一种子宫内膜癌特异性检测的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于检测子宫内膜癌的试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 子宫内膜癌作为女性生殖道三大恶性肿瘤之一，占女性生殖道恶性肿瘤的 20-30%，在某些欧美国家已居女性生殖道恶性肿瘤首位，严重威胁妇女健康。随着社会发展 和人类平均寿命的延长，内膜癌发病率逐年上升并伴有年轻化趋势。子宫内膜癌如果能做 到早期诊断，合理治疗，其预后一般较好。子宫内膜癌的主要临床表现为不规则阴道流血， 与卵巢癌等其他肿瘤不同，临床诊断主要依靠诊断性刮宫，但哺乳期或浸润型子宫内膜癌 的患者，其子宫壁薄弱，刮宫时可能会造成穿孔，给患者造成伤害。
[0003] CyclophilinA蛋白（CYPA)又称亲环素A(GeneBankNo.NP_066953)，位于胞 质及胞核，具有肽酰脯氨酰顺反式异构酶活性，参与蛋白质折叠、装配与运输；在细胞内与 环孢素A结合，抑制T细胞活化途径，表现出免疫抑制作用，此外还参与氧化应激诱导及胆 固醇代谢过程，并发挥细胞因子的功能。现有技术已经报道，通过检测人亲环素A表达水平 来早期诊断子宫内膜癌。因此，检测人亲环素A变得尤为重要。
[0004] 核酸适体(Aptamer,又称适配体，适配子）是能高亲和性、高特异性的结合某种 生物质的单链寡核酸分子（ssDNA或ssRNA)。核酸适体是通过指数富集配体系统进化技术 (SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialenrichment,SELEX)从人工合成的 DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性结合靶标分子的单链DNA/RNA。已报道核酸适 体的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子识别 功能与抗体类似，具有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种特异结合CYPA的核酸适体及其试剂盒。
[0006] 本发明提供的核酸适体，是序列表的序列1-14所示的单链DNA。
[0007] 所述核酸适体与CYPA蛋白具有较好的亲和能力。
[0008] 还可将所述核酸适体进行修饰或改造，得到所述核酸适体的衍生物。
[0009] 所述核酸适体的衍生物可为如下任意一种： a) 将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体具有相 同功能的核酸适体的衍生物； b) 将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同功能 的核酸适体的衍生物； c) 将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相同功 能的核酸适体的衍生物； d) 将核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生 物； e)将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后，得到的与所述核酸适体具有 相同功能的核酸适体的衍生物。
[0010] 所述核酸适体可用于制备检测CYPA的试剂盒。
[0011] 利用本发明的核酸适体，可以捕获中唾液中的中的CYPA，从而用于相关子宫内膜 癌筛查。利用本发明的核酸适体，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。本发明具有 很高的应用价值。
【具体实施方式】
[0012] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0013] 实施例ICYPA蛋白的获得 将Genbank:NP_066953所示的CYPA基因通过本领域常规的真核表达方式进行表达， 获得了相应的目的多肽蛋白。
[0014] 实施例2核酸适体的筛选和制备 设计两端包含大约20个核苷酸、中间包括个核苷酸的随机核酸文库如下： 5 '-ATCGTCACCATGGATACATG(N39)TTGCACAAITGGACAGTTAC-3' ；N39 代表 39 个随机 核苷酸。
[0015] 将单链DNA文库扩增为双链DNA，产物经2%琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以 回收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。75ygRNA 文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与2ugCYPA蛋白，37°C孵育 30min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液（6mol/L 尿素，0. 55mol/L醋酸铵，1.5mmol/LEDTA，0. 15%SDS)中煮沸5min，离心，取上清，无水乙 醇沉淀RNA，并重新溶解于20ylDEPC水中；以RNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转 录出RNA文库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为 模板体外转录出RNA适配子库，筛选共进行11轮。得到了 14个适配子，其序列分别为SEQ IDNO: 1-14所示。具体序列如下所示：
实施例3蛋白结合适配子的性能测定 将适配子分别取2.Oyg，用牛小肠碱性磷酸酶（CIP) 37°C消化lh，纯化回收去磷 酸化的RNA;通过T4多核苷酸激酶标记[y-32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。IOnmol 放射性标记的适配子分别与不同浓度（l_200nM)的CYPA37°C孵育30min，各组反应液经 硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品 平行做两次测定。计算各个适配子与目的蛋白的解离常数。结果如下：
实施例4所述适配子特异性分析以及稳定性分析 分别采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，pgl20蛋白，大肠杆菌外膜蛋白A，COCH蛋白，CYPA蛋白，与14条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不与这些蛋 白相结合，而只与CYPA蛋白结合保持较高的特异性。
[0016] 将所述的适配子，取0. 2ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置二周。通过 RT-PCR检测，发现三周的放置其结构稳定，没有被降解。
[0017] 实施例5所述适配子疾病的诊断 取8个子宫内膜癌患者和4个正常人的血液，使用生理盐水稀释，获得目标样本。
[0018] 将14个偶联有标记的适配子分别与8个患者以及4个正常人的分泌物混合 30min，通过生物素分离，定量分析其中的CYPA蛋白的含量，通过分析发现，8个子宫内膜癌 患者中CYPA蛋白的含量显著增加，超过了规定的阈值。达到了子宫内膜癌的诊断标准。由 此可见，其诊断效果较好。
[0019] 以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人 员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本 发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于子宫内膜癌检测的试剂盒，其含有能特异性与CYPA蛋白特异性结合的核 酸适体。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸适体的序列如SEQIDNo:1-14 任一所述。3. -种检测子宫内膜癌的方法，其特征在于利用权利要求1所述的试剂盒。
【专利摘要】本发明公开了一种特异检测子宫内膜癌的试剂盒。本发明提供的核酸适体，与人Cyclophilin？A蛋白具有较好的亲和能力。利用本发明的核酸适体，可以捕获血液中的Cyclophilin？A蛋白，通过其含量的变化来检测子宫内膜癌，将其制备成为相应的试剂盒，将用于子宫内膜癌的筛查。利用本发明的试剂盒，具有高灵敏、成本低的好处。
【IPC分类】G01N33/574
【公开号】CN105223358
【申请号】CN201510807002
【发明人】李静
【申请人】李静
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年11月22日