一种检测血清中lncRNA-NEAT1的试剂盒及其在肝癌血清学诊断中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学生物检测技术领域，具体涉及一种检测血清中IncRNA-NEATl的 试剂盒及其在肝癌血清学诊断中的应用。
【背景技术】
[0002] 长链非编码RNA(long non-coding RNA，IncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编 码RNA，其表达具有明显的组织和细胞特异性，作用方式多样，可以从表观遗传、转录、翻译 等多个水平对基因表达进行调控。IncRNA能够广泛地参与细胞分化、个体发育等生命过程， 其异常表达与包括肿瘤在内的多种人类重大疾病密切相关。
[0003] IncRNA-NEATl (核旁斑组装转录本 1，nuclear paraspeckle assembly transcript 1)包括两个转录本，分别是 3. 7kb 的 NEATlvl (NR_028272. 1)和 23kb 的 NEATlv2 (HG503867. 1)，均是核旁斑的重要组成部分。核旁斑能够通过调苄基因转录、mRNA 核转位等参与调控多种生理过程如应激反应、细胞分化（参见文献Fox，A，et al.P54nrb Forms a Heterodimer with PSPlThat Localizes to Paraspeckles in an RNA-dependent Manner. Molecular Biology of the Cell，2005,16 (11) :5304 - 15.) a lncRNA-NEATl 与 肿瘤的关系也有报道，如缺氧诱导因子2(HIF-2)通过增强IncRNA-NEATl的转录从而促 进乳腺癌细胞的存活（参见文献 Choudhry H，et al. Tumor hypoxia induces nuclear paraspeckle formation through HIF-2 a dependent transcriptional activation of NEATlleading to cancer cell survival. Oncogene，2014:1-9) D 此外，lncRNA-NEATl 作 为雌激素受体的靶基因与前列腺癌的进展密切相关（参见文献Chakravarty D，et al. The oestrogen receptor alpha-regulated IncRNA NEATlis a critical modulator of prostate cancer. Nature communications, 2014, 5:1-16)。这些研宄提不了 lncRNA-NEATl 在肿瘤发生发展中的作用。
[0004] 近些年来，血清学标志物的筛选鉴定和在疾病诊断中的应用一直是医学领域的 研宄热点。非编码RNA作为血清学诊断标志物的研宄取得了很大进展，例如已有多种 microRNA被发现可以用于疾病的诊断。但是，IncRNA在血清学诊断标志物中的应用研宄还 非常少。以肝癌为例，目前肝癌诊断标志物主要是甲胎蛋白（AFP)，但有相当一部分肝癌病 人（30~40% )AFP检测结果呈阴性。目前尚缺乏其他血清学检测方法可以用来发现这部 分病人，使其失去了诊断和治疗的机会。因此，寻找和发现新的血清学标志分子弥补AFP临 床诊断的不足以提高肝癌的诊断水平，是肝癌防治研宄的重要内容。
[0005] Panzitt K等人应用PCR的方法首次在肝癌患者的血清中检测到了 IncRNA-HULC，提出其可能是一个肝癌诊断及预后判断的血清学标志物（参见文 献 Panzitt K, et al.Characterization of HULC,a novel gene with striking up-regulation in hepatocellular carcinoma, as noncoding RNA.Gastroenterolo gy, 2007, 132(1) :330-42)。
[0006] IncRNA-NEATl作为肿瘤血清学诊断标志物的价值至今尚未见文献报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种长链非编码RNA NEATl (IncRNA-NEATl)的新用途，具 体是IncRNA-NEATl作为肝癌血清学诊断标志物的应用，以及在制备肝癌血清学诊断试剂 或试剂盒中的应用。
[0008] 本发明的另一个目的在于提供一种检测血清中IncRNA-NEATl的试剂盒，及其该 试剂盒在肝癌血清学诊断中的应用。
[0009] 在前期的研宄中，本发明人所在的国际生物信号转导研宄中心利用IncRNA芯 片筛选了与肝癌干细胞相关的IncRNA，结果发现IncRNA-NEATl在肝癌干细胞中高表达 并可以调节肝癌干细胞的功能。目前认为肿瘤来源于肿瘤干细胞，因此这些结果提示 IncRNA-NEATl在包括肝癌等恶性肿瘤发生的早期即可能有作用，也提示了其在肿瘤诊断标 志物方面可能具有一定的应用价值。
[0010] 进一步地，本发明人建立了人血清中IncRNA-NEATl的检测方法和提供了血清中 IncRNA-NEATl检测的试剂盒，通过对肝癌病人血清的检测，我们首先发现在血清中能够检 测到IncRNA-NEAT 1，并且12例HCC病人血清中有2例IncRNA-NEATl含量明显高于正常人， 其中1例AFP〈400ug/L，提示IncRNA-NEATl可以作为肝癌血清学诊断标志物，并且作为AFP 肝癌诊断的补充，也提示IncRNA-NEATl在肿瘤血清学诊断中的应用前景。
[0011] 因此，我们认为，IncRNA-NEATl具备作为肝癌诊断血清学标志物的可能性。
[0012] 本发明的第一方面，提供了一种长链非编码RNA NEATl(IncRNA-NEATl)在制备肝 癌诊断标志物中的应用。
[0013] 本发明的第二方面，提供了 IncRNA-NEATl在制备诊断肝癌的检测试剂或试剂盒 中的应用。
[0014] 特别是，IncRNA-NEATl在制备诊断肝癌的血清学检测试剂或试剂盒中的应用。
[0015] 所述的检测试剂或试剂盒，是通过逆转录、实时定量PCR技术等方法检测生物样 品中IncRNA-NEATl的表达量。
[0016] 所述的检测试剂或试剂盒，包括：对IncRNA-NEATl具有检测特异性的探针、基因 芯片，或PCR引物等。
[0017] 所述的生物样品选自：获自对象的新鲜组织或细胞、福尔马林固定或石蜡包埋组 织或细胞、血液或体液等。
[0018] 所述的生物样品，优选为血清。
[0019] 所述的检测试剂或试剂盒，优选为通过定量实时PCR技术检测血清中 IncRNA-NEATl 的表达量。
[0020] 所述的对IncRNA-NEATl具有检测特异性的PCR引物如下：
[0021] 上游引物为：GGGTGGTCTGAGGAGTGATG(SEQ ID NO:15);
[0022] 下游引物为：CCTGGAAAATAAAGCGTTGGT(SEQ ID NO:16);
[0023] 本发明的第三方面，提供了一种检测血清中IncRNA-NEATl的试剂盒。
[0024] 本发明提供的一种检测血清中IncRNA-NEATl的试剂盒，该试剂盒的组成包括：
[0025] 1.逆转录系统
[0026] 由逆转录体系缓冲液、随机引物N6、dNTPs、逆转录酶和RNA酶抑制剂组成；
[0027] 2.引物系统
[0028] 由1对Real-time PCR的上、下游引物组成，引物序列如下：
[0029] 上游引物为：GGGTGGTCTGAGGAGTGATG(SEQ ID NO:15);
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