一种树突状细胞疫苗及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学生物工程技术领域，具体涉及一种树突状细胞疫苗及其制备方法 与应用。
【背景技术】
[0002] 肝癌（HCC)是一种原发性的肝脏恶性肿瘤，在全世界常见的癌症相关死因中名列 第三。绝大多数肝细胞癌次发于病毒性感染（乙型肝炎或丙型肝炎）或肝硬化（酒精中毒 为肝硬化最常见的原因）。手术为治愈提供最大的可能，但是只有10-20%的肝癌能彻底被 手术根除。很多不能进行肝癌（即HCC)手术或术后发生转移复发的病人会接受化/放疗。 不幸的是，HCC是一种对常规化疗药剂抗药性很强的肿瘤，放疗也很少奏效。所以肝癌给个 人、家庭和社会带来很大的负担。
[0003] 近十年来积累的科学证据显示在包括HCC在内的各种恶性肿瘤中，存在被称为癌 症干细胞（CSC)或癌症起始细胞（CIC)的一种细胞亚群。CSC数量很少，却具备很强的肿瘤 生成能力。CSC具有干细胞的特性，能进行自我更新并产生表型多样的肿瘤细胞群。这些肿 瘤生成细胞对维持肿瘤生长和启动远距离转移起关键作用。在临床方面，CSC被认为是肿 瘤对主要常规治疗方法（包括化疗和放疗）产生抗药性的主要原因。在对原发性肿瘤进行 手术切除和放疗化疗后，肿瘤复发和转移的病例很常见。这有可能是因为手术及放化疗手 段均未能成功地消灭CSC，而导致CSC再次催生恶性肿瘤。现有许多的肿瘤免疫疗法都是针 对已分化的肿瘤细胞的抗原。这些抗原可能只是选择性的在分化的肿瘤细胞表达，CSC并 不一定表达这些抗原，因此CSC能逃过这些免疫治疗的捕杀。很多研究表明肿瘤干细胞是 HCC生成、复发、和转移的主要原因，也是目前肝细胞癌治疗失败的主要原因。因此，采用以 CSC为目标的治疗策略是阻止肿瘤转移和复发的关键手段。
[0004] 致癌性转化和通过重新编程所引导的多能干细胞（iPSC)衍生之间的高度相似性 已在医学界引起一定的关注：即二者都可以被一系列的遗传和表观遗传修饰诱导和利用类 似的基因调控网络。从体细胞分化为多能干细胞过程中，细胞获得无限增殖和自我更新的 活动属性，这两个特点对于癌细胞来说是最重要的。事实上有研究表明，多能干细胞的基因 表达谱与多种类型的肿瘤，以及它们在致癌性过程中的基因表达谱有共同之处，也就是说 多能干细胞重编程与致癌性转化利用了一些共同机制。0ct4的异位表达可依赖剂量性地 增加胚胎干细胞的恶性癌变潜能，足以诱导小鼠体内肿瘤细胞的形成。S0X2被确定为放大 的宗族生存基因，它存在于肺和食管鳞状癌细胞中。多能性相关因子的表达增加通常会在 分化状况差的肿瘤细胞中被检查出来。这表明了这些肿瘤细胞已经拥有了未分化过的干细 胞特性。在临床上，亚型癌症的0ct4和Sox2表达的增加与侵袭性病程相关，如未分化的组 织、抵抗治疗、转移、复发、缩短患者的生存率。因为这些相关性，这两种蛋白已被提议作为 长时间后复发和患者预后出现不良状况的新预测。
[0005] 最近的直接证据表明0ct4和Sox2基因与癌干细胞有关。在来源相同的几种癌症 中比较，这两种蛋白质在癌干细胞（CSCs)中的表达水平明显比在相对分化的癌症细胞高。 在源自肺癌的⑶133阳性细胞内，0ct4的表达是维持癌症干细胞特性的必须条件。在恶性 胶质瘤中，抑制癌干细胞中的Sox2表达可减缓CSC细胞的增殖，及使其失去致癌性。在骨 肉瘤里，一个肿瘤细胞亚群被证实能够激活外源性0ct4报告基因，而且比其它的亚群更容 易衍生出由0ct4阳性和0ct4阴性细胞所构成致癌性更大的异质性肿瘤。在正常乳腺细胞 中异位表达0ct4的可导致肿瘤细胞的形成，而且能在裸鼠中形成细胞分化度低、肿瘤分类 等级高的乳腺癌乳腺癌。在上皮性卵巢癌，从原发肿瘤中分离的干细胞有较高的0ct4表达 水平。在大肠癌细胞中，多能干细胞基因的异位表达可使细胞成型、增殖、克隆成型和人类 大肠癌细胞迀移，而且癌症细胞中的多功能干细胞基因表达可以用于预测癌症患者的存活 率。这些研究结果表明，一些多功能干细胞基因可以作为肿瘤干细胞诱导主要调节因子，以 及维护肿瘤干细胞特性的关键因素。鉴于0ct4和Sox2在在致癌性细胞和癌干细胞中的高 水平表达和高活性，但在正常组织中的表达有限，它们是免疫干预的潜在目标。考虑到临床 观察发现0ct4、Sox2和很多其它CSC标记物的上调与HCC病人预后不良有关。
[0006] 但众所周知，肝癌干细胞在肝癌组织中所占的数量很少，而且从原发性肝肿瘤中 分离出的肝癌干细胞在体外培养时会迅速分化为非肝癌干细胞。所以要获取充足的肝癌干 细胞来制备针对肝癌干细胞的树突状细胞癌症疫苗是一个关键的技术瓶颈。
【发明内容】
[0007] 为此，本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中肝癌干细胞在肝癌组织中 所占的数量很少，特异性表达很弱的技术瓶颈，从而提供一种特异性强、能高水平地表达肝 癌干细胞的分子标记物的肝癌干细胞株。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明公开了一种树突状细胞疫苗，所述树突状细胞疫苗 的制备使用0ct4和Sox2基因高表达的肝癌细胞株.0ct4和Sox2基因高表达是通过在肝 癌细胞株基因组的AAVSl位点中特异性插入这俩个基因来取得的。
[0009] 进一步的，所述的制备树突状细胞疫苗的肝癌细胞株中，所述AAVSl位点位于 基因编码的蛋白磷酸酶1调节亚基内，调节位于人类基因组的19号染色体亚基12C，即 ppplrl2c上；是非致病性腺相关病毒的特异性结合位点2型。
[0010] 优选的，所述的制备树突状细胞疫苗的肝癌细胞株中，所述0ct4基因序列长度为 1080 ;所述Sox2基因序列长度为951。
[0011] 优选的，所述的树突状细胞疫苗，所述树突状细胞疫苗将肝癌干细胞通过细胞诱 导技术诱导扩增而来。
[0012] 更为优选的，所述的树突状细胞疫苗，所述肝癌干细胞是由修改后的肝癌细胞，通 过肿瘤干细胞球体形成法富集而来。
[0013] 本发明还公开了一种制备所述的疫苗的方法，所述方法包括如下步骤：
[0014] (1)采用杆状病毒-锌指核酸酶技术向肝癌干细胞株基因组的AAVSl位点中插入 0ct4和Sox2基因，制备得到修改后的肝癌细胞；
[0015] (2)对所述的修改后的肝癌细胞，采用肿瘤干细胞球体形成法富集类肝癌干细胞， 提升肝癌干细胞标记物的表达；
[0016] (3)由自体血分离制备单核细胞，加入细胞因子诱导扩增抗原递呈树突状细胞，然 后用类肝癌干细胞冻融裂解液刺激树突状细胞以获得负载肝癌干细胞抗原的抗原递呈树 突状细胞。
[0017] 本发明还公开了任一所述疫苗和所述方法在肝癌免疫领域的应用。
[0018] 本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
[0019] (1)本申请采用锌指核酸酶技术向HCC细胞基因组中插入了 0ct4和Sox2基因，从 基因上改变这些癌细胞，促使非肿瘤生成癌细胞向分化程度更低的肿瘤干细胞逆分化，从 而产生一群具有肿瘤起始能力的细胞，赋予它们类CSC特性。本发明的重编程技术方法采 用以杆状病毒转染为基础的锌指核酸酶技术，将0ct4和Sox2基因特异性插入到人19号染 色体上的AAVSl位点（19ql3. 3-qter)上。ZFN技术（锌指核酸酶技术）对人类细胞的遗传 操作是有效的。最近出版的医学刊物报告了非集成杆状病毒载体的使用，它被用于共同传 递锌指核酸酶和一种将基因编辑在人类基因组上不同位点的DNA供体模板。
[0020] (2)选取的AAVSl位点位于基因编码的蛋白磷酸酶1调节亚基（抑制剂）内，调节 位于人类基因组的19号染色体（19ql3. 3-qter)亚基（抑制剂）12C (ppplrl2c)。这个轨迹 是非致病性腺相关病毒的特异性结合位点（AAV) 2型。该点是一个安全点，因为当某一区域 遭到破坏时，也不会对人体细胞产生明显的表型影响。AAVSl有一个开放的染色质结构，它 的两侧有绝缘体元素，能够防止稳定整合的转基因被反式激活或抑制。事实证明，转基因在 AAVS1位点的整合体可产生细胞中强劲和持久的表达。
[0021] (3)本发明采用肿瘤干细胞球体形成法，从修改过的肝癌细胞中富集了类肝癌干 细胞，显著提升CD13、CD90和E