一种用于膀胱癌血清miRNA检测的内参及其检测引物与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于膀胱癌血清miRNA检测的内参，该内参为单独的hsa-miR-193a-5p，或：hsa-miR-193a-5p与hsa-miR-16-5p。本发明还公开了检测该内参的引物，包括检测hsa-miR-193a-5p（如SEQ?ID?NO：1～3所示）或/和hsa-miR-16-5p的引物（如SEQ?ID?NO：4～6所示），该内参及其引物可用于制备检测膀胱癌血清内参的试剂盒，用于膀胱癌血清miRNA内参的检测。
【专利说明】—种用于膀胱癌血清m i RNA检测的内参及其检测引物与应
用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于膀胱癌血清miRNA检测的内参及其检测引物与应用，属于分子生物学检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]膀胱癌是一类多发的泌尿生殖系统肿瘤，其在我国男性中的发病率和死亡率呈逐年上升的趋势。在膀胱癌初诊患者中，约30%为易发生转移的侵袭性膀胱癌(MIBC)，而非侵袭性膀胱癌(匪IBC)患者中仍有30%会复发为侵袭性膀胱癌。早期诊断和治疗可提高膀胱癌病人的治疗效果并改善预后，因此寻找具有较高特异性和敏感性的实用诊断方法是十分必要的。目前，临床中用于诊断膀胱癌的方法主要包括膀胱镜、尿脱落细胞学以及影像学方法等，其中，膀胱镜为诊断膀胱癌的常用方法，但其侵入性易导致膀胱及尿道损伤或感染等；尿脱落细胞学特异性高但其敏感性低且易受主观因素影响；影像学方法主要包括CT及超声检查，常用于膀胱癌诊断及术前分期，但其对膀胱内较小病变不易发现，难以用于早期诊断。因此，寻找特异性和敏感性高的早期诊断标志物，建立经济实用、安全可靠的血清学膀胱癌诊断方法成为目前的研究热点。
[0003]MicroRNA (miRNA)是一类内源性的单链非编码小RNA，由18~25个碱基组成，其通过与目的mRNA分子3’端非翻译区结合进而在转录后水平调控基因表达，由此影响细胞的增殖、分化及凋亡过程。有研究表明miRNA表达谱与肿瘤的起源和分期(stage)密切相关，提示其可作为肿瘤诊断标志物。2008年，中美科学家同步发现血液循环中稳定存在丰富的miRNA，且其性质稳定，对RNA酶、酸碱环境、长时间室温放置(> 24小时)及反复冻融均不敏感。此外，循环miRNA还有其作为肿瘤标志物的独特优势，其检测可精确定量且无需制备抗体，性价比高。不同的肿瘤具有各自特异的循环miRNA表达谱，而且其表达谱通常与肿瘤分期及分级密切相关。因此，检测循环miRNA可为肿瘤的无创性诊断与监测开辟新的途径。
[0004]目前，检测miRNA的技术已相当成熟，主要包括高通量测序技术、基因芯片技术以及实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术，其中前两者属于高通量方法，主要用于miRNA筛选， 对于所筛选出的miRNA进行准确测定则需要采用qRT-PCR技术。为得到准确的qRT-PCR结果，还需要采取标准化方法以消除实验误差并使不同实验室的结果具有可比性。常用的标准化方法主要有三种:一是在提取RNA时取等量的血清，二是在提取RNA之前向血清加入人工合成miRNA(如线虫-39，cel-miR-39)，三是采用一个或多个内源性分子作为检测血清 miRNA表达的内参。然而，取等量的血清很难保证在逆转录中加入的miRNA是等量的，而加入人工合成miRNA仅能控制在RNA提取以及cDNA合成过程中的实验误差，由此可以看出这两种方法都不能有效控制样本本身的生物学差异。与前两者不同的是，采用一个或多个内源性分子作为检测血清miRNA表达的内参不仅可以控制实验操作中的误差，还可以控制样本本身的生物学差异，具有独特的优势，因而成为业界所公认的最佳标准化方法。[0005]目前，在膀胱癌血清miRNA研究中，尚缺乏公认的较为稳定的内参分子，以往的研究者主要根据自身经验或者参考文献来选择内参分子，在不同的实验中选取的内参通常并不一致，因而制约了研究成果的转化和不同实验室之间研究成果的比较。因此，如果能够筛选出适用于膀胱癌血清miRNA检测的内参并研发出相应的试剂盒使之能够应用于科研领域，将极大地促进膀胱癌血清miRNA研究及科研成果的转化，对于膀胱癌的诊疗必将起到巨大的推动作用。
【发明内容】
[0006]针对上述现有技术，为解决现有技术中尚无一种稳定的膀胱癌血清miRNA内参分子的技术问题，本发明提供了一种用于膀胱癌血清miRNA检测的内参，并提供了检测该内参的引物、专用试剂盒、检测方法，以及在诊断、检测膀胱癌中的应用，为膀胱癌血清miRNA 研究的实验数据提供了实用可靠的标准化依据。 [0007]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0008]一种用于膀胱癌血清miRNA检测的内参，该内参为单独的hsa-miR-193a-5p，或: hsa-miR-193a_5p 与 hsa-miR-16_5p ；
[0009]所述hsa-miR-193a-5p 的序列为:5’ -UGGGUCUUUGCGGGCGAGAUGA-3’，如 SEQ ID NO:7所示；
[0010]所述hsa-miR-16-5p 的序列为:5’ -UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3’，如 SEQ ID NO: 8所示。
[0011]检测上述用于膀胱癌血清miRNA检测的内参的特异性引物，包括检测 hsa-miR-193a_5p 或 / 和 hsa-miR-16_5p 的引物，具体如下:
[0012](I)检测hsa-miR-193a_5p的引物，包括逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ ID NO:1所示，检测引物的序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示:
[0013]hsa-miR-193a_5p-RT:
[0014]5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCATCT-3’ ；
[0015]hsa-miR-193a-5p-F:5’ -GCTGGGTCTTTGCGGGCG-3’ ；
[0016]hsa-miR-193a-5p-R:5，-GTGCAGGGTCCGAGGT-3J ；
[0017](2)检测hsa-miR-16_5p的引物，包括逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ ID NO:4所示，检测引物的序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示:
[0018]hsa-miR-16_5p-RT:
[0019]5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3’ ；
[0020]hsa-miR-16-5p-F:5，-GCTAGCAGCACGTAAATA-3，；
[0021]hsa-miR-16-5p-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3?。
[0022]上述用于膀胱癌血清miRNA检测的内参在制备诊断膀胱癌的试剂盒中的应用。
[0023]上述检测用于膀胱癌血清miRNA检测的内参的引物在制备诊断膀胱癌的试剂盒中的应用。
[0024]一种检测膀胱癌血清miRNA内参的试剂盒，该试剂盒含有用于检测 hsa-miR-193a-5p的引物(如SEQ ID NO:1~3所示)，或者含有用于检测hsa-miR-193a_5p 与 hsa-miR-16-5p 的引物(如 SEQ ID NO:1 ~6 所示)。[0025]所述检测膀胱癌血清miRNA内参的试剂盒，还可以包含用于miRNA提取及qRT-PCR 反应所需的RNA分离液、PCR反应液。
[0026]进一步地，所述RNA分离液由吐温20、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、牛血清白蛋白和水组成，各组分的浓度如下:吐温20:2.5% (体积百分数)，三羟甲基氨基甲烷: 50mmol/L,乙二胺四乙酸:lmmol/L,牛血清白蛋白:1% (质量百分数),余量为水。
[0027]进一步地，所述PCR反应液由IXSyberGreen I荧光染料、DNA聚合酶、dNTPs、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁和水组成，其中，各物质的浓度如下:DNA聚合酶: 100U/mL ；dNTPs:0.2mM ;氯化镁:6mM ;三羟甲基氨基甲烷盐酸盐:16.5mM ;氯化钾:89.3mM。
[0028]利用上述检测膀胱癌血清miRNA内参的试剂盒进行检测的方法，包括以下步骤:
[0029](I)分离得到样本血清，与等体积的RNA分离液混合，1500g离心10分钟，之后 15000g离心15分钟,分离上清；
[0030](2)qRT-PCR反应:将上述分离的上清液进行反转录成cDNA，取cDNA为模板，加入引物和PCR反应液，进行qRT-PCR反应，检测样本阈值Ct (Test sample)；
[0031](3)结果判断:根据膀胱癌血清中miRNA内参hsa-miR-193a_5p及hsa-miR-16_5p 的样本阈值Ct _校正膀胱癌血清中目的miRNA样本阈值Ct 以判断目的miRNA表达水平是否有统计学意义。
[0032]本发明可用于检测膀胱癌血清miRNA内参hsa-miR-193a_5p及hsa-miR-16_5p,并可检测膀胱癌血清目的miRNA分子，其检测效能稳定可靠，可用于辅助膀胱癌血清miRNA的研究，以校正膀胱癌血清miRNA标志物的检测结果，具有准确、可靠的特点，拥有广泛的应用前景。
[0033]本发明的用于膀胱癌血清miRNA检测的内参，优点如下:
[0034](I)膀胱癌血清内参miRNA检测试剂盒可用于检测不同受试者血清中的内参 miRNA，进而确定不同受试者血清中的内参miRNA基线水平，以消除由于个体生物学差异及实验操作所导致的miRNA表达水平差异，使得真正与膀胱癌相关的miRNA表达水平差异得到凸显。
[0035](2)本发明采用了严密的设计和评价体系，首先通过Solexa测序得到血清miRNA 表达谱，从中挑选出表达稳定的miRNA，然后经qRT-PCR检测和软件计算得到最稳定的候选内参，并再次进行qRT-PCR验证。通过应用上述研究方法，保证了膀胱癌血清miRNA内参检测试剂盒研发的严谨性和可靠性。
[0036]本发明通过筛选血清中稳定表达的miRNA，寻找并验证了可用作膀胱癌血清 miRNA研究的内参。通过膀胱癌血清miRNA内参检测试剂盒的应用，可促进膀胱癌血清 miRNA研究的成果转化及不同实验室之间学术的交流，为临床医师迅速诊断病情，准确评估治疗效果和预后奠定了基础，同时也推动了小分子靶向药物治疗的研发。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1候选内参mi RNA在对照组(Control )、非侵袭性膀胱癌组(匪IBC)和侵袭性膀胱癌组(MIBC)血清中的表达水平比较。
[0038]图2hsa-miR-193a_5p、hsa-miR-16_5p 及二者组合在对照组(Control )、非侵袭性膀胱癌组(匪IBC)和侵袭性膀胱癌组(MIBC)血清中的表达水平比较。[0039]图3 利用 hsa-miR-193a_5p 及 hsa-miR-16_5p 校正后 hsa-miR-148b_3p 在膀胱;癌组(BC)及对照组(Controls)中的表达水平比较。
【具体实施方式】
[0040]下面结合实施例对本发明作进一步的阐述。
[0041]本发明的实验研究包括以下步骤:(1)以标准操作程序(SOP)采集血液标本并分离血清。(2)血清miRNA表达谱分析:选择侵袭性膀胱癌、非侵袭性膀胱癌病人和对照者(Control)血清，分别混合后检测各组血清miRNA表达谱及含量，筛选出稳定表达的候选内参miRNA用以进一步验证。(3)对候选内参分子在新的侵袭性膀胱癌组、非侵袭性膀胱癌组及对照组中进行定量检测，排除部分不符合要求的分子，对剩余分子采用软件分析，以确定各候选miRNA的稳定性。(4)血清miRNA内参检测试剂盒的研发:根据所选定的miRNA,研发内参检测试剂盒，以推动血清miRNA研究成果的转化和不同实验室之间研究成果的比较。(5)血清miRNA内参检测试剂盒实用性评价:选取在膀胱癌患者血清中高表达的hsa-miR-148b_3p作为目的分子，检测其表达水平，并以hsa-miR-193a_5p和 hsa-miR-16-5p作为内参，以评价血清miRNA内参检测试剂盒的实用性。 [0042]具体介绍如下:
[0043]实施例1标本的收集和资料整理
[0044]本发明的发明人收集了山东大学齐鲁医院2011至2013年之间250例膀胱癌患者血清样本，并同期收集了 158例对照者血清，用作Solexa测序及后续qRT-PCR筛选及验证的实验样品。
[0045](I)经病理学确诊的膀胱癌病人250例，其采血前均未经过手术及放化疗。
[0046](2 )健康男性、女性对照共158例。
[0047]系统采集了以上受试者的人口统计学资料、临床病理资料等情况。
[0048]实施例2血清miRNA的Solexa测序
[0049]测序阶段选取的样本包括10例侵袭性膀胱癌、10例非侵袭性膀胱癌和10例对照， 三组样本经Solexa测序获得相关结果(试剂盒购自ABI公司)。具体步骤为:
[0050](I)每组样本取血清15ml,加入等体积Trizol试剂并充分混匀；
[0051](2)室温放置30min，然后按每ImlTrizol试剂加入0.2ml氯仿的体积比加入氯仿， 剧烈震荡 IOs,室温 20min, 12，OOOg, 4°C，离心 15min ；
[0052](3)小心将上清转移至新的离心管中，采用3步苯酚/氯仿法去除蛋白；
[0053](4)将水相转移到新的离心管中，然后按每ImlTrizol试剂加入0.5ml异丙醇的体积比加入异丙醇，-20°C静置120min，12，000g，4°C，离心60min ；
[0054](5)用Iml Trizol试剂重悬沉淀,将悬液转移至新的离心管中；
[0055](6)重复(2)、(4)步【(4)步离心改为15min)】；
[0056](7)弃上清,加入 100% 乙醇,12, 000g, 4°C，离心 15min ；
[0057](8 )采用分光光度计测定RNA浓度；
[0058](9)利用PAGE电泳回收17_27ntRNA分子，即miRNA分子；
[0059](10)将链接引物(adaptor prime)分别酶联在miRNA分子的3'与5'端；
[0060](11)进行逆转录反应后测序；[0061](12)利用生物信息学方法，对所得膀胱癌血清miRNA表达谱进行分析。
[0062]实施例3血清miRNA的qRT-PCR筛选及验证
[0063]根据Solexa测序结果，选择符合下列标准的miRNA分子利用qRT-PCR技术进行进一步筛选:a)在侵袭性膀胱癌、非侵袭性膀胱癌和对照组中表达拷贝数均大于50 ；b)在三组均稳定表达，且三组之间无明显差异(P ^ 0.05)。根据以上标准，共选出10个符合要求的 miRNA 分子(包括 hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-10a-5p、 hsa-miR-345_5p、hsa-miR-143_3p、hsa-miR-140_3p、hsa-miR-502_3p、let-7d_3p、 hsa-miR-141-3p)。此外，由于U6常被作为组织miRNA检测的内参分子，为验证其在血清中可否作为内参，U6也作为候选分子被纳入筛选。通过对上述10个miRNA及U6采用qRT-PCR 技术在一组受试者(包括30例侵袭性膀胱癌、30例非侵袭性膀胱癌和35例对照)中进行验证(见图1)，有6个候选分子因表达水平较低而被排除(hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-345_5p、 hsa-miR-143-3p、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-502-3p 及 hsa-miR-141_3p)。对剩余 5 个分子 (hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-16_5p、let-7d_3p 及 U6),米用 Normfinder、 geNorm软件进行表达稳定性分析。整个研究过程均实施严格质控,每个样本连续检测三次且所有检测均采用盲法。
[0064](I)通过对血清miRNA直接逆转录得到cDNA。逆转录体系包括10 yl2 XmiRNA Reaction Buffer Mix (Takara 公司)，2 u I miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix (Takara 公司)，2 ill 0.l%BSA(Takara 公司)，IRNA 分离液(buffer)，I 血清。反应条件为 37°C 60min, 85°C 5s, 4°C 60min。
[0065](2) qRT-PCR反应。将cDNA用双蒸水按1:5比例进行稀释，取2 yl稀释后的 cDNA,分别加入 12.5 U I SYBR Premix Ex Taq II (Takara 公司)，0.5 U I ROX Reference Dye II (Takara 公司)，I u I Un1-miR qPCR Primer (Takara 公司)，2 u I 正向引物，2 u I ddH20进行qRT-PCR反应。所使用仪器为ABI Prism7500荧光定量PCR仪，反应条件为: 950C 30s — I 个循环；(95°C 5s,60°C 34s) — 45 个循环。
[0066](3)数据处理与分析。对每个样本血清各个miRNA分子三次检测结果(Ct值) 取平均值，排除表达水平较低(Ct值中位数大于35)的miRNA分子，对剩余分子采 用 One-wayANOVA方法分析各个miRNA在不同样本组之间是否有表达差异，运用Normf inder及 geNorm计算各个miRNA的稳定性(见表1)。由 表1可知,若采用单个miRNA作为血清内参， hsa-miR-193a-5p为稳定性最高的内参，而hsa-miR-193a_5p及hsa-miR-16_5p的组合稳定性更佳。
[0067]表1
[0068]
【权利要求】
1.一种用于膀胱癌血清miRNA检测的内参，其特征在于:该内参为单独的 hsa-miR-193a_5p,或:hsa-miR-193a_5p 与 hsa-miR-16_5p0
2.检测权利要求1所述的用于膀胱癌血清miRNA检测的内参的引物，其特征在于:包括检测 hsa-miR-193a_5p 或 / 和 hsa-miR-16_5p 的引物，如下:(1)检测hsa-miR-193a-5p的引物，包括逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如 SEQ ID NO:1所示，检测引物的序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示:hsa-miR-193a_5p-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCATCT-3’ ； hsa-miR-193a-5p-F:5’ -GCTGGGTCTTTGCGGGCG-3’ ； hsa-miR-193a-5p-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ ；(2)检测hsa-miR-16-5p的引物，包括逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如 SEQ ID NO:4所示，检测引物的序列如SEQ ID N0:5、SEQ ID NO:6所示:hsa-miR-16_5p-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3’ ； hsa-miR-16-5p-F:5’ -GCTAGCAGCACGTAAATA-3’ ； hsa-miR-16-5p-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3J。
3.权利要求1所述的用于膀胱癌血清miRNA检测的内参在制备诊断膀胱癌的试剂盒中的应用。
4.权利要求2所述的检测用于膀胱癌血清miRNA检测的内参的引物在制备诊断膀胱癌的试剂盒中的应用。
5.—种诊断膀胱癌的试剂盒,其特征在于:该试剂盒含有用于检测hsa-miR-193a-5p 的引物，如SEQ ID NO:1~3所示，或者含有用于检测hsa-miR-193a-5p与hsa-miR-16_5p 的引物，如SEQ ID NO:1~6所示。
6.根据权利要求5所述的诊断膀胱癌的试剂盒，其特征在于:所述诊断膀胱癌的试剂盒，还可以包含用于miRNA提取及qRT-PCR反应所需的RNA分离液、试剂和酶，以及标准品或/和对照品。
7.根据权利要求6所述的诊断膀胱癌的试剂盒，其特征在于:所述RNA分离液由吐温 20、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、牛血清白蛋白和水组成，各组分的浓度如下:吐温 20:2.5%，三羟甲基氨基甲烷:50mmol/L，乙二胺四乙酸:lmmol/L，牛血清白蛋白:1%，余量为水。
【文档编号】C12Q1/68GK103602747SQ201310624442
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月28日 优先权日:2013年11月28日
【发明者】王传新, 杜鲁涛, 刘益民, 张欣, 杨咏梅 申请人:山东大学齐鲁医院