一种肿瘤特异性生长因子检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种肿瘤特异性生长因子检测试剂盒，包括R1试剂、R2试剂以及标准品溶液，所述R1试剂包括磷酸盐、乙二胺四乙酸二钠、凯松以及4-羟乙基哌嗪丙磺酸，其溶剂为纯化水；所述R2试剂包括显色剂、凯松、柠檬酸钠以及甘油，其溶剂为纯化水；所述标准品溶液包括A液和B液，所述A液为纯化水，所述B液为唾液酸、同型半胱氨酸以及果糖胺的混合液。本发明大大简化了检测步骤，不仅节省费用，而且实际操作简便，无需贵重仪器，极易推广。
【专利说明】一种肿瘤特异性生长因子检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及试剂盒，具体涉及一种肿瘤特异性生长因子检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]由于糖类物质可构成糖脂、糖蛋白、寡聚糖等广泛分布于细胞内外和各种体液中，在细胞发生癌变时其代谢紊乱可引起体液中的含量升高，是国际公认的肿瘤标志物；氨基酸及其代谢产物也由于其瘤种特异性小而适用于普查筛选。经长期研究，在这几种小分子的肿瘤标志物中，选定几种标志组合在一起合称为TSGF (Tumor Specific Growth ofFactor，肿瘤特异性生长因子)。当肿瘤产生时，血液中肿瘤特异性生长因子含量升高，是肿瘤的早期发现、术后及放、化疗、转移、复发的重要线索。临床试验证明，测定血清中肿瘤特异性生长因子的含量，将为肿瘤的早期发现、筛查，良恶性肿瘤的鉴别和患者病情变化的动态监测提供有效的参考依据。
[0003]联合检测几种相关的肿瘤标志物可提高肿瘤检测灵敏度已成为临床的广泛共识。福建新大陆生物技术股份有限公司于2000年初成功开发TSGF检测试剂盒，已在我国几十个大、中城市的各级医院进行了几百万例的临床验证，因其特异性及灵敏度较高而被广泛使用，发表了相关论文近五百篇。随着市场大单体检使用量的不断提高，逐渐暴露出该试剂盒使用操作的缺点:1)试剂有盐酸和醋酸成份，具有一定的刺激性，对环境及操作者都有影响；2)水浴温度精度要求高，100°C ±1°C，海拔变化及加热器的差异均会导致温度的波动，波动幅度极有可能超过1°C，致使试验结果不可靠；3)手工加样，手动比色，不仅操作繁琐，而且随机误差较大。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种准确、快速、自动化的肿瘤特异性生长因子检测试剂盒。
[0005]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:一种肿瘤特异性生长因子检测试剂盒，包括Rl试剂、R2试剂以及标准品溶液；
所述Rl试剂各组分及其在Rl试剂中的质量体积比如下:
磷酸盐3.00-3.20g/100mL
乙二胺四乙酸二钠0.59-0.6lg/1OOmL
凯松0.10-0.50g/100mL
4-羟乙基哌嗪丙磺酸0.02 -0.10 g/1OOmL
其溶剂为纯化水；
所述R2试剂各组分及其在R2试剂中的质量体积比如下:
显色剂0.08-0.25g/100mL
凯松0.10-0.50g/100mL
柠檬酸钠1.50-3.50g/100mL 甘油1.00-8.00g/100mL
其溶剂为纯化水；
所述标准品溶液包括A液和B液，所述A液为纯化水，所述B液各组分及其在B液中的质量体积比如下:
唾液酸0.10-0.20g/100mL
同型半胱氨酸0.01~0.03g/100mL
果糖胺0.05-0.08/g/100mL
其溶剂为纯化水。
[0006]优选地，所述Rl试剂各组分及其在Rl试剂中的质量体积比如下:
磷酸盐3.10g/100mL
乙二胺四乙酸二钠0.60g/100mL
凯松0.26g/100mL
4-轻乙基哌嗪丙磺酸0.05 g/1OOmL
其溶剂为纯化水；
所述R2试剂各组分及其在R2试剂中的质量体积比如下:
显色剂0.15g/100mL
凯松0.26g/100mL
柠檬酸钠2.10g/100mL
甘油5.00g/100mL
其溶剂为纯化水；
所述标准品溶液中的B液各组分及其在B液中的质量体积比如下:
唾液酸0.145g/100mL
同型半胱氨酸0.023g/100mL
果糖胺0.068g/100mL
其溶剂为纯化水。
[0007]所述磷酸盐为磷酸二氢钠。
[0008]所述显色剂为茚三酮。
[0009]本试剂盒检测肿瘤特异性生长因子的原理是，利用试剂盒内的混合液在37°C检测条件下与待测样品中的肿瘤特异性生长因子(特定带氨基基团的糖脂、糖蛋白的代谢产物及游离α-氨基酸等物质)进行叠加偶联反应，反应产物又与试剂盒中的显色剂在同一反应条件下进行显色反应，形成蓝色产物，在波长570nm处测定该显色产物的吸光度值，并通过标准浓度曲线及公式(TSGF临床浓度=100-0.18TSGF当量浓度)换算出待测样品中的肿瘤特异性生长因子含量。
[0010]本发明可在全自动生化分析仪上使用，实现了自动加样，自动比色，提高了检测的精度和效率，顺应了临床检验自动化发展趋势，具有自动化程度高、测试时间短、重复性好、误差小的优势，能够满足大样品体检的需求。
[0011]本发明采用以上技术方案，在同一检测体系下，采用试剂盒，对血清中数种恶性肿瘤生长相关的特定带氨基基团的糖脂、糖蛋白代谢产物及游离α -氨基酸等物质一次性共同显色，通过联合检测提高了检测的灵敏度和特异性，可在全自动生化分析仪上检测，实现了由手工操作转向准确、快速、方便的自动化、标准化的操作，检测效率大为提高，顺应了目前产品自动化的潮流。与其他肿瘤特异性生长因子的检测相比，本发明大大简化了检测的步骤，不仅节省费用，而且实际操作简便，无需贵重仪器，极易推广。
【具体实施方式】
[0012]一种肿瘤特异性生长因子检测试剂盒，包括Rl试剂、R2试剂以及标准品溶液；
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:一种肿瘤特异性生长因子检测试剂盒，包括Rl试剂、R2试剂以及标准品溶液；
所述Rl试剂各组分及其在Rl试剂中的质量体积比如下:
磷酸盐3.00-3.20g/100mL
乙二胺四乙酸二钠0.59-0.6lg/1OOmL
凯松0.10-0.50g/100mL
4-羟乙基哌嗪丙磺酸0.02 -0.10 g/1OOmL
其溶剂为纯化水；
所述R2试剂各组分及其在R2试剂中的质量体积比如下:
显色剂0.08-0.25g/100mL
凯松0.10-0.50g/100mL
柠檬酸钠1.50-3.50g/100mL
甘油1.00-8.00g/100mL
其溶剂为纯化水；
所述标准品溶液包括A液和B液，所述A液为纯化水，所述B液各组分及其在B液中的质量体积比如下:
唾液酸0.10-0.20g/100mL
同型半胱氨酸0.01~0.03g/100mL
果糖胺0.05-0.08/g/100mL
其溶剂为纯化水。
[0013]优选地，所述Rl试剂各组分及其在Rl试剂中的质量体积比如下:
磷酸盐3.10g/100mL
乙二胺四乙酸二钠0.60g/100mL
凯松0.26g/100mL
4-轻乙基哌嗪丙磺酸0.05 g/1OOmL
其溶剂为纯化水；
所述R2试剂各组分及其在R2试剂中的质量体积比如下:
显色剂0.15g/100mL
凯松0.26g/100mL
柠檬酸钠2.10g/100mL
甘油5.00g/100mL
其溶剂为纯化水；
所述标准品溶液中的B液各组分及其在B液中的质量体积比如下: 唾液酸0.145g/100mL
同型半胱氨酸0.023g/100mL
果糖胺0.068g/100mL
其溶剂为纯化水。
[0014]所述磷酸盐为磷酸二氢钠。
[0015]所述显色剂为茚三酮。
[0016]使用该试剂盒检测样品时，Rl试剂和R2试剂的体积比为1:1。
[0017]所述标准品溶液中A液和B液的当量浓度分别为OU/mL和200U/mL，所述lU/mL当量浓度对应的吸光度值为0.00011，即每单位标准品反应后标准吸光度值为0.00011。
[0018]实施例1
Rl试剂的配制:称取如下成分
磷酸二氢钠3.0Og
乙二胺四乙酸二钠0.59g
凯松0.30g
4-轻乙基哌嗪丙磺酸0.1Og
用纯化水溶解，配制成10mL的溶液，即为Rl试剂；
R2试剂的配制:称取如下成分茚三酮 0.08g 凯松0.50g
朽1檬酸钠 2.50g 甘油1.0Og
用纯化水溶解，配制成10mL的溶液，即为R2试剂；
标准品溶液的配制:
A液(当量浓度为OU/mL的标准品溶液)的配制:即纯化水；
B液(当量浓度为200U/mL的标准品溶液)的配制:称取如下成分
唾液酸0.1Og
同型半胱氨酸0.03g
果糖胺0.065g
用纯化水溶解,配制成10mL的溶液,即为B液。
[0019]实施例2
Rl试剂的配制:称取如下成分
磷酸二氢钠3.1Og
乙二胺四乙酸二钠0.61g
凯松0.50g
4-轻乙基哌嗪丙磺酸0.02g
用纯化水溶解，配制成10mL的溶液，即为Rl试剂；
R2试剂的配制:称取如下成分茚三酮 0.25g 凯松0.30g 朽1檬酸钠 3.50g 甘油4.50g
用纯化水溶解，配制成10mL的溶液，即为R2试剂；
标准品溶液的配制:
A液(当量浓度为OU/mL的标准品溶液)的配制:即纯化水；
B液(当量浓度为200U/mL的标准品溶液)的配制:称取如下成分
唾液酸0.15g
同型半胱氨酸0.0lg
果糖胺0.08g
用纯化水溶解,配制成10mL的溶液,即为B液。
[0020]实施例3
Rl试剂的配制:称取如下成分
磷酸二氢钠3.20g
乙二胺四乙酸二钠0.60g
凯松0.1Og
4-轻乙基哌嗪丙磺酸0.06g
用纯化水溶解，配制成10mL的溶液，即为Rl试剂；
R2试剂的配制:称取如下成分茚三酮 0.16g 凯松0.1Og
朽1檬酸钠 1.50g 甘油8.0Og
用纯化水溶解，配制成10mL的溶液，即为R2试剂；
标准品溶液的配制:
A液(当量浓度为OU/mL的标准品溶液)的配制:即纯化水；
B液(当量浓度为200U/mL的标准品溶液)的配制:称取如下成分
唾液酸0.20g
同型半胱氨酸0.02g
果糖胺0.05g
用纯化水溶解,配制成10mL的溶液,即为B液。
[0021]实施例4
Rl试剂的配制:称取如下成分
磷酸二氢钠3.1Og
乙二胺四乙酸二钠0.60g
凯松0.26g
4-轻乙基哌嗪丙磺酸0.05g
用纯化水溶解，配制成10mL的溶液，即为Rl试剂；
R2试剂的配制:
茚三酮 0.15g 凯松0.26g
柠檬酸钠 2.1Og 甘油5.0Og
用纯化水溶解，配制成10mL的溶液，即为R2试剂；
标准品溶液的配制:
A液(当量浓度为OU/mL的标准品溶液)的配制:即纯化水；
B液(当量浓度为200U/mL的标准品溶液)的配制:称取如下成分
唾液酸0145g
同型半胱氨酸0.023g
果糖胺0.068g
用纯化水溶解,配制成10mL的溶液,即为B液。
[0022]采用全自动生化分析仪进行检测时的参数选择如下:
主波长:570nm (也可选择560nm?580nm范围内的波长)
副波长:不设定(若仪器要求必须设定，则在700nm?800nm范围内设定)
反应方法:速率法反应方向:向上温度:37°C
待测样品体积与Rl、R2试剂总体积的比例根据不同型号的全自动生化分析仪选择。
[0023]延迟时间/测定时间:根据加入试剂R2后样品反应曲线中的直线区段酌情选定。
[0024]标准曲线采用两点线性定标。
[0025]采用以上实施例1的试剂盒对样品中的肿瘤特异性生长因子含量的检测如下:在全自动生化分析仪上的操作步骤如下:
(1)将Rl试剂及R2试剂放入对应的试剂位，Rl试剂和R2试剂的体积比为1:1;
(2)根据机型参数表设置上机参数；
(3)取出当量浓度分别为OU/mL(A液)以及200U/mL (B液)的标准品溶液(对应临床浓度分别为100U/mL以及64U/mL)放入标准品(校准品)固定架上，上机定标；
(4)将样品放入样本架上，上机检测。
[0026]上机检测时分三种情况:
(I)若全自动生化分析仪标准曲线设置允许负斜率定标时(如日立系列、奥林巴斯系列等)，先用公式=TSGF临床浓度=100-0.18TSGF当量浓度，将标准品由当量浓度(OU/ml和200U/ml)换算成临床浓度(100U/ml和64U/ml)后，再进行两点线性定标，所测值即为TSGF临床浓度值。
[0027](2)若全自动生化分析仪标准曲线设置不允许负斜率定标时，如果仪器允许输入公式，则输入公式(TSGF临床浓度=100-0.18TSGF当量浓度)后，进行两点线性定标，所测值也为TSGF临床浓度值。
[0028](3)若全自动生化分析仪标准曲线设置不允许负斜率定标时，且仪器不允许输入公式，则所测值为TSGF当量浓度值，将当量浓度值通过公式(TSGF临床浓度=100-0.18TSGF当量浓度)换算成临床浓度值。
[0029]检测543例正常人血清的被测物含量，检测结果呈正态分布，平均值X=49.30U/ml，标准偏差SD=7.47U/ml，采用X+l.96S来确定下限，得出参考值范围:TSGF临床浓度彡64U/ml为阳性，TSGF临床浓度< 64U/ml为阴性，各实验室可建立自己的参考范围。
[0030]采用以上实施例2至4的试剂盒对样品中的肿瘤特异性生长因子含量的检测步骤同实施例1类似，本发明不再做详细描述。
【权利要求】
1.一种肿瘤特异性生长因子检测试剂盒，其特征在于:其包括Rl试剂、R2试剂以及标准品溶液； 所述Rl试剂各组分及其在Rl试剂中的质量体积比如下: 磷酸盐3.00-3.20g/100mL 乙二胺四乙酸二钠0.59-0.6lg/1OOmL 凯松0.10-0.50g/100mL 4-羟乙基哌嗪丙磺酸0.02 -0.10 g/1OOmL 其溶剂为纯化水； 所述R2试剂各组分及其在R2试剂中的质量体积比如下: 显色剂0.08-0.25g/100mL 凯松0.10-0.50g/100mL 柠檬酸钠1.50-3.50g/100mL 甘油1.00-8.00g/100mL 其溶剂为纯化水； 所述标准品溶液包括A液和B液，所述A液为纯化水，所述B液各组分及其在B液中的质量体积比如下: 唾液酸0.10-0.20g/100mL 同型半胱氨酸0.01~0.03g/100mL 果糖胺0.05-0.08/g/100mL 其溶剂为纯化水。
2.根据权利要求1所述的一种肿瘤特异性生长因子检测试剂盒，其特征在于:所述Rl试剂各组分及其在Rl试剂中的质量体积比如下: 磷酸盐3.10g/100mL 乙二胺四乙酸二钠0.60g/100mL 凯松0.26g/100mL 4-轻乙基哌嗪丙磺酸0.05 g/1OOmL 其溶剂为纯化水； 所述R2试剂各组分及其在R2试剂中的质量体积比如下: 显色剂0.15g/100mL 凯松0.26g/100mL 柠檬酸钠2.10g/100mL 甘油5.00g/100mL 其溶剂为纯化水； 所述标准品溶液中的B液各组分及其在B液中的质量体积比如下: 唾液酸0.145g/100mL 同型半胱氨酸0.023g/100mL 果糖胺0.068g/100mL 其溶剂为纯化水。
3.根据权利要求1或2所述的一种肿瘤特异性生长因子检测试剂盒，其特征在于:所述磷酸盐为磷酸二氢钠。
4.根据权利要求1或2所述的一种肿瘤特异性生长因子检测试剂盒，其特征在于:所述显色剂为茚三酮。
【文档编号】G01N21/78GK104515768SQ201410435931
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2014年8月29日 优先权日:2014年8月29日
【发明者】宋光运, 林惠, 高冬, 林芳 申请人:湖南新大陆生物技术有限公司