一种cea阳性肿瘤特异性树突状细胞疫苗的制备方法
【专利摘要】本发明涉及免疫学领域,具体公开了一种腺病毒载体介导癌胚抗原CEA抗原肽基因转染制备树突状细胞肿瘤疫苗的方法，a.构建载有CEA抗原肽基因的穿梭载体质粒，并利用293细胞包装成载有CEA抗原肽基因的重组腺病毒AD-CEA,b.DC细胞的分离,培养和鉴定,c.利用重组腺病毒AD-CEA转染DC细胞，获得AdCEA-DC疫苗,c.AdCEA-DC疫苗的细胞学实验。本发明利用腺病毒作为基因载体，将CEA抗原肽基因高效转入DC细胞，通过内源性内持续刺激获得了具有高效呈递癌胚抗原CEA抗原肽能力的DC疫苗，并可以诱导特异性的CTL，解决了现有技术获得的DC疫苗呈递抗原能力较弱，特异性不强的问题。
【专利说明】一种CEA阳性肿瘤特异性树突状细胞疫苗的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫学领域。具体涉及了一种腺病毒载体介导癌胚抗原CEA抗原肽基因转染制备CEA阳性肿瘤特异性树突状细胞疫苗的方法。
【背景技术】
[0002]胃癌和大肠癌是目前我国发病率很高的恶性肿瘤，胃癌占消化道恶性肿瘤的第一位，大肠癌发病率已经上升到第四位。目前大肠癌，胃癌首选的有效治疗方法仍是手术切除，但切除率较低，复发转移较高。术后综合治疗以放疗，化疗为主，但毒副作用大，患者往往难以接受。因此，胃癌和大肠癌预后欠佳，需要寻找新的更有效的治疗方法。
[0003]随着科学的不断进展，肿瘤的生物治疗异军突起，已经成了继手术，放疗，化疗后的第四大肿瘤治疗技术，在改善患者生存质量，降低复发率方面的重要作用已经得到越来越多的认可和重视。树突细胞(dendritic cells, DC)是人体内功能最强大的专职抗原呈递细胞(antigen process cells, APC),能诱导出抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)反应,在人体抗肿瘤免疫中发挥着重要的作用。DC细胞表面的MHC分子可以和肿瘤抗原结合，然后递呈给T细胞，诱导T细胞活化，激活初始免疫应答，在体内发挥免疫监视功能。因此自从DC强大的递呈抗原功能被发现以来，就得到了人们的广泛关注，目前国内外围绕以DC为核心的抗肿瘤免疫治疗研究积累了大量的经验。不过尽管以DC为基础的免疫治疗副作用轻微，能诱导出一定的抗肿瘤免疫反应，多数研究所获得的临床效果还是 有限。
[0004]癌胚抗原(CEA)是一种广为人知的广谱肿瘤标志物。最早是在1965年由加拿大学者Gold和Freedman首先从胎儿结肠及结肠癌的提取物中发现，在多种类型的肿瘤上都有表达。人们把有CEA表达的肿瘤称为CEA阳性肿瘤，CEA阳性肿瘤包括90%以上的胃癌，肠癌，胰腺癌，70%以上的非小细胞肺癌等，目前临床上常把CEA作为大肠癌和消化道恶性肿瘤的辅助诊断指标。CEA在正常组织、癌组织和胚胎中表现出复杂的表达模式，尤其是CEA表现出选择性的上皮细胞表达。尽管CEA在一些正常组织中也有微量存在，但它在肿瘤组织中的表达远远高于正常组织。因此CEA是一种比较理想的靶抗原。然而由于CEA免疫原性弱，往往不能有效激活机体免疫系统产生针对CEA的免疫应答，故而人们一直寻求多种途径增强CEA的免疫原性。
[0005]癌胚抗原(CEA)是一种广为人知的广谱肿瘤标志物。最早是在1965年由加拿大学者Gold和Freedman首先从胎儿结肠及结肠癌的提取物中发现，在多种类型的肿瘤上都有表达。人们把有CEA表达的肿瘤称为CEA阳性肿瘤，CEA阳性肿瘤包括90%以上的胃癌，肠癌，胰腺癌，70%以上的非小细胞肺癌等，目前临床上常把CEA作为大肠癌和消化道恶性肿瘤的辅助诊断指标。CEA在正常组织、癌组织和胚胎中表现出复杂的表达模式，尤其是CEA表现出选择性的上皮细胞表达。尽管CEA在一些正常组织中也有微量存在，但它在肿瘤组织中的表达远远高于正常组织。因此CEA是一种比较理想的靶抗原。然而由于CEA免疫原性弱，往往不能有效激活机体免疫系统产生针对CEA的免疫应答，故而人们一直寻求多种途径增强CEA的免疫原性。
[0006]目前肿瘤的基因治疗也已经成了一个热点。腺病毒是一种DNA双链无包膜病毒，基因组为36kb，基因背景清楚，在美国应用多年，证明对人体是无害的。腺病毒载体以其宿主范围广，转染效率高，不整合到宿主基因组中，仅瞬时表达，安全性高，易制备高滴度腺病毒等优点而成为人类基因治疗中最理想的病毒载体之一。一般将El或E3基因缺失的腺病毒载体称为第一代腺病毒载体，El基因缺失丧失复制能力，但可以在El补偿细胞如293细胞中复制。
【发明内容】
[0007]针对现阶段应用常规方法所诱导的DC细胞受肿瘤免疫抗原性强度影响大，免疫激发力较弱等方面的不足。本发明提供了一种腺病毒载体介导癌胚抗原CEA抗原肽基因转染制备DC细胞疫苗的方法，使获得的CEA阳性肿瘤特异性DC疫苗具有更强的免疫激发能力，并且不需要制备肿瘤抗原，让DC疫苗的制备不再受肿瘤细胞来源较少，抗原蛋白成本较高的限制。
[0008]为实现上述目的，设计一种一种CEA阳性肿瘤特异性DC细胞疫苗的制备方法，该方法由以下步骤组成:
a.构建载有癌胚抗原CEA抗原肽基因的重组腺病毒AD-CEA；
b.分离和培养DC细胞；
c.采用重组腺病毒AD-CEA转染DC细胞，获得CEA阳性肿瘤特异性DC疫苗AdCEA-DC。
[0009]在所述的步骤(a)中将载有癌胚抗原CEA抗原肽基因的穿梭质粒和腺病毒骨架质粒共转染293细胞，培养至出毒，得到原代毒种；用原代毒种感染293细胞，待2-3天细胞病变后，进行浓缩纯化，获得扩增后的重组腺病毒AD-CEA。
[0010]在所述的步骤(b)中的DC细胞包括下列细胞:外周血单个核细胞培养的DC细胞，骨髓来源的DC细胞，脐带血来源的DC细胞。
[0011]在所述的步骤(C)中，包括以下步骤:
Cl:采用步骤A中制备的重组腺病毒AD-CEA病毒液感染步骤B中制备的DC细胞；
C2:采用含有GM-GSF和IL-4的完全培养液，于37°C，5%C02的培养箱中继续培养步骤Cl中感染后的DC细胞；
C3:到第5天，在步骤C2中培养的DC细胞中加入TNF-α，继续培养3天，第8天获得的CEA阳性肿瘤特异性DC细胞疫苗AdCEA-DC，光镜下形态学鉴定，并用流式细胞仪检测细胞表型 CDla，CD80，CD83，CD86，HLA-DR0
[0012]所述的步骤A中所述的重组腺病毒AD-CEA是Ad2或Ad5血清型的腺病毒，该病毒缺失El区和E3区，并且在El区位置插入了癌胚抗原CEA抗原肽基因表达盒，该表达盒依次包括:启动子序列，癌胚抗原CEA抗原肽基因编码序列，聚腺苷酸信号序列。
[0013]所述的步骤A中所述的癌胚抗原CEA抗原肽，其氨基酸序列表如SEQ ID NO:1所
/Jn ο
[0014]所述的步骤C中获得的CEA阳性肿瘤特异性DC疫苗AdCEA-DC，是通过腺病毒为载体将癌胚抗原CEA抗原肽基因转入DC细胞中获得的，可以表达癌胚抗原CEA抗原肽基因。
[0015]所述的步骤C获得的CEA阳性肿瘤特异性DC疫苗AdCEA_DC，CEA抗原肽基因阳性表达率在20%-100%。
[0016]所述的步骤C中获得的CEA阳性肿瘤特异性DC疫苗AdCEA-DC可诱导出对CEA表达阳性肿瘤细胞有特异性杀伤作用的CTL。
[0017]根据本发明，所述的载有CEA抗原肽基因的重组腺病毒AD-CEA是通过AdMax系统包装得到的。所述的DC细胞是采用Ficoll密度梯度离心法分离收集人的外周血单个核细胞，培养l_2h后弃取悬浮细胞，留下贴壁细胞得到的。所述的GM-GSF的浓度为1000U/mL，IL-4的浓度为1000U/mL，TNF-a的浓度为200U/mL。从用腺病毒AD-CEA感染分离到的DC细胞到CEA阳性肿瘤特异性DC疫苗AdCEA-DC的成熟需培养8天。
[0018]与现有技术相比，本发明创新优越之处有以下几点:首先，首次使用腺病毒载体介导癌胚抗原CEA抗原肽基因转染制备树突状细胞，获得了 CEA阳性肿瘤特异性的DC疫苗；其次，所使用的癌胚抗原CEA抗原肽基因相对CEA全长基因选择了有效序列，具有更强的特异性；再者，只是将腺病毒作为一个载体来转染DC细胞，获得成熟的DC疫苗后再用于人体，避免了腺病毒作为基因药物直接用于人体可能导致的不良免疫反应；另外，转入DC细胞的抗原基因可以持续内源表达肿瘤抗原，使本发明具有强大的免疫激发能力，可以克服肿瘤抗原直接刺激DC细胞后由于抗原复合物降解对诱导T细胞免疫应答产生的不利影响；而且，不需要制备肿瘤抗原致敏DC细胞，省去了制备抗原的成本，并且对于仅能获得少量肿瘤细胞，无法大量制备抗原的患者，更具有实用意义；最后，转入的基因具有肿瘤特异性，可避免自身抗原刺激DC细胞造成自身免疫疾病的风险。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1是质粒TOC316的图谱。 [0020]图2是腺病毒AD-CEA的产毒照片，细胞变圆，成葡萄状。
[0021]图3是普通DC和本方法所制备的CEA阳性肿瘤特异性疫苗AdCEA-DC的光镜图片；图A为对照组DC，图B为AdCEA-DC，AdCEA-DC表现出成熟DC的形态，和对照组DC差别不大，更倾向于聚集。
[0022]图4是流式细胞仪分析三组DC细胞的表面标志表达情况，本发明制备的DC疫苗AdCEA-DC的⑶80，⑶83，⑶86，⑶la，HLA-DR等表面标志表达高于蛋白致敏组和未致敏对照组。
[0023]图5是不同组DC细胞诱导的CTL对LoVo，SW620, HGC-27，BEL-7402等肿瘤细胞的杀伤活性，我们所发明方法制备的疫苗AdCEA-DC对这些CEA阳性肿瘤细胞的杀伤活性更高。*代表和对照DC组相比有显著差异，**代表和对照DC组相比有极显著差异。
【具体实施方式】
[0024]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明；本申请中的生产设备都是本领域的常用设备，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0025]实施例1:
(一)构建载有癌胚抗原CEA抗原肽基因的重组腺病毒AD-CEA:
1.构建含有癌胚抗原CEA抗原肽基因的穿梭质粒H)C316-CEA:CEA的氨基酸序列来自GeneBank公布的CEA氨基酸和核苷酸序列M17303，根据本公司的预测结果，选择癌胚抗原CEA抗原肽为CEA580-CEA639短肽片段基因，共60个氨基酸，其氨基酸序列表如SEQ ID NO:1所示。
[0026]根据GeneBank中的序列设计引物，进行PCR获得癌胚抗原CEA抗原肽基因，和PDC316质粒【图1】连接获得含有癌胚抗原CEA抗原肽基因的穿梭质粒H)C316-CEA。
[0027]2.将构建的穿梭质粒H)C316-CEA和腺病毒骨架质粒转染293细胞，具体步骤如下:
(1)提前一天将293细胞种6孔板，每孔5X105cells/mL密度的细胞2mL，这样到转染前293细胞的密度约为80% ；
(2)每个转染孔取腺病毒骨架质粒4μ g，PDC316-CEA穿梭载体质粒I μ g，加300 μ LOpt1-mem无血清培养基混合均匀，室温放置5min ；
(3)取10μ L脂质体Lipofectamine2000用300 μ L Opt1-mem无血清培养基混合均匀，室温放置5min ；
(4)将两者混合，室温放置20min，再将混合物加入细胞中。放在37°C,5% C02培养箱中孵育；
(5)6小时后，更换新鲜的5%血清DMEM培养基。
[0028]3.原代重组腺病毒AD-CEA的收获，具体步骤如下:
(1)转染后第3天，将长满的293细胞用胰蛋白酶消化传代到T25培养瓶中，用5%血清DMEM培养基继续培养；
(2)到第五天的时候补加IOmL新鲜的5%血清DMEM培养基；
(3)约到第7天会观察到出毒现象，细胞变大变圆，呈葡萄状【图2】；
(4)继续培养到第11天，细胞大部分病变并脱落，将已出毒的培养瓶放在_70°C冰箱到37°C水浴反复冻融3次；取冻融液5000r/min离心5min，收集上清即得到原代毒种；
4.重组腺病毒AD-CEA的扩增，具体步骤如下:
(1)提前两天将293细胞传代，每个T25瓶放入4X105cells/mL密度的细胞5mL，这样用于病毒扩增的293细胞密度约为90% ；
(2)将原代病毒取ImL加入瓶中感染293细胞，此时的MOI大约为5；
(3)放在在37°C，5%C02培养箱中培养，2天后大部分细胞会发生病变，呈葡萄状。收集细胞并重悬于ImL PBS缓冲液；
(4)将细胞重悬液于-70°C冰箱到37°C水浴反复冻融3次，5000r/min离心5min收集上清，0.22 μ m滤膜过滤后即得到扩增后的重组腺病毒AD-CEA，分装后储存在_70°C冰箱。
[0029]
(二)采用重组腺病毒AD-CEA转染DC细胞，获得CEA阳性肿瘤特异性DC疫苗AdCEA-DC: 1.DC细胞的获取和分离，具体步骤如下:
Cl)取人外周血50mL，肝素抗凝，加入50mL生理盐水得到IOOmL稀释血液。将IOOmL稀释血液缓缓加到50mL淋巴细胞分离液上，2000r/min水平离心20min，取中间的白色细胞层即获得单个核细胞(PBMC)；
(2)用RPMI1640培养基将单个核细胞制成细胞悬液，以4X 106cellS/mL的密度加入6孔培养板中，在37°C，5 % C02条件下培养2h，轻轻洗去悬浮细胞，剩下的细胞即为DC细胞。[0030]2.重组腺病毒AD-CEA转染DC细胞及后续处理，具体步骤如下:
(1)将剩下的贴壁DC细胞分为3组:基因转染组，蛋白致敏组和未致敏对照组；
(2)基因转染组中洗去悬浮细胞后，加入ImL无血清RPMI1640培养基。然后在其中加入AD-CEA病毒液IOOuL (MOI=IOO),于37°C，5 % C02条件感染5h后，更换成2mL含GM-GSF (1000U/mL)的 RPMI 1640 完全培养基；
(3)其余两组每孔用2mL含GM-GSF(1000U/mL)的RPMI1640完全培养基培养。
[0031]3.三组细胞的后续处理，具体步骤如下:
(1)到第三天，三组细胞均加入终浓度为1000U/mL的IL-4，隔天半量更换含有GM-CSF和IL-4的培养液；
(2)到第五天各组除了更换含有GM-CSF和IL-4的培养液外，蛋白致敏组需加入CEA蛋白(I μ g/mL)每孔IOOuL ;未致敏对照组加入PBS缓冲液每孔100uL。三组同时都要加入终浓度为 200U/mL 的 TNF- α。
[0032]4.重组腺病毒AD-CEA转染获得CEA阳性肿瘤特异性DC疫苗AdCEA-DC的收获及鉴定，具体步骤如下:
(1)继续培养三天，到第八天即成熟【图3】。收集三组DC细胞，用50mL生理盐水重悬。1500r/min水平离心10min后,弃上清重新用50mL生理盐水重悬沉淀细胞,共洗3遍；
(2)最后用适当量生 理盐水重悬洗过3遍的细胞沉淀，调整DC细胞密度在5X106cells/mL，获得三组DC细胞；
(3)DC标志物的鉴定:培养8d的细胞数为5X106cells/mL的基因转染组DC、蛋白致敏组DC和未致敏组DC各取50 μ L，加入1:20的灭活兔血清10 μ L，4°C冰箱孵育lOmin，分别加入荧光抗体 10 μ L(FITC-ant1-CDla、PE-anti_CD83、FITC-anti_CD80、PE-anti_CD86、PE-ant1-HLA-DR)，4°C暗处反应30 min, PBS洗涤3遍后，震荡悬浮细胞后流式细胞仪检测其表面标志表达情况【图4】。
[0033](4)重组腺病毒AD-CEA转染DC效率的检测:收集基因转染组DC，用PBS缓冲液洗2次，取细胞数为5X105置于流式细胞仪专用试管中，加入小鼠抗人CEA单抗(I / 200)，二抗用FITC标记的兔抗鼠单抗10uL，4°C冰箱中避光反应30 min,再用PBS洗3次，震荡悬浮细胞后上流式细胞仪分析病毒感染效率。
[0034]
(三)AdCEA-DC疫苗的细胞体外实验:
1.细胞毒性淋巴T细胞(CTL)的诱导，具体步骤如下:
Cl)以含人血清的RPMI 1640为培养基，取三组不同的DC细胞和自体T淋巴细胞，按DC:T细胞=1:20的比例混合，调节细胞浓度为2Χ 106cells/mL，96孔板每孔加入100 μ L ；
(2)使用含有 IL-2 (500U/mL)，GM-GSF(1000U/mL)和 IL-4 (1000U/mL)的 RPMI1640 培养液除继续培养5天，期间每隔I天，进行半量换液，获得3组不同的CTL。
[0035]2.三组CTL对几种CEA阳性肿瘤细胞的体外特异性杀伤效应，具体步骤如下:
(1)收集3组CTL作为效应细胞，分别以LoVo(人结肠癌细胞株)，SW620(人结肠癌细胞株)，HGC-27 (人胃癌细胞株)为CEA阳性靶细胞，BEL-7402 (人肝癌细胞株)为阴性靶细胞；
(2)取96孔板，将靶细胞以lX105cellS/mL的密度每孔接入100μ L，培养3天后靶细胞长满，设定不同的效靶比加入不同的CTL，效靶比为20:1，每种效靶比设3个复孔，每孔终体积含培养液200 μ L ;
(3)继续在37°C ,5% C02培养箱中孵育44 h，然后每孔加入20 μ L 5mg/mL的MTT混匀。继续培养4 h后，将培养液吸干，每孔加入二甲基亚砜IOOuL,震荡15min后在酶标仪上测570 nm处OD值。通过所测OD值，以及单纯效应细胞和单纯靶细胞为阴性对照所测OD值，利用公式算得CTL的杀伤活性。
[0036]CTL杀伤活性=靶细胞对照组OD值-(实验组OD值-效应细胞对照组OD值)/靶细胞对照组O D值【图5】。
【权利要求】
1.一种CEA阳性肿瘤特异性DC细胞疫苗的制备方法，其特征在于包括如下工艺步骤: a.构建载有癌胚抗原CEA抗原肽基因的重组腺病毒AD-CEA； b.分离和培养DC细胞； c.采用重组腺病毒AD-CEA转染DC细胞，获得CEA阳性肿瘤特异性DC疫苗AdCEA_DC。
2.根据权利要求1所述的CEA阳性肿瘤特异性DC细胞疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤(a)包括如下工艺步骤: al:将载有癌胚抗原CEA抗原肽基因的穿梭质粒和腺病毒骨架质粒共转染293细胞，培养至出毒，得到原代毒种； a2:用原代毒种感染293细胞，待2-3天细胞病变后，进行浓缩纯化，获得扩增后的重组腺病毒AD-CEA 。
3.根据权利要求1所述的CEA阳性肿瘤特异性DC细胞疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤(b)中的DC细胞包括下列细胞:外周血单个核细胞培养的DC细胞，骨髓来源的DC细胞，脐带血来源的DC细胞。
4.根据权利要求1所述的CEA阳性肿瘤特异性DC细胞疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤(c)包括如下工艺步骤: cl:采用步骤(a)中制备的重组腺病毒AD-CEA病毒液感染步骤(b)中制备的DC细胞； c2:采用含有GM-GSF和IL-4的完全培养液，于37°C，5%C02的培养箱中继续培养步骤(Cl)中感染后的DC细胞； c3:到第5天，在步骤(c2)中培养的DC细胞中加入TNF-α，继续培养3天，第8天获得的CEA阳性肿瘤特异性DC细胞疫苗AdCEA-DC，光镜下形态学鉴定，并用流式细胞仪检测细胞表型 CDla，CD80, CD83, CD86, HLA-DR0
5.根据权利要求1所述的CEA阳性肿瘤特异性DC细胞疫苗的制备方法，其特征在于:步骤(a)中所述的重组腺病毒AD-CEA是Ad2或Ad5血清型的腺病毒，该病毒缺失El区和E3区，并且在El区位置插入了癌胚抗原CEA抗原肽基因表达盒，该表达盒依次包括:启动子序列，癌胚抗原CEA抗原肽基因编码序列，聚腺苷酸信号序列。
6.根据权利要求1所述的CEA阳性肿瘤特异性DC细胞疫苗的制备方法，其特征在于:步骤(a)中所述的癌胚抗原CEA抗原肽的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
7.根据权利要求1所述的CEA阳性肿瘤特异性DC细胞疫苗的制备方法，其特征在于:步骤(c)中获得的CEA阳性肿瘤特异性DC疫苗AdCEA-DC，是通过腺病毒为载体将癌胚抗原CEA抗原肽基因转入DC细胞中获得的，可以表达癌胚抗原CEA抗原肽基因。
8.根据权利要求1所述的CEA阳性肿瘤特异性DC细胞疫苗的制备方法，其特征在于:步骤(c)中用来感染DC的重组腺病毒AD-CEA的使用MOI值为50-1000。
9.根据权利要求1所述的CEA阳性肿瘤特异性DC细胞疫苗的制备方法，其特征在于:步骤(c)中获得的CEA阳性肿瘤特异性DC疫苗AdCEA-DC，CEA抗原肽基因阳性表达率在20%-100%ο
10.根据权利要求1所述的CEA阳性肿瘤特异性DC细胞疫苗的制备方法，其特征在于:步骤(c)中获得的CEA阳性肿瘤特异性DC疫苗AdCEA-DC可诱导出对CEA表达阳性肿瘤细胞有特异性杀伤作用的CTL。
【文档编号】A61K39/00GK104001185SQ201310059166
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2013年2月26日 优先权日:2013年2月26日
【发明者】付建喜, 叶永清, 苏国新 申请人:上海柯莱逊生物技术有限公司