一种肿瘤特异性til细胞的分离培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞培养技术领域，涉及肿瘤特异性TIL细胞(肿瘤浸润淋巴细胞)的分离培养方法。
【背景技术】
[0002]肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是存在于肿瘤组织、肿瘤引流淋巴结、癌性胸腹水中的淋巴细胞，相比于外周血淋巴细胞，TIL细胞中含有较高比例的活化的肿瘤特异性T淋巴细胞，这一类淋巴细胞经过体外分离、扩增、活化后，对肿瘤细胞的杀伤活性提高，可用于肿瘤的过继细胞免疫治疗。
[0003]使用这种技术已经取得了良好的临床效果。Rosenberg等采用全身放疗+化疗+TIL细胞治疗恶性黑色素瘤，总有效率达到了 72% (Rosenberg SA1，Dudley ME.AdoptiveCell Therapy for the Treatment of Patients with Metastatic Melanoma.CurrOpin Immunol.2009Apr;21 (2):233 - 240.) ;Li J 等采用化放疗+TIL 细胞治疗鼻咽癌，20 人中有 19 人有客观的抗肿瘤反应(Li JljChen QY2，He JljLi ZLljTang XFI，ChenSPlj Xie CM3, Li YQlj Huang LXljYe SBlj Ke Ml, Tang LQ2, Liu H2，Zhang L2，GuoSS2，Xia JClj Zhang XSlj Zheng LMljGuo X2，Qian CN2，Mai HQ2，Zeng YX4.Phase Itrial of adoptively transferred tumor—infiltrating lymphocyte immunotherapyfollowing concurrent chemorad1therapy in patients with locoreg1nalIyadvanced nasopharyngeal carcinoma.0ncoimmunology.2015Mar 6 ；4 (2):e976507.eCollect1n 2015.) ；Khammari A等用TIL细胞结合瘤内注射表达IFN-1*的腺病毒治疗恶心黑色素瘤，取得了 46%的疾病控制率(Khammari Al, Nguyen JMj Saint-Jean Mj KnolAC，Pandolfino MCj Quereux G，Brocard A, Peuvrel L，Saiagh S，Bataille V,LimacherJMj Dreno B.Adoptive T cell therapy combined with intrales1nal administrat1nsof TG1042(adenovirus expressing interferon-γ) in metastatic melanoma patients.Cancer Immunol Immunother.2015Apr 7.) 0
[0004]目前临床应用的TIL细胞的来源主要有两个方面:1.手术切除的肿瘤组织或淋巴结；2.癌性胸腹水。从手术样品中分离TIL细胞一般需要经过机械剪切，多种蛋白酶的酶解等多个步骤；癌性胸腹水来源的TIL细胞分离的方法相对简单，也容易在体外培养。
[0005]由于TIL细胞是一种异质性的细胞群，包含T细胞、B细胞、NK细胞等，其中发挥抗肿瘤作用的主要是活化的肿瘤特异性T淋巴细胞，因此TIL细胞治疗的关键技术是如何从TIL中筛选出活化的肿瘤特异性T淋巴细胞并进行扩增培养。
[0006]传统的TIL细胞分离和培养步骤复杂，整个操作时间将近2个月，其中分离和鉴定肿瘤特异性TIL细胞的过程最复杂、耗时最长。首先需要将肿瘤组织制作成小块组织或单细胞悬液，分成很多小份然后用大剂量IL-2培养，培养4-6个星期后，每份取少量细胞与肿瘤细胞进行共培养，通过测试共培养后的上清中IFN-r的含量确定哪一份里面有肿瘤特异性T淋巴细胞。然后取这些孔内的细胞进行快速扩增培养。这种操作方法步骤复杂，时间长，而且分离过程易受操作者主观因素的影响，不同的操作者操作的结果差别很大。长时间的操作过程容易导致污染，且细胞活力降低。因此很大程度地影响了 TIL细胞临床应用的效果。
[0007]因此TIL治疗的两大关键的技术，一是要从肿瘤组织中找到肿瘤抗原特异性的T淋巴细胞，并把它分离出来；二是要把这些珍贵的T淋巴细胞进行大量扩增。要把具有肿瘤特异性杀伤活性的肿瘤特异性T淋巴细胞从肿瘤组织中分离出来，需要用到一个可以区分肿瘤特异性T淋巴细胞的表面标记。肿瘤组织中的肿瘤抗原特异性T淋巴细胞是一种已经活化了的T淋巴细胞，PD-1、LAG-3和??Μ-3都是T细胞活化后诱导表达的抑制性受体，与其配体结合后抑制T细胞的活化和功能。TIL细胞中具有肿瘤特异性杀伤活性的T淋巴细胞就存在于这一群已经活化了的T淋巴细胞中(Alena Gros etc.PD-1identifies thepatient-specific CD8+tumor_reactive repertoire infiltrating human tumors.TheJournal of Clinical Investigat1n.Volume 124Number 5May 2014)。因此 PD_1、LAG_3和??Μ-3都可以作为分离TIL细胞中肿瘤特异性T淋巴细胞的标记。
[0008]免疫磁珠(Immunomagnetic bead, IMB)技术是一种免疫学技术，IMB为包被有抗体的球型磁性微粒，可特异性地与靶物质结合使之具有磁响应性。技术的优势在于可以保证被分离靶细胞的形态和功能完整，同时还具有灵敏度高、特异性高、检测速度快、重复性好、操作简单和不需要昂贵的仪器设备等优点。用IMB技术进行细胞分离由两种方式，一种是直接从细胞混合液中分离出靶细胞的方法称为阳性分离；用MB去除无关细胞使靶细胞得以纯化的方法称为阴性分离。因此利用免疫磁珠将具有肿瘤特异性杀伤活性的肿瘤特异性T淋巴细胞从TIL细胞群中直接分离出来。
[0009]目前未有文献报道利用PD-1、LAG-3和??Μ-3中的至少一种作为分离TIL细胞中肿瘤特异性T淋巴细胞的标记，并结合免疫磁珠技术将肿瘤特异性T淋巴细胞从TIL细胞群中分离出来，再经过体外高效扩增获得肿瘤特异性TIL细胞的方法。
【发明内容】
[0010]本发明的目的在于针对现有技术分离培养TIL细胞操作复杂、耗时、长时间的操作过程容易导致污染、细胞活力降低的不足，提供了一种TIL细胞的分离培养方法，该方法将具有肿瘤特异性杀伤活性的肿瘤特异性T淋巴细胞从TIL细胞群中分离出来并进行大量扩增培养，操作流程更简单，花费时间明显缩短，便于推广使用，分离得到的肿瘤特异性TIL细胞杀伤活性更强。
[0011]本发明的技术方案是:步骤一，肿瘤组织单细胞悬液的制备，即从肿瘤组织块或癌性胸腹水中获取含有肿瘤特异性T淋巴细胞的单细胞悬液；步骤二:使用免疫磁珠技术将所述单细胞悬液进行分离，即将肿瘤特异性T淋巴细胞从肿瘤细胞、肿瘤非特异性T淋巴细胞、抑制性T淋巴细胞、成纤维细胞等混合体中分离出来，得到肿瘤特异性TIL细胞；步骤三:肿瘤特异性TIL细胞的快速扩增，即将所述肿瘤特异性TIL细胞在高效扩增培养体系中进行高效扩增培养，得到大量的具有特异性杀伤肿瘤细胞活性的肿瘤特异性TIL细胞。
[0012]优选的，步骤一中，所述肿瘤组织单细胞悬液的制备，具体包括如下步骤:
[0013]1.1取肿瘤组织块，去除正常组织和坏死组织，用剪刀剪成小块组织，将这些小的组织块浸入含0.2-20mg/ml胶原酶、0.01-10mg/ml透明质酸酶、0.01-10mg/ml DNA酶的无血清RPMI 1640培养基中，缓慢摇晃孵育过夜，过滤，得到单个细胞悬液。
[0014]如果是从癌性胸腹水中获取含有肿瘤特异性T淋巴细胞的单细胞悬液不需要上述步骤1，直接进入以下步骤:
[0015]1.2单个细胞悬液或癌性胸腹水用D-Hanks平衡盐溶液洗涤，用Ficoll密度梯度法分离单个核细胞，得到肿瘤组织单细胞悬液。
[0016]优选的，步骤二中，所述使用免疫磁珠技术将所述单细胞悬液进行分离，具体包括如下步骤:
[0017]2.1往步骤一所得肿瘤组织单细胞悬液中按每I X 18个细胞加入0.4ml PBS缓冲溶液、10-500ul生物素标记或焚光染料标记(包括Cy5/Ant1-Alexa Fluor 647、Cy7、FITC、PE、APC等标记)或未标记的PD_1、LAG-3, TIM-3的抗体溶液中的至少一种、10-500ul Fe受体阻断剂、与抗体标记相对应的20-1000ul抗生物素磁珠或抗荧光染料磁珠(包括 Ant1-Cy5/Anti_Alexa Fluor647 MicroBeads>Ant1-Cy7 MicroBeads>Ant1-FITCMicroBeads、Anti_PE MicroBeads、Anti_APC MicroBeads)或抗 Ig 磁珠，混勾，重悬得细胞悬液。
[0018]2.2将所述细胞悬液加入到细胞分选柱中，利用磁性分离器收集肿瘤特异性TIL细胞。
[0019]优选的，步骤三中，所述肿瘤特异性TIL细胞的快速扩增，具体包括如下步骤:
[0020]1.将步骤二得到的肿瘤特异性TIL细胞与下列试剂和因子混合培养:CM和AIM-V混合培养基，异体辐射致死(50Gy)的PBMC，0KT3抗体。
[0021]2.第 2 天加入 IL-2 100-10000IU/ml。
[0022]3.根据细胞数进行扩瓶(袋)培养，培养基为含IL-2的CM和AIM-V混合培养基。
[0023]4.扩增培养到第7-30天，得到最终的大量的肿瘤特异性TIL细胞。
[0024]优选的，步骤三中，所述CM和AM-V混合培养基为CM培养基、AIM-V培养基按照1:1的比例混合而成。
[0025]优选的，步骤三中，所述异体辐射致死(50Gy)的PBMC与所述肿瘤特异性TIL细胞的比值为10:1-1000:1。
[0026]优选的，步骤三中，