增内标探针，5'用荧光染料NED标记，3'用MGB标记，其特征如下， NED-ATTGGTGCTGAATAGTGTGT-MGB。然后用内标探针序列替代肠毒素 A基因 PCR产物中的目 标探针序列，作为内标模板序列，使目标反应与内标反应具有大小、GC含量完全一样的PCR 产物。其特征是，内标模板序列如SEQ ID N0:3所示。在反应体系中添加扩增内标，可以有 效指示PCR反应的假阴性。
[0043] 本发明中，步骤（c)中的的反应体系各溶液比例为：Premix Ex Taq(2x): RpiR-F(IOyM) ：RpiR-F (10 μ M) ：sea-F(10yM) ：sea-F(10yM) ：Probe-l (FAM