浆细胞样树突状细胞的耗竭的制作方法

浆细胞样树突状细胞的耗竭的制作方法
【专利摘要】本发明涉及耗竭浆细胞样树突状细胞(pDC)的靶向BDCA2的抗体和使用所述抗体治疗与pDC有关的病症的方法。
【专利说明】浆细胞样树突状细胞的耗竭
[0001] 相关申请 本申请要求2013年12月16日提交的美国临时申请号61/916,322的权益。本申请的全部 内容通过引用完全结合到本文中。
[0002] 联邦支持声明 本发明在政府的支持下，按照国家卫生研究院授予的资助号AI077454下进行。政府具 有对本发明的一定权益。 发明领域
[0003] 本发明涉及耗竭浆细胞样树突状细胞(pDC)的靶向BDCA2的抗体和使用所述抗体 治疗与PDC有关的病症的方法。
[0004] 发明背景 浆细胞样树突状细胞(pDC)是生产有效的I型干扰素（IFN-I)的细胞(Siegal et aL， ?Scie/jce 2财:1835 (1999))并参与控制各种病毒性感染（Cervantes-Barragan et a_/.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109\?>Q12 (2012); Takagi et al.. Immunity J5:958 (2011); Liu, Annu. Rev. Immunol. 23\ 275 (2005); Swiecki et al., Immunity 33: 955 (2010))。然而，pDC在人免疫缺陷病毒-1 (HIV-1)感染和发病机制中的影响仍然是有 争议的。在一方面，pDC已显示通过IFN-I生产抑制HIV-1复制（Yonezawa et a_/.，上 Virol. 77:3777 (2003); Fong et al., J. Virol. 7^:11033 (2002)；Gurney et al., J717269 (2004))。此外，HIV-1感染患者中pDC的数目和功能下降与独立于 0)4+ T-细胞计数的机会性感染相关（Siegal et a^.，XC/ifl.Zorest. 7(9:115 (1986); Feldman et al., Cl in. Immunol. 101:201 (2001)；Lichtner et al., Curr. HIV Res. A 19 (2008))。另一方面，pDC可能促成HIV的免疫发病机制。在HIV-1感染患者中持续的pDC 激活和IFN-I生产与病毒控制无关，但是为疾病进展的预兆(Buimovici-Klein et a入， Lancet J?:344 (1983) ；Buimovici-Klein et al., AIDS Res. J?:99-108 (1986)；Meier et a_/.，TVature ifec/icioe 25:955 (2009))。另外，pDC在致病的亚洲猴(恒河猴和食蟹猴） 和非-致病的非洲猴(乌白眉猴(Sooty mangabeys)和非洲绿猴)二者中的猴免疫缺陷病毒 (SIV)感染急性期期间被激活。然而，pDC激活在非致病的SIV感染中被迅速地控制，而其激 活和IFN-I生产在亚洲猴的致病性感染期间持续（Lederer et a_/.，PZoS'PatAogefls 5: e100 0296 (2009)；Bosinger et al., J. Clin. Invest. 775:3556 (2009)；Jacquelin et al., J. Clin. Invest. 119:354：4： (2009) ；Harris et al., J. Virol. 84:7886 (2010);Campill〇-Gimenez etaL，上 KiroL 财：1838 (2010))。因此，在HIV和pDC之间 的相互作用是不清楚的。
[0005] 本发明通过提供在受试者中耗竭pDC并治疗与pDC有关的病症的抗体解决本领域 以前的缺点。
[0006] 发明简述 本发明部分基于抗体的鉴定，当将该抗体给予受试者时，其特异性地结合于m)CA2 (血 液树突状细胞抗原-2)并耗竭pDC (如，减少pDC的数量）。本发明还基于这些抗体在受试者 中耗竭pDC和在受试者中治疗与pDC有关的病症中的用途。
[0007] 因此，在一方面，本发明涉及在受试者中耗竭pDC的方法，其包括递送给受试者特 异性地结合BDCA2并耗竭pDC的抗体或其片段，从而耗竭pDC。
[0008] 在另一方面，本发明涉及在受试者中治疗与pDC有关的病症的方法，其包括递送给 受试者特异性地结合BDCA2并耗竭pDC的抗体或其片段，从而治疗所述病症。
[0009] 在一个另外的方面，本发明涉及特异性地结合BDCA2并耗竭pDC的抗体或其片段在 制备用于治疗与PDC有关的病症的药物中的用途。
[0010] 在另一个实施方案中，本发明涉及特异性地结合BDCA2并耗竭pDC的抗体或其片段 治疗与pDC有关的病症的用途。
[0011] 在进一步的方面，本发明涉及抗体或其片段，当将所述抗体或其片段给予受试者 时，其特异性地结合于BDCA2并耗竭pDC。
[0012] 在本发明以下的描述中更详细地阐述本发明的这些和其它方面。
[0013] 附图简述 图la-lf显示在用致病的HIV-R3A分离株感染的人源化小鼠中的HIV-1感染和免疫-发 病机制。（a)在得自用lng p24/小鼠的R3A接种小鼠（/3 =10)的血浆中的病毒RNA基因组拷 贝数。（b)在外周血和脾中经FACS测定的HLA-DR+⑶38+⑶8 T细胞(⑶3+⑶4-⑶8+)的百分 比的汇总数据。（c)在总⑶3+ T细胞中的相对⑶4+ T细胞(CD3+⑶8-⑶4+)的汇总数据。（d) 在来自未感染的对照小鼠=3)和R3A-感染的小鼠（/3 =10)的脾中绝对CD4 T-细胞、CD8 T-细胞和hu⑶45+细胞数的比较。（e)通过luminex测定的、自未感染的(n=3)和感染的(n= 3) DK〇-hu小鼠的血浆中的IFN-a2生产。（f)在脾(/3 =3)的huCD45+细胞中的Mxl和TR頂22 基因表达的相对水平。点图中的所有条表示中值。误差条（Error bars)表示标准偏差 (SD)。*和林分别表示p〈0 ? 05和p〈0 ? 01。
[0014]图2显示在通过定量实时PCR (/3 =10)测定的、个体CCR5-向性的JR-CSF-感染的 DK〇-hu小鼠中的病毒血症的动力学。
[0015] 图3a-3c显示在DK〇-hu小鼠的急性R3A感染和慢性JR-CSF感染中的CD8 T细胞激 活。（a)在R3A-感染的小鼠感染后3周的外周血和脾中HLA-DR+⑶38+⑶8 T细胞的百分比 的代表性FACS图。（b)在JR-CSF-感染的小鼠感染后18周的外周血和脾中HLA-DR+CD38+ ⑶8 T细胞的百分比的代表性FACS图。（c)对补充图2b的汇总数据。模拟物n=4; JR-CSF n= 1 〇。点图中的所有条表示中值。**表示P〈〇. 〇 1。
[0016] 图4a-4c显示在DK〇-hu小鼠的急性R3A感染和慢性JR-CSF感染中的CD4 T细胞耗 竭。（a)在R3A-感染的小鼠感染后3周的外周血和脾中的CD4 T细胞(CD8-CD4+)的百分比的 代表性FACS图。（b)在R3A-感染的小鼠感染后18周的外周血和脾中的⑶4 T细胞(CD8-CD4 + )的百分比的代表性FACS图。（c)对于补充图3b的汇总数据。模拟物n=4; JR-CSF n=10。点 图中的所有条表示中值。**表示P〈〇. 〇 1。
[0017 ]图5a-5 C显示在R5-向性的JR-CSF-感染的人源化小鼠感染后3周终结的I型IFN应 答和HIV发病机制。（a)自未感染的对照小鼠（/3 =4)和JR-CSF-感染的小鼠（/3 =10)的脾中 绝对⑶4 T-细胞，CD8 T-细胞和人⑶45+细胞数的比较。（b)在通过luminex测定的、自未感 染的（n=3)和感染的（n=3)人源化小鼠的血浆中IFN-a2的生产。（c)从脾中分离的人CD45+ 细胞的Mxl和TR頂22基因表达的相对水平。点图中的所有条表示中值。误差条表示标准偏差 (SD)。*和林分别表示p〈0 ? 05和p〈0 ? 01。
[0018] 图6a-6b显示在DK〇-hu小鼠中由15B介导的pDC的耗竭。（a-b)人源化小鼠用15B或 者同种型对照（同种)抗体处理，总人白细胞(CD45+)的pDC (CD4+CD123+)百分比经FACS分 析。（a)代表性的FACS图和汇总数据显示在抗体处理前后外周血(n=7)中的相对pDC频度。 (b)代表性FACS图和汇总数据显示在肠系膜淋巴结(mLN，同种型n=4;15B n=5)和脾(SP，同 种型n=4;15B n=5)中通过15B导致的pDC耗竭。点图中的所有条表示中值。误差条表示标准 偏差（SD)。*和林分别表示p〈0 ? 05和p〈0 ? 01。
[0019] 图7a-7c显示在DK〇-hu小鼠的不同淋巴器官中由15B诱导的特异性pDC耗竭。（a) 代表性FACS图显示在hu⑶45+细胞中⑶3+⑶19-细胞和⑶3-⑶19+细胞的百分比。（b-c)对 图7a的汇总数据。点图中的所有条表示中值。
[0020] 图8a-8b显示在DK〇-hu小鼠的不同淋巴器官中由15B诱导的特异性pDC耗竭。（a) 代表性FACS图显示在hu⑶45+细胞中⑶3-⑶14+细胞的百分比。（b)对于图8a的汇总数据。 [0021] 图9a-9b显示在DK〇-hu小鼠的不同淋巴器官中由15B诱导的特异性pDC耗竭。（a) 代表性FACS图显示在hu⑶45+细胞中⑶3-⑶llc+细胞的百分比。（b)对于图9a的汇总数据。 点图中的所有条表示中值。
[0022] 图10a-10d显示pDC的耗竭在DK〇-hu小鼠的急性HIV-1感染期间消除IFN-I诱导。用 15B或同种型对照（同种)抗体处理人源化小鼠。在pDC耗竭后，用HIV-R3A感染人源化小鼠并 在感染后8天(dpi)终止以供分析。（a)经FACS分析的在总人白细胞(⑶45+)中的pDC (⑶4+ CD123+)百分比的汇总数据。模拟物，=6;同种型+R3A，/3 =9;15B+R3A，=12。（13)模拟 物、HIV-1感染的和15B处理的小鼠的血浆IFNa2通过Luminex分析定量。模拟物，=3;同种 型+R3A，/3 =5;15B+R3A，/2 =5。（(：-(1)在得自小鼠脾的纯化人细胞(CD45+)中的IFN-I和干扰 素刺激的基因的mRNA水平通过实时PCR测定。模拟物，=3;同种型+R3A，/3 =5;15B+R3A，/2 = 5。点图中的所有条表示中值。误差条表示标准偏差(SD)。*和**分别表示p〈0.05和p〈0.01。 [0023] 图1 la-l le显不pDC的预先-耗竭促进HIV-1复制。人源化小鼠在pDC耗竭后3天用 HIV-1感染并在8dpi (R3A，a-b)或感染后3周(JR-CSF，c-e)终止。（a)血浆HIV-1 RNA水平 (基因组拷贝# x logl0/ml)通过实时PCR分析。同种型+R3A，/3 =9;15B+R3A，/2 =12。（13)对 脾中p24阳性细胞的免疫组织化学染色。（c)在感染后3周，通过实时PCR分析血浆JR-CSF HIV-1 RNA水平(基因组拷贝# x logl0/ml)。同种型+JR-CSF，/3 =12;15B+JR-CSF，/3 =12。 (d)在感染后3周对脾中p24阳性⑶4 T细胞的代表性FACS图。（e)相对p24+ T细胞的汇总 数据。同种型+JR-CSF，/3 =7;15B+JR-CSF，/3 =7。点图中的条表示中值。*表示p〈0.05。
[0024] 图12a-12d显示在具有升高的HIV-1感染的pDC-耗竭小鼠中的升高的CD38+DR+CD8 T细胞。（a)代表性FACS图显示在8 dpi，在外周血和脾中，CD38和HLA-DR在由R3A感染诱导 的⑶8 T细胞中的表达。（b)对图4a的汇总数据。（c)代表性FACS图显示在感染后3周由JR-CSF感染诱导的⑶8 T细胞激活。（d)对图4c的汇总数据。模拟物，=6;同种型+R3A，/3 =9; 15B+R3A，=12。点图中的所有条表示中值。*和林分别表示p〈0.05和p〈0.01。
[0025]图13a_13b显示⑶8 T细胞在脾中的激活和病毒载量之间的相关性。相关性用斯皮 尔曼非参数检验（Spearman nonparametric test)分析。同种型+R3A，/? =9; 15B+R3A，/?= 12。二乘相关系数(r)和P值被示出。
[0026] 图14a_14e显示pDC的预先-耗竭减少HIV-1免疫发病机制。人源化小鼠在pDC耗竭 后3天用HIV-R3A感染并在8 dpi终止。（a-c)在外周血和脾中的人T细胞或总白细胞的细胞 计数。（a) CD4 T细胞(CD3+CD8-)计数。（b) CD8 T细胞(CD3+CD4-CD8+)计数。（c)总人CD45 +白细胞计数。（d-e)代表性直方图和汇总数据显示在脾中死亡的CD4 T细胞、CD8 T细胞和 人CD45+细胞的百分比。模拟物，=6;同种型+R3A，/3 =9;15B+R3A，/2 =12。点图中的所有条 表示中值。*和**分别表示P〈〇 ? 05和p〈0 ? 01。
[0027] 图15a_15c显示pDC的预先-耗竭减弱HIV-1发病机制。人源化小鼠在pDC耗竭后3天 用HIV-1感染并在感染后3周终止。（a-c)在外周血和脾中的人T细胞或总白细胞的细胞计 数。（a) CD4 T细胞（CD3+CD8-)计数。（b) CD8 T细胞(CD3+CD4-CD8+)计数。（c) huCD45+白 细胞计数。模拟物，=4;同种型+JR-CSF，/3 =8;15B+JR-CSF，/3 =7。点图中的所有条表示中 值。*表示p〈〇.〇5。
[0028] 图16a_16g显示pDC的耗竭增加HIV-1复制，但减弱在慢性HIV-1感染期间HIV-1免 疫发病机制。HIV-1感染的人源化小鼠在感染后11周用15B处理并在感染后21周终止(模拟 物，=6;JR-CSF+PBS，/3 zlOdR-CSF+lSBir^^da)在每一时间点的血浆HIV-1 RNA水平 (基因组拷贝# x loglO/ml)通过实时PCR分析。（b)汇总数据显示在脾中HIV p24阳性⑶4 T细胞(CD3+CD8-)的百分比。（c-e)在外周血和脾中的人T细胞或总CD45白细胞的细胞计 数。（c) CD4 T细胞（CD3+CD8-)计数。（d) CD8 T细胞（CD3+CD4-CD8+)计数。（e)人CD45+白 细胞计数。（f)对脾中人CD45+细胞的免疫组织化学染色。（g)汇总数据显示脾中死亡的 ⑶4 T细胞、⑶8 T细胞和人⑶45+细胞的百分比（JR-CSF感染在21 wpi终止）。点图中的条表 示中值。*和**分别表示P〈〇 ? 05和p〈0 ? 01。
[0029] 图17a-17f显示pDC的耗竭增加 HIV-1复制，但在慢性感染中减少I型IFN应答。HIV-1感染的人源化小鼠在感染后11周用15B开始处理并在感染后21周终止。（a)对于图6b的代 表性FACS直方图。（b)通过Luminex测定的、从模拟物(/3 =4)、JR-CSF+PBS (/3 =5)和JR-CSF + 15B (/3 =5)在感染后11周（前)或者在感染后21周（后）的血浆中生产IFN-aSjc-d)在得 自小鼠脾的纯化人细胞(CD45+)中的IFN-I和干扰素刺激基因的mRNA水平通过实时PCR ( =5)测量。（e-f)终止时来自脾的纯化人CD45+细胞(e)和CD8 T细胞(CD3+CD4-CD8+) (f)中 的相对ISG基因表达。点图中的所有条表示中值。误差条表示标准偏差(SD)。*和**分别表示 口〈0.05和？〈0.01。
[0030] 图18显示15B的重链的核苷酸序列（SEQ ID N0:1)和氨基酸序列（SEQ ID N0:2)。 [0031] 图19显示15B的轻链的核苷酸序列（SEQ ID N0:3)和氨基酸序列（SEQ ID N0:4)。 [0032] 图20显示在DKO-hu小鼠中由12B(也称为125)介导的pDC的耗竭。
[0033] 图21显示12B的重链的核苷酸序列（SEQ ID N0:5)和氨基酸序列（SEQ ID N0:6)。 [0034] 图22显示12B的轻链的核苷酸序列（SEQ ID N0:7)和氨基酸序列（SEQ ID N0:8)。 [0035] 发明详述 本发明现在将参照附图更详细地加以描述，其中示出本发明的优选的实施方案。然而， 本发明可以不同的形式体现且不应视为限于本文提出的实施方案。更确切的说，提供这些 实施方案以使本公开内容将是充分的和完整的，并将本发明的范围完全地传达至本领域技 术人员。
[0036]除非本文另外表示，可特别打算将在此描述的本发明的各个特征以任何组合使 用。此外，本发明还认为，在本发明的一些实施方案中，在此提出的任何特征或特征的组合 可被排除在外或省略。为举例说明，如果本说明书陈述:一种复合物包含组分A、B和C，它具 体地是指A、B或C的任何一个，或其组合，可被省略和单独或以任何组合的方式放弃。
[0037] 除非另外限定，本文所用的全部技术和科学术语具有本发明所属领域技术人员通 常理解的相同意义。用于本发明的说明书的术语仅仅是为了描述具体实施方案的目的并不 打算限制本发明。
[0038] 核苷酸序列在此仅以单链，从左至右以5'至3'方向呈现，除非另外地特别指明。核 苷酸和氨基酸在此通过IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的方式，或(对于氨基酸）用一个字 母的代码，或者三个字母代码来表示，二者均按照37 C.F.R. §1.822和已建立的用法。
[0039] 除了如另有说明外，本领域技术人员已知的标准方法可用于克隆基因、扩增和检 测核酸等。这样的技术是本领域技术人员已知的。见例如，Sambrook et a入，Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第2版.(Cold Spring Harbor, NY, 1989)；Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates, Inc. 和John Wiley & Sons, Inc.， New York)。
[0040] 对于参考文献中提供的句子和/或段落有关的教导，本文引用的所有出版物、专利 申请、专利、专利出版物和其它参考文献通过引用以其全文结合到本文中。
[0041 ] I ?定义 如本发bM说明书和所附权利要求书所用的，单数形式"一"、"一个"和"该"意欲还包 括复数形式，除非文中另外清楚地指明。
[0042] 同样如本文所用的，"和/或"指和涵盖一个或多个有关的所列项目的任何和所有 可能的组合，以及当以可供选择的方式（"或"）解释时则缺乏组合。
[0043] 如本文所用的术语"约"，当涉及到一个可测量的值如多肽、剂量、时间、温度、酶促 活性或其它生物学活性等的量时，意欲涵盖特定量的± 20%、± 10%、± 5%、± 1%、土 0.5%，或甚至± 0.1%的变化。
[0044] 连接词"基本上由...组成"意指要求保护的范围应被解释为包括在权项中叙述的 特定材料或步骤，以及对本发明要求保护的"基本和新颖的特征没有实质影响的那些材料 或步骤'见在re "erz, 537 F.2d 549，551-52，190 USPQ 461，463 (CCPA 1976)(在 原文中的重点）；也见MPEP § 2111.03。
[0045] 术语"基本上由...组成"（及语法变体），当应用于本发明的多核苷酸或多肽序列 时，意指由所列序列（如，SEQ ID N0)和在所列序列的5'和/或3'或N-末端和/或C-末端上的 总共10个或更少的（如，1、2、3、4、5、6、7、8、9,或10)个另外的核苷酸或氨基酸二者组成的多 核苷酸或多肽，以致多核苷酸或多肽的功能实质上没有改变。总共10个或更少的另外的核 苷酸或氨基酸包括两端上另外的核苷酸或氨基酸加在一起的总数。术语"实质上改变"，当 应用于本发明的多核苷酸时，指如与由所列序列组成的多核苷酸的表达水平比较，表达编 码的多肽的能力增加或下降至少约50%或更多。术语"实质上改变"，当应用于本发明的多肽 时，指如与由所列序列组成的多肽活性比较，表位结合活性提高或下降至少约50%或更多。
[0046] 如本文所用的"有效的"量是提供所需效果的量。
[0047]如本文所用的"治疗有效的"量是提供给受试者一些改善或益处的量。或者说，"治 疗有效的"量是提供受试者的至少一种临床症状的一些缓解、减轻或减少(如，在HIV感染的 情况下，病毒载量减少或免疫细胞增加)的量。本领域技术人员将意识到治疗效果不必是完 全或治愈的，只要有一些益处提供给受试者。
[0048]所谓术语"治疗"、"医疗"或"处理"，意指受试者的病症的严重性减少或至少部分 地改善或改进和实现至少一种临床症状的一些缓解、减轻或减少。
[0049]如本文所用的涉及pDC的术语"耗竭"，指在受试者或样品中的pDC的数量的可测量 的减少。所述减少可以是至少约10%，如至少约20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、 96%、97%、98%、99%，或更多。在某些实施方案中，该术语指受试者或样品中的pDC的数量下降 至低于可检出限度的量。
[0050] 如本文所用的短语"与pDC有关的病症"，指其中pDC在疾病、病症或病况的病因、副 作用、症状或其它方面起作用的任何疾病、病症或病况。这样的病症的实例包括(不限于)感 染性疾病、自身免疫性病症和癌症。
[0051] 如本文所用的术语"感染性疾病"，指任何与感染性病原体感染有关的疾病。感染 性病原体的实例包括(不限于)病毒和微生物。病毒包括(不限于)肝脱氧核糖核酸病毒科， 包括肝炎4、13、0、0、￡、？、6等;黄病毒科，包括人丙型肝炎病毒(11(^)、黄热病病毒和登革热病 毒;逆转录病毒科，包括人免疫缺陷病毒(HIV)和人嗜T淋巴细胞性病毒(HTLV1和HTLV2);疱 疹病毒科，包括单纯疱疹病毒(HSV-1和HSV-2)、爱泼斯坦巴尔病毒(Epstein Barr virus) (EBV)、巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、人类疱疹病毒6 (HHV-6)、人类疱疹病毒8 (冊7_8)，和13疱疹病毒;乳多空病毒科(？3卩0￥3￥；[1^(136)，包括人乳头瘤病毒;弹状病毒科， 包括狂犬病毒;副粘病毒科，包括呼吸道合胞病毒;呼肠孤病毒科(Reoviridae)，包括轮状 病毒;布尼亚病毒科(Bunyaviridae)，包括汉坦病毒;纤丝病毒科(Filoviridae)，包括埃博 拉病毒;腺病毒科;细小病毒科，包括细小病毒B -19;沙粒病毒科(Arenaviridae)，包括拉沙 病毒;正粘病毒科，包括流感病毒;痘病毒科(卩(《￥；[1^(136)，包括羊痘病毒(0奸￥；[1'118)、传 染性软疏病毒（molluscum contageosum virus)、天花病毒和猴痘病毒；披膜病毒科 (Togaviridae)，包括委内瑞拉马脑炎病毒;冠状病毒科(Coronaviridae)，括冠状病毒如严 重急性呼吸综合征(SARS)病毒;和小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)，包括脊髓灰质炎 病毒;鼻病毒;环状病毒(orbiviruses);极小DNA病毒(Picodnavirusess);脑心肌炎病毒 (EMV);副流感病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、麻疹病毒、风疹病毒、人乳头瘤病毒、犬 痕热病毒（Canine distemper virus)、犬传染性肝炎病毒、猫萼状病毒（Feline calicivirus)、猫鼻气管炎病毒(Feline rhinotracheitis virus)、TGE病毒(猪）、口蹄疫 病毒、猿猴病毒5、人副流感病毒2型、人metapneuomovirus、肠病毒，和任何其它现在已知的 或后来鉴定的致病病毒(见，如，Kiroiogy, Fields et al.，Eds?，第3版， Lippincott-Raven, New York, 1996,其对致病病毒的讲述的全部内容通过引用结合到本 文中）。
[0052]致病的微生物包括，但不限于，立克次氏体、衣原体、分枝杆菌、梭菌属、棒状杆菌、 支原体、脲原体、军团菌、志贺氏菌、沙门氏菌、致病性大肠杆菌(i?scAericAia co^i)菌株、 博德特氏菌(Bordate 1 la )、奈瑟氏菌、密螺旋体、杆菌属、嗜血杆菌属、莫拉氏菌、弧菌属、葡 萄球菌（Staphylococcus spp.)、链球菌（Streptococcus spp.)、弯曲菌（Campylobacter spp ?)、伯氏疏螺旋体（Borrelia spp ?)、钩端螺旋体（Leptospira spp ?)、埃里希体 (Erlichia spp.)、克雷伯氏菌属(Klebsiella spp.)、假单抱菌(Pseudomonas spp.)、螺杆 菌(Helicobacter spp.)，和任何其它现在已知的或后来鉴定的致病性微生物（见，例如 Microbiology, Davis et al, Eds?，第4版，Lippincott, New York, 1990,其对致病性 微生物的讲述的全部内容通过引用结合到本文中）。微生物的具体实例包括，但不限于，幽 门螺杆菌j〇7_/ori)、肺炎衣原体（GWaffjc/ia jOflet/zmoiae)、沙眼衣原体 (tis)、解脈脈原体（￡/_reaj〇_/as_ffla 、肺炎支原体 (#7。0/7_/35細/7/36腫0/3〗36)、金黄色葡萄球菌（5'(3/^7_/〇。0(^^/5 3^/1'6^/5)、化胺性链球菌 {Streptococcus pyogenes) ( Streptococcus pneumoniae) |Sf (5rt_reJotococct/s ri_ric/a/3s)、奠肠球菌（i?/3 te_rococct/s faeca^/is)、脑膜炎奈瑟氏菌 (7Veisse_ria tic/is)、奈瑟氏淋球菌（7Veisse_ria go/3〇_rrAoeae)、梅毒螺旋体 (Treponema pallidum)、炭'疱jff 舊（Bacillus anthracis)、伤寒妙 \飞氏Jff 舊（Salmonella tjpAi)、霍乱弧菌（Ki/?rio cAo_/era)、鼠疫巴氏杆菌(Pastet/reDa jOestis)(鼠疫耶尔森 氏菌（Fei-siflia j〇es tis))、铜绿假单胞菌（Pset/c/offoflas ae_rt/《i/3〇sa)、空肠弯曲菌 (Cafflp7_/o/?acte_r JejYmi)、艰难梭状芽抱杆菌（C7ost_ric/i? c/i/fici_/e)、肉毒梭状芽抱梭 菌（C7ostric/i? 、结核分枝杆菌(ifyco/?acteri? tt//?erct/_/osis)、伯氏疏螺旋 体（i?o_rre_/ia /7t/_rgc/o_rfe_ri)、杜氏嗜血杆菌（//aafflOjoAi^/t/s c/t/creji)、白喉棒状杆菌 (Coiy/3e/7acte_ri? c/ijoA tAe_ria)、百日咳博德特氏菌（j9o_rc/ete_/_/a j〇e_rtt/ssis)、副百日咳 博德特氏菌（5o_rc/e j〇a_raj〇e_rtt/ssis)、气管败血性博德特氏菌（5o_rc/e /7_ro/3cAisej〇 tica)、流感嗜血杆菌（//ae_ffl〇j〇Ai_/t/s ifl/7t/e/3za)和肠毒素大肠杆菌 (enterotoxic Escherichia coif)。
[0053] 如本文所用的术语"自身免疫性病症"，指与自身免疫性反应有关的任何病症。实 例包括(不限于）多发性硬化、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、狼疮，炎症性肠综合征和肠易激 综合征。
[0054] 如本文所用的术语"癌症"，指细胞的任何良性或恶性异常生长。实例包括（不限 于)乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、皮肤癌、胰腺癌、结肠癌、黑素瘤、恶性黑素瘤、卵巢癌、脑癌、 原发性脑癌、头-颈癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、肝癌、膀胱癌、非-小细胞肺癌、头或颈 癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、小细胞肺癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、 结肠癌、前列腺癌、泌尿生殖系统癌、甲状腺癌、食管癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、肾上腺癌， 肾细胞癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、恶性胰岛细胞瘤、恶性类癌瘤、绒毛膜癌、蕈样肉芽 月中、恶性高钙血症、颈椎增生、白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急 性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、毛 细胞白血病、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、卡波济氏肉瘤、真性红细胞增多症(polycythemia vera)、原发性血小板增多症(essential thrombocytosis)、何杰金氏病、非-何杰金氏淋巴 瘤、软-组织肉瘤、骨原性肉瘤、原发性巨球蛋白血症和视网膜母细胞瘤。在一些实施方案 中，癌症选自肿瘤形成的癌症。
[0055]如本文所用的，"核酸"、"核苷酸序列"和"多核苷酸〃可互换使用并涵盖RNA和DNA 二者，包括cDNA、基因组DNA、mRNA、合成（如，化学合成）DNA或RNA和RNA和DNA的嵌合体。术 语多核苷酸、核苷酸序列，或核酸指核苷酸链而不考虑链的长度。
[0056]术语"分离的"可指基本上不含细胞材料、病毒材料和/或培养基（当通过重组DNA 技术生产时），或化学前体或其它化学物质（当化学合成时）的核酸、核苷酸序列或多肽。此 外，"分离的片段"是核酸、核苷酸序列或多肽的片段，其作为片段不是天然存在的且将不以 自然状态被发现。"分离的"并不意味着制剂是技术纯的（均质的），但它足够纯到可以其中 用于预定目的的形式提供多肽或核酸。
[0057]术语"片段"，当应用于多核苷酸时，将被理解为意指相对于参照核酸或核苷酸序 列减少了长度的核苷酸序列并包含与参照核酸或核苷酸序列相同或几乎相同（如，90%、 92%、95%、98%、99%相同）的连续核苷酸的核苷酸序列，基本上由它们组成，和/或由它们组 成。在适当时，根据本发明的这样的核酸片段可被包括在其为一个组成部分的较大多核苷 酸中。在一些实施方案中，这样的片段可包含寡核苷酸，基本由寡核苷酸组成，和/或由寡核 苷酸组成，所述寡核苷酸具有根据本发明的核酸或核苷酸序列的至少约8、10、12、15、20、 25、30、35、40、45、50、75、100、150、200，或更多个连续的核苷酸的长度。
[0058]术语"片段〃，当应用于多肽时，将被理解为意指相对于参照多肽或氨基酸序列减 少了长度的氨基酸序列并包含与参照多肽或氨基酸序列相同或几乎相同（如，90%、92%、 95%、98%、99%相同）的连续的氨基酸的氨基酸序列，基本上由它们组成，和/或由它们组成。 在适当时，根据本发明的这样的多肽片段可被包括在其为一个组成部分的较大多肽中。在 一些实施方案中，这样的片段可包含肽，基本由肽组成，和/或由肽组成，所述肽具有根据本 发明的多肽或氨基酸序列的至少约4、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、 200,或更多个连续的氨基酸的长度。
[0059] 如本文所用的，术语"蛋白"和"多肽"可互换使用并涵盖肽和蛋白二者，除非另外 指明。
[0060] "融合蛋白"是当编码两个(或更多个)在自然界未发现融合在一起的不同多肽的 两个异源核苷酸序列或其片段，在正确的翻译阅读框内融合在一起所产生的多肽。示例性 的融合多肽包括本发明的多肽(或其片段)与谷胱甘肽-s-转移酶、麦芽糖-结合蛋白或报道 基因蛋白（如，绿荧光蛋白、葡萄糖醛酸酶、半乳糖苷酶、荧光素酶等）、血凝素、c-my C、 FLAG表位等的全部或部分的融合物。
[0061] 如本文所用的，"功能"多肽或"功能片段"是基本上保留通常地与该多肽有关的至 少一种生物学活性（如，靶蛋白结合）的多肽或片段。在特定的实施方案中，"功能"多肽或 "功能片段"基本上保留未修饰肽具有的所有活性。所谓"基本上保留"生物学活性，其意是 指该多肽保留天然多肽的至少约 20%、30%、40%、50%、60%、75%、85%、90%、95%、97%、98%、99%， 或更高的生物学活性(并可甚至具有比天然多肽更高水平的活性）。"非-功能"多肽是显示 出很少或基本上没有可检测的通常与该多肽有关(如，最多只有一个微不足道的数量，例如 少于约10%或甚至5%)的生物学活性的多肽。生物学活性例如蛋白结合可使用本领域熟知的 和如本文描述的分析来测定。
[0062] II.抗体和组合物 本发明人已鉴定和表征特异性地结合于m)CA2并耗竭pDC的抗体。这样的抗体可有利地 用来在受试者中耗竭PDC，例如研究或治疗目的。这样的抗体可被用来治疗与pDC有关的病 症。因此，本发明的一个方面涉及当给予受试者时特异性地结合于BDCA2并耗竭pDC的抗体 或其片段。
[0063]如本文所用的术语"抗体(antibody)"或"抗体(antibodies)"指所有类型的免疫 球蛋白，包括186、1811、184、18〇和以￡。抗体可以是单克隆或多克隆的并可具有任何物种来 源，包括（例如）小鼠、大鼠、兔、马、山羊、绵羊、骆驼，或人，或可以是嵌合抗体。见例如， Walker et al., Molec. Immunol. 26:4：03 (1989)。所述抗体可以是根据在美国专利号4， 474,893或美国专利号4,816,567中公开的方法产生的重组单克隆抗体。所述抗体也可根据 在美国专利号4，676，980中公开的方法经化学构成。
[0064]包括在本发明范围内的抗体片段包括，例如，Fab、Fab '、F(ab '）2，和Fv片段;域抗 体、双抗体;vaccibodies、线性抗体;单链抗体分子;和从抗体片段形成的多特异性抗体。这 样的片段可通过已知技术生产。例如，F(ab〇 2片段可通过抗体分子的胃蛋白酶消化生产， 和Fab片段可通过还原F(al〇2片段的二硫键生成。或者，可构建Fab表达库以允许快速和容 易地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段(Huse eta人，(1989))。
[0065] 本发明的抗体可被改变或进行突变以与其中产生抗体的物种不同的物种相容。例 如，抗体可被人源化或骆驼化。非-人(如，鼠科动物)抗体的人源化形式是嵌合免疫球蛋白、 免疫球蛋白链或其片段(如?？{ &13、？&13'、？(&13'）2或抗体的其它抗原-结合子序列），其含有 源自非-人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白（受体抗体），其中来自受 体的互补决定区（CDR)的残基被来自非-人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的CDR的具有 所需的特异性、亲和力和能力的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架残基被相 应的非-人残基替代。人源化抗体也可包含既未在受体抗体中也未在输入CDR或构架序列中 发现的残基。一般来说，人源化抗体将基本都包含至少一个，且典型地两个可变域，其中所 有或基本上所有的CDR区对应于非-人免疫球蛋白的那些和所有或基本上所有的构架(FR) 区（即，CDR区之间的序列）是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体任选地还包含至少 一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地人免疫球蛋白的恒定区（Jones eta^.，jVature (1986);Riechmann et a_/.，7Vatt/_re,幻J?:323 (1988);和Presta, Ct/_rr. Qo. Struct. Biol. 2:593 (1992))〇
[0066] 用于人源化非-人抗体的方法是本领域熟知的。一般来说，人源化抗体具有从非-人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非-人氨基酸残基通常被称为"输入"残基， 其典型地取自"输入"可变域。人源化可基本上按照Winter及其同事的方法(Jones et a入， Nature 321:522 (1986)；Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)；Verhoeyen et aL，^5A1534 (1988))，通过用啮齿动物⑶Rs或⑶R序列取代人抗体的相应的序 列进行。因此，这样的"人源化"抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上少于 完整的人可变域已被来自非-人物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体典型地为人抗 体，其中一些CDR残基(如，CDRs全部或其部分)和可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体的 类似部位的残基取代。
[0067]人抗体也可使用本领域已知的各种技术，包括噬菌体展示库制备（Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227\?>Sl (1991)；Marks et al., J. Mol. Biol. 222\hSl (1991))。0〇16等和13〇61'1161'等的技术也可用来制备人单克隆抗体（(]〇16 6(32.， Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)和Boerner eta入，iM臟〇入#7:86 (1991))。类似地，人抗体可通过将人免疫球蛋白基因座引 入转基因动物，如小鼠中来制备，其中内源性免疫球蛋白基因已被部分地或完全失活。在攻 击时，观察到人抗体生产，这在所有方面，包括基因重排、装配和抗体所有组成成分，都与在 人类中见到的都非常相似。这种方法例如，在美国专利号5，545，807 ; 5，545，806; 5，569， 825;5,625,126;5,633,425;5,661,016中，和在以下科学出版物中有描述:Marks et a入， Bio/Technology 10:779 (1992)；Lonberg et al., Nature 368:856 (1994)；Morrison, Nature 368:812 (1994)；Fishwild et al., Nature Biotechnol. 74:845 (1996)； Neuberger, Nature Biotechnol. 14:826 (1996);Lonberg和Huszar， Intern? Rev. Immunol. 65 (1995)。
[0068] 用来进行本发明的多克隆抗体可按照已知程序，通过用靶标的单克隆抗体结合的 抗原免疫合适的动物(如，兔、山羊等），收集来自动物的免疫血清，并从免疫血清分离多克 隆抗体来生产。BDCA2的多核苷酸序列和多肽序列是本领域已知的并可在序列数据库如 GenBank中发现。序列的实例包括人BDCA2多肽序列（索取号Q8WTT0)和多核苷酸序列（索取 号AF293615)，通过引用以其全文结合到本文中。
[0069] 用来进行本发明的单克隆抗体可根据Kohler和Mi 1 stein，TVa 495 (1975)的技术，在杂交瘤细胞系中生产。例如，可将含有适当的抗原的溶液注射到小鼠中， 并在足够的时间后，杀死小鼠并获得脾细胞。然后典型地在聚乙二醇的存在下，脾细胞通过 使它们与骨髓瘤细胞或与淋巴瘤细胞融合而永生化，以产生杂交瘤细胞。然后使杂交瘤细 胞在合适的培养基中生长并对上清液筛选具有所需特异性的单克隆抗体。单克隆Fab片段 可通过本领域技术人员已知的重组技术，在大肠杆菌（i?. CcJi)中生产。见，例如Huse， Science246\l21^ (1989)〇
[0070] 对靶多肽特异性的抗体也可通过本领域已知的噬菌体展示技术获得。
[0071] 各种免疫分析可用来筛选以鉴定对BDCA2具有所需特异性的抗体。使用具有确立 的特异性的多克隆抗体或者单克隆抗体的竞争性结合或免疫放射分析的许多方案是本领 域熟知的。这样的免疫测定典型地涉及在抗原及其特异性抗体之间的复合物形成(例如，抗 原/抗体复合物形成）的测量。可使用利用对本发明的多肽或肽上的两个非-干扰性表位有 反应的单克隆抗体的双-位点、基于单克隆的免疫分析以及竞争性结合分析。
[0072]按照已知技术，抗体可被结合到固体载体（如，从材料如乳胶或聚苯乙烯形成的 珠、板、片或孔）。按照已知技术，抗体也可结合到可检测的基团如放射性标记物（如，35s、 1251、 1311)、酶标记物(如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶），和荧光标记物(如，荧光素）。以本 发明的方法形成抗体/抗原复合物的测定可通过检测，例如沉淀、凝集、絮凝、放射性、色彩 显影或变化、荧光、发光等，如为本领域熟知的。
[0073]在一个实施方案中，抗体是特异性地结合BDCA2的抗体或其片段（如，单克隆抗 体）。抗体可结合于BDCA2上的特异性表位。
[0074] 在一个实施方案中，抗体是由杂交瘤细胞系15B (ATCC保藏号_________________________________)生产 的单克隆抗体。在进一步的实施方案中，抗体是竞争结合于由杂交瘤细胞系15B生产的单克 隆抗体特异性地结合的相同表位的单克隆抗体或其片段。在另一个实施方案中，所述抗体 是特异性地结合由杂交瘤细胞系15B生产的单克隆抗体特异性地结合的相同表位的单克隆 抗体或其片段。由杂交瘤细胞系1 5 B生产的抗体结合的表位包含氨基酸序列 IQNLKRNSSYFLGLSDPGGR (SEQ ID N0:9)或其至少5个连续氨基酸，如至少5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14,或15或更多个连续的氨基酸的片段，基本上由它们组成，或由它们组成。
[0075] 在某些实施方案中，单克隆抗体或其片段是嵌合抗体或人源化抗体。在另外的实 施方案中，嵌合或人源化抗体包含至少一部分由杂交瘤细胞系15B生产的单克隆抗体的 CDRs。如本文所用的，CDR的"部分"被定义为来自组成CDRs (如，从1至6个CDRs)的每一个轻 链和重链的3个环（loops)中的一个或多个或包含至少3个连续的氨基酸，基本上由它们组 成，或由它们组成的环的一个或多个部分。例如，嵌合或人源化抗体可包含1、2、3、4、5或6个 ⑶R环，1、2、3、4、5或6个⑶R环的部分，或其按任何组合的混合物。
[0076]在一个实施方案中，所述抗体或其片段包含含有SEQ ID N0: 2的氨基酸序列或与 其至少90%相同，例如与其至少95、96、97、98或99%相同的序列的重链可变区。在另一个实施 方案中，所述抗体或其片段包含含有由SEQ ID NO: 1的核苷酸序列或与其至少90%相同的序 列，例如与其至少95、96、97、98或99%相同的序列编码的氨基酸序列的重链可变区。在一些 实施方案中，所述抗体或其片段包含含有SEQ ID N0: 2的氨基酸序列的至少50个连续的氨 基酸或与其至少90%相同的序列，例如至少100、150或200个或更多个连续的氨基酸的重链 可变区。
[0077]在一个实施方案中，所述抗体或其片段包含含有SEQ ID N0:4的氨基酸序列或与 其至少90%相同的序列，例如与其至少95、96、97、98或99%相同的序列的轻链可变区。在另一 个实施方案中，所述抗体或其片段包含含有由SEQ ID N0:3的核苷酸序列或与其至少90%相 同的序列，例如与其至少95、96、97、98或99%相同的序列编码的氨基酸序列的轻链可变区。 在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含含有SEQ ID N0:4的氨基酸序列的至少50个连 续的氨基酸或与其至少90%相同的序列，例如至少100、150或200或更多个连续的氨基酸的 轻链可变区。
[0078]在一个实施方案中，抗体或其片段包含含有SEQ ID N0: 2的氨基酸序列或与其至 少90%相同的序列，例如与其至少95、96、97、98或99%相同的序列，或由SEQ ID N0:1的核苷 酸序列或与其至少90%相同的序列，例如与其至少95、96、97、98或99%相同的序列编码的重 链可变区，和含有SEQ ID N0:4的氨基酸序列或与其至少90%相同的序列，例如与其至少95、 96、97、98或99%相同的序列，或由SEQ ID N0:3的核苷酸序列或与其至少90%相同的序列，例 如与其至少95、96、97、98或99%相同的序列编码的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体或 其片段包含包含SEQ ID N0: 2的氨基酸序列的至少50个连续的氨基酸或与其至少90%相同 的序列，例如至少100、150或200或更多个连续的氨基酸的重链可变区，和包含SEQ ID N0:4 的氨基酸序列的至少50个连续的氨基酸或与其至少90%相同的序列，例如至少100、150或 200或更多个连续的氨基酸的轻链可变区。
[0079]在一个实施方案中，所述抗体或其片段包含含有来自SEQ ID N0: 2的氨基酸序列 或与其至少90%相同的序列，例如与其至少95、96、97、98或99%相同的序列的至少一个^尺 (如1、2或3个)或其部分的重链可变区。在另一个实施方案中，所述抗体或其片段包含含有 来自由SEQ ID N0:1的核苷酸序列或与其至少90%相同的序列，例如与其至少95、96、97、98 或99%相同的序列编码的氨基酸序列的至少一个CDR (如1、2或3个)或其部分的重链可变 区。本领域技术人员理解，CDRs在结合特异性方面起着重要的作用且序列取代(如，用于小 鼠抗体的人源化)优选地在CDRs外部进行，而最小改变在CDRs内部进行。因此，在一些实施 方案中，与公开的序列至少90%相同的序列不包含对CDRs的变化或仅有最小数目的改变。 [0080]在一个实施方案中，抗体或其片段包含含有来自SEQ ID N0:4的氨基酸序列或与 其至少90%相同的序列，例如与其至少95、96、97、98或99%相同的序列的至少一个⑶R (如， 1、2或3个)或其部分的轻链可变区。在另一个实施方案中，抗体或其片段包含含有由来自 SEQ ID勵:3的核苷酸序列或与其至少90%相同的序列，例如与其至少95、96、97、98或99%相 同的序列编码的氨基酸序列的至少一个CDR (如，1、2或3个)或其部分的轻链可变区。
[00811在一个实施方案中，抗体或其片段包含含有来自SEQ ID N0: 2的氨基酸序列或与 其至少90%相同的序列，例如与其至少95、96、97、98或99%相同的序列，或由SEQ ID N0:1的 核苷酸序列或与其至少90%相同的序列，例如与其至少95、96、97、98或99%相同的序列编码 的至少一个⑶R (如，1、2或3个)的重链可变区，和含有来自SEQ ID N0:4的氨基酸序列或与 其至少90%相同的序列，例如与其至少95、96、97、98或99%相同的序列，或由3￡010勵:3的 核苷酸序列或与其至少90%相同的序列，例如与其至少95、96、97、98或99%相同的序列编码 的至少一个⑶R (例如1、2、或3个)的轻链可变区。
[0082]在一个实施方案中，所述抗体是由杂交瘤细胞系12B (先前称为125) (ATCC保藏 号 ________________________________J生产的单克隆抗体。在进一步的实施方案中，抗体是单克隆抗体或其片 段，其竞争性结合于由杂交瘤细胞系12B生产的单克隆抗体特异性地结合的相同表位。在另 一个实施方案中，抗体是单克隆抗体或其片段，其特异性地结合于由杂交瘤细胞系12B生产 的单克隆抗体特异性地结合的相同表位。在某些实施方案中，单克隆抗体或其片段是嵌合 抗体或人源化抗体。在另外的实施方案中，嵌合或人源化抗体包含至少一部分由杂交瘤细 胞系12B生产的单克隆抗体的CDRs。
[0083]在一个实施方案中，所述抗体或其片段包含含有SEQ ID N0:6的氨基酸序列或与 其至少90%相同的序列，例如与其至少95、96、97、98或99%相同的序列的重链可变区。在另一 个实施方案中，所述抗体或其片段包含含有由SEQ ID N0:5的核苷酸序列或与其至少90%相 同的序列，例如与其至少95、96、97、98或99%相同的序列编码的氨基酸序列的重链可变区。 在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含含有SEQ ID N0:6的氨基酸序列的至少50个连 续的氨基酸或与其至少90%相同的序列，例如至少100、150或200或更多个连续的氨基酸的 重链可变区。
[0084]在一个实施方案中，所述抗体或其片段包含含有SEQ ID N0:8的氨基酸序列或与 其至少90%相同的序列，例如与其至少95、96、97、98或99%相同的序列的轻链可变区。在另一 个实施方案中，所述抗体或其片段包含含有由SEQ ID N0:7的核苷酸序列或与其至少90%相 同的序列，例如与其至少95、96、97、98或99%相同的序列编码的氨基酸序列的轻链可变区。 在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含含有SEQ ID N0:8的氨基酸序列的至少50个连 续的氨基酸或与其至少90%相同的序列，例如至少100、150或200或更多个连续的氨基酸的 轻链可变区。
[0085]在一个实施方案中，所述抗体或其片段包含含有SEQ ID N0:6的氨基酸序列或与 其至少90%相同的序列，例如与其至少95、96、97、98或99%相同的序列，或由3￡〇10勵:5的 核苷酸序列或与其至少90%相同的序列，例如与其至少95、96、97、98或99%相同的序列编码 的重链可变区，和含有SEQ ID N0:8的氨基酸序列或与其至少90%相同的序列，例如与其至 少95、96、97、98或99%相同的序列，或由3￡〇10勵:7的核苷酸序列或与其至少90%相同的序 列，例如其至少95、96、97、98或99%相同的序列编码的轻链可变区。在一些实施方案中，所述 抗体或其片段包含含有SEQ ID N0: 6的氨基酸序列的至少50个连续的氨基酸或与其至少 90%相同的序列，例如至少100、150或200或更多连续的氨基酸的重链可变区，和含有SEQ ID N0:8的氨基酸序列的至少50个连续的氨基酸或与其至少90%相同的序列，例如至少100、150 或200或更多个连续的氨基酸的轻链可变区。
[0086]在一个实施方案中，所述抗体或其片段包含含有来自SEQ ID N0:6的氨基酸序列 或与其至少90%相同的序列，例如与其至少95、96、97、98或99%相同的序列的至少一个^尺 (例如，1、2或3个)或其部分的重链可变区。在另一个实施方案中，所述抗体或其片段包含含 有来自由SEQ ID N0:5的核苷酸序列或与其至少90%相同的序列，例如与其至少95、96、97、 98或99%相同的序列编码的氨基酸序列的至少一个⑶R (例如，1、2或3个)或其部分的重链 可变区。本领域技术人员理解，CDRs在结合特异性方面起着重要的作用，并且序列取代(例 如，用于小鼠抗体的人源化)优选地在CDRs外部进行，而最小改变在CDRs内部进行。因此，在 一些实施方案中，与公开的序列至少90%相同的序列不包含对CDRs的变化或仅有最小数目 的改变。
[0087]在一个实施方案中，所述抗体或其片段包含含有来自SEQ ID N0:8的氨基酸序列 或与其至少90%相同的序列，例如与其至少95、96、97、98或99%相同的序列的至少一个^尺 (例如，1、2或3个)或其部分的轻链可变区。在另一个实施方案中，所述抗体或其片段包含含 有来自由SEQ ID N0:7的核苷酸序列或与其至少90%相同的序列，例如与其至少95、96、97、 98或99%相同的序列编码的氨基酸序列的至少一个CDR (例如，1、2或3个)或其部分的轻链 可变区。
[0088]在一个实施方案中，所述抗体或其片段包含含有来自SEQ ID N0:6的氨基酸序列 或与其至少90%相同的序列，例如与其至少95、96、97、98或99%相同的序列，或由3￡〇10勵： 5的核苷酸序列或与其至少90%相同的序列，例如与其至少95、96、97、98或99%相同的序列编 码的至少一个⑶R (例如，1、2或3个）的重链可变区，和含有来自SEQ ID N0:8的氨基酸序列 或与其至少90%相同的序列，例如与其至少95、96、97、98或99%相同的序列，或由3￡〇10勵： 7的核苷酸序列或与其至少90%相同的序列，例如与其至少95、96、97、98或99%相同的序列编 码的至少一个⑶R (例如，1、2或3个)的轻链可变区。
[0089] 作为进一步的方面，本发明提供包含本发明的所述抗体或其片段的组合物。在一 些实施方案中，所述组合物是包含在药学上可接受的载体中的本发明抗体的药物制剂。
[0090] 所谓"药学上可接受的"，其意指在生物学上或其它方面并非不合需要的物质，即， 所述物质可给予受试者而不引起任何不合需要的生物学作用如毒性。
[0091 ]本发明的制剂可任选地包含药物、药剂、载体、辅助剂、分散剂、稀释剂等。
[0092]本发明的化合物可按照已知技术，以药用载体配制给予。见例如，Remington，药物 科学和实践（5fcie/3ce a/3c/ Practice o/PAaiwacj)(第9版.1995)。在根据本发明的药物 制剂的生产中，化合物(包括其生理学可接受的盐)典型地与特别是可接受的载体混合。载 体可以是固体或液体，或二者，并优选地用所述化合物配制为单位剂量制剂，例如，片剂，其 可含有从〇. 01或〇. 5%至95%或99%重量的化合物。一种或多种化合物可掺入本发明的制剂 中，所述制剂可通过任何熟知的配药技术制备。
[0093]本发明的制剂包括适合于口服、直肠、局部、含服(如，舌下）、阴道、胃肠外（如，皮 下、肌内包括骨骼肌、心肌、膈肌和平滑肌、皮内、静脉内、腹膜内）、局部（即，皮肤和粘膜表 面二者，包括气道表面）、鼻内、经皮、关节内、鞘内，和吸入给药，经肝门内递送给药至肝，以 及直接器官注射(如，进入肝，进入脑供递送至中枢神经系统，进入胰，或进入肿瘤或肿瘤周 围组织）的那些制剂。最合适的途径在任何给定的情况下将取决于待治疗的病症的性质和 严重性以及取决于所用具体化合物的性质。
[0094] 对于注射，载体将典型地是一种液体，如无菌无热原水、无热原磷酸盐-缓冲盐水 溶液、抑菌水，或CremophorEL[R] (BASF, Parsippany, N.J.)。对于其它给药方法，载体 可以是固体或者液体。
[0095] 对于口服给药，所述化合物可以固体剂型，如胶囊、片剂，和散剂，或以液体剂型， 如酏剂、糖浆剂，和混悬剂给予。化合物可与无活性的成分和粉末状载体，如葡萄糖、乳糖、 蔗糖、甘露醇、淀粉、纤维素或纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸、糖精钠、滑石、碳酸镁等一 起封装在明胶胶囊中。可加入以提供所需颜色、味道、稳定性、缓冲能力、分散或其它已知所 需特征的另外的无活性成分的实例是氧化铁红、硅胶、十二烷基硫酸钠、二氧化钛、食用白 墨水等。类似的稀释剂可被用来制备压制片剂。片剂和胶囊二者可被制备为缓释产品，以提 供药物在数小时的时间段内的连续释放。压制片剂可以是糖包衣或薄膜包衣的，以掩蔽任 何不愉快的味道并保护片剂以隔绝大气，或肠溶包衣以在胃肠道中选择性崩解。用于口服 给药的液体剂型可含有着色剂和矫味剂以增加患者的接受度。
[0096] 适合于含服(舌下)给药的制剂包括含有在矫味基质，通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄 蓍胶中的化合物的糖锭剂(lozenges);和含有在惰性基质如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶 中的化合物的含片(pastilles)。
[0097]适合于胃肠外给药的制剂包含所述化合物的无菌水性和非-水性注射溶液，其制 剂优选地与计划的接受者的血等渗。这些制剂可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与 计划的接受者的血等渗的溶质。水性和非-水性无菌悬浮液可包含助悬剂和增稠剂。所述制 剂可以单位\剂量或多-剂量容器，例如密封的安瓿和小瓶存在，并可在冷冻干燥(冻干)条 件下贮存，仅仅需要在临用前即刻加入无菌液体载体，例如，盐水或注射用水。
[0098] 即用注射溶液和悬浮液可从前述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。例如，在本发 明的一方面，提供一种可注射的、稳定的、无菌组合物，其包含在密封的容器中的单位剂型 的本发明的化合物。所述化合物或盐以一种冻干物的形式提供，其能够用合适的药学上可 接受的载体重新构成，以形成其适合于注射给受试者的液体组合物。单位剂型典型地包含 从约10 mg至约10克的化合物或盐。当化合物或盐基本上为水不溶性时，可以足够的量使用 足量的为药学上可接受的乳化剂，以在水性载体中乳化化合物或盐。一种这样的有用的乳 化剂是磷脂酰胆碱。
[0099] 适合于直肠给药的制剂优选地作为单位剂量栓剂存在。这些可通过使所述化合物 与一种或多种常规固体载体，例如，可可酯混合，然后使产生的混合物成型来制备。
[0100]适合于局部应用于皮肤的制剂优选地采用软膏剂、霜剂、洗剂、糊剂、凝胶剂、喷雾 剂、气溶胶或油剂的形式。可使用的载体包括凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇、透皮促进剂及 其两种或更多种的组合。
[0101]适合于透皮给药的制剂可作为适合于与接受者的表皮保持密切接触一段延长的 时间的离散贴片存在。适合于透皮给药的制剂也可通过离子电渗疗法递送(见，例如，Tyle， PAarffi. Ttes. 1318 (1986))并典型地采取化合物的任选的缓冲水性溶液的形式。合适的制 剂包含柠檬酸盐或bis/tris缓冲液(pH 6)或乙醇/水并含有从0.1至0.2M的化合物。
[0102]备选地，所述化合物可配制为鼻腔给药，或者以其它方式，通过任何合适的手段给 予受试者的肺，例如通过受试者吸入含有化合物的可吸入颗粒的气溶胶悬浮液给予。可吸 入颗粒可以是液体或固体。术语"气溶胶"包括任何气载悬浮相，其能够被吸入到细支气管 或鼻道中。特异性地，气溶胶包括液滴的气载悬浮液，如可在计量剂量吸入器或雾化器，或 在液雾喷雾器中产生的。气溶胶也包括悬浮于空气或其它载气中的干粉组合物，例如，其可 通过从吸入器装置吹入递送。见Ganderton & Jones,递送至呼吸道的药物（Drug Delivery to the Respiratory Tract) Ellis Horwood (1987) ;Gonda (1990)治疗药物 载体系统中的重要评论（Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems) 6: 273-313;和Raeburn et a_/.，J. Pharmacol. Toxicol. Meth. 27:143 (1992)。含有化合 物的液体颗粒的气溶胶可通过任何合适的手段，如用压力驱动气溶胶雾化器或超声波雾化 器生产，如本领域技术人员已知的。见例如美国专利号4,501，729。含有所述化合物的固体 颗粒的气溶胶同样可通过制药领域已知的技术，用任何固体颗粒药物气溶胶发生器产生。
[0103] 或者，人们可以局部方式，而非系统方式，例如，以贮库或缓释制剂给予化合物。
[0104] 本发明的进一步的方面涉及用于本发明的方法的药剂盒。所述药剂盒可以适合于 给予受试者或以适合于配制成制剂的形式包含本发明的抗体。所述药剂盒还可包含其它组 分，如治疗剂、载体、缓冲剂、容器、给药装置等。所述药剂盒可被设计为治疗应用、诊断应 用，和/或研究应用，且另外的组分可以是适合于预定应用的那些。所述药剂盒还可包含标 签和/或使用说明书，例如用于病症的治疗。这样的标签和/或使用说明书可包括，例如，有 关抗体给药的量、频率和方法的信息。
[0105] III ?方法 作为一个方面，本发明提供在受试者中耗竭PDC的方法，其包括递送给受试者有效量的 特异性地结合BDCA2并耗竭pDC的抗体或其片段，从而耗竭pDC。在一些实施方案中，相对于 没有接收抗体或其片段的受试者，pDC被耗竭至少约50%，例如至少60%、70%、80%、90%、95%、 96%、97%、98%，或99%或更多。在其它实施方案中，本发明提供在离体或体内样品，例如混合 的细胞群中减少PDC的数量和/或耗竭pDC的方法，其包括递送给样品有效量的特异性地结 合BDCA2并且减少pDC的数量和/或耗竭pDC的抗体或其片段，从而减少pDC的数量和/或耗竭 pDC〇
[0106] 在进一步的方面，本发明提供在受试者中治疗与pDC有关的病症的方法，其包括递 送给受试者治疗有效的特异性地结合BDCA2并且减少pDC的数量和/或耗竭pDC的抗体或其 片段，从而治疗所述病症。
[0107] 在一些实施方案中，受试者是研究受试者，例如实验动物。在其它实施方案中，受 试者是已被诊断为患有与pDC有关的病症的受试者。在另一个实施方案中，受试者可以是处 于发生与pDC有关的病症（例如，由于遗传因素，暴露于病原，异常免疫细胞计数等易于患 病）的风险中的受试者。与pDC有关的病症包括(不限于)感染性疾病或持续性病毒感染(如 HIV感染）、自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮），和癌症(如pDC来源的白血病），和与pDC的 组织蓄积有关的病症。
[0108] 本发明的抗体可任选地与其它治疗剂联合递送。另外的治疗剂可与本发明的抗体 同时地递送。如本文所用的，单词〃同时地〃意指在时间上足够接近以产生合并作用（即，同 时地可以是同时发生的，或可在彼此前后的一个短的时间段内发生的两个或更多个事件）。
[0109] 在一个实施方案中，本发明的抗体与以下抗癌药联合给予，例如1)长春花生物碱 (如，长春碱、长春新碱）；2)表鬼臼毒素(如，依托泊苷和替尼泊苷）；3)抗生素(如，更生霉 素(放线菌素D)、柔红霉素(道诺霉素;红比霉素）、阿霉素、博莱霉素、普卡霉素(光辉霉素）， 和丝裂霉素(丝裂霉素C));4)酶(如，L-门冬酰胺酶）；5)生物反应调节剂(如，干扰素-a); 6)铂配位复合物(如，顺铂和卡铂）；7)蒽醌类(如，米托蒽醌）；8)取代的脲(如，羟基脲）； 9)甲基肼衍生物（如，甲基苄肼(N-甲基肼;MIH));10)肾上腺皮质抑制剂（如，米托坦(〇， p'-DDD)和氨鲁米特）；11)肾上腺皮质甾类(如，强的松）；12)孕激素(如，己酸羟孕酮、醋 酸甲羟孕酮，和醋酸甲地孕酮）；13)雌激素（如，乙烯雌酚和炔雌醇）；14)抗雌激素药物 (如，他莫昔芬）；15)雄激素（如，丙酸睾酮和氟甲睾酮）；16)抗雄激素药物(如，氟他胺）； 和17)促性腺激素-释放激素类似物(如，亮丙立德）。在另一个实施方案中，本发明的化合 物与以下抗血管生成药物联合使用，例如对VEGF的抗体(如，贝伐单抗(AVASTIN)、兰尼单抗 (LUCENTIS))和其它血管生成促进剂(如，bFGF、促血管生成素-1)、对a-v/0-3血管整联蛋白 的抗体(如，VITAXIN)、血管抑素、内皮抑素、达肝素、ABT-510、CNGRC肽TNFa共辄物、环磷酰 胺、考布他汀A4磷酸盐、乙酸二甲基咕吨酮、多西他赛、来那度胺、恩扎妥林(enzastaurin)、 紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定化纳米粒子制剂(Abraxane)、大豆异黄酮(染料木黄酮）、梓檬酸 他莫昔芬、沙利度胺、ADH-1 (EXHERIN)、AG-013736、AMG-706、AZD2171、甲苯磺酸索拉非尼、 BMS-582664、CHIR-265、帕唑帕尼、PI-88、伐他拉尼、依维莫司、苏拉明、苹果酸舒尼替尼、 父1184、206474^11161、(^161^8^(16，和塞来考昔。
[0110] 在一个实施方案中，本发明的抗体与以下抗病毒剂联合给予:包括、例如，病毒-灭 活剂如非离子型、阴离子型和阳离子型表面活性剂，和C31 G (氧化胺和烷基甜菜碱）、聚双 胍类（polybiguanides )、二十二醇、酰基肉碱类似物、辛基甘油，和抗菌肽如马盖宁 (magainins)、短杆菌肽（gramicidins)、protegrins和retrocyclins。温和的表面活性剂， 如，失水山梨醇单月桂酸酯、可有利地在本文描述的组合物中用作抗病毒剂。可有利地用于 本文描述的组合物中的其它抗病毒剂包括核苷酸或核苷类似物，如替诺福韦、阿昔洛韦，金 刚烷胺、去羟肌苷、膦甲酸、更昔洛韦、利巴韦林、阿糖腺苷、扎西他宾，和齐多夫定。可使用 的其它的抗病毒剂包括非-核苷逆转录酶抑制剂，如UC-78 1 (硫代甲酰苯胺 (thiocarboxanilide))、吡啶酮、TIB0、奈韦拉平(nevaripine)、地拉韦啶、calanolide A、 卡普韦林和依法韦仑。从这些逆转录酶抑制剂，已显示差的口服生物利用度的药物及其类 似物基本上适合于与本发明的抗体和组合物联合给予粘膜组织，以预防HIV的性传播。可使 用的其它抗病毒剂为在HIV进入阻断剂分类中的那些，如cyanovirin-N、环糊精、角叉菜胶、 硫酸化或磺化聚合物、扁桃酸缩合聚合物、单克隆抗体、趋化因子受体拮抗剂如TAK-779、 SCH-C/D，和AMD-3100，和融合抑制剂如T-20和1249。
[0111] 在一个实施方案中，本发明的抗体与以下免疫抑制剂联合给予:包括，例如，环孢 菌素A、雷帕霉素、糖皮质激素、硫唑嘌呤、咪唑立宾，阿司匹林衍生物、羟氯喹、甲氨蝶呤、环 磷酰胺和FK506 (他克莫司）。
[0112]在特定的实施方案中，抗体以治疗有效的量(如上文定义的术语)给予受试者。药 用活性化合物的剂量可通过本领域已知的方法确定，见例如价《1〇以〇/3's 5fcie/3ces (Maack Publishing Co.，Easton, Pa)。抗体的治疗有效剂量将随着患者与患 者的不同而稍有变化，并将取决于患者的病症和递送的途径。作为一般的建议，从约0.1至 约50 mg/kg的剂量将具有治疗效果。与较高水平有关的毒性可限制静脉内剂量至较低水平 如至多约10 mg/kg。从约10 mg/kg至约50 mg/kg的剂量可用于口服给药。典型地，从约0.5 mg/kg至5 mg/kg的剂量可用于肌内注射。
[0113] 在本发明的特定实施方案中，可在各种时间间隔（如，每小时、每日、每周、每月等） 采用超过一次的给药(如，两次、三次、四次，或更多次给药)以获得治疗作用。
[0114] 本发明发现在兽医和医学应用以及研究应用中的用途。如本文所用的，术语"受试 者"指人和其它动物。合适的受试者包括哺乳动物如人，以及由于濒危动物而具重要性的那 些哺乳动物，如西伯利亚虎;具有经济重要性的动物，如在农场饲养的动物;对人有社交重 要性的动物，如作为宠物或在动物园内保持的动物;和研究动物，如小鼠、兔、豚鼠、雪貂、 狗、猫、猴，和猿。这样的动物的实例包括但不限于食肉动物如猫和狗;猪，包括小猪、肉猪， 和野猪;反刍动物和/或有蹄类动物如牛、公牛、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛，和骆驼;马;和 家禽。
[0115] 本发明在以下仅仅打算作为示例性说明的实施例中更具体地加以描述，因为其中 的大量修饰和变化对本领域技术人员而言将是显而易见的。
[0116] 实施例1 实验方法 人源化小鼠的构建:从北卡罗来那大学的机构动物护理和使用委员会(IACUC)获得对 动物工作的批准。发明人如先前报告的5(3，类似地构建Balb/C rag2- y C (DK0)突变体DK0-hu HSC或Nod-ragl-yC (NRG) NRG-hu HSC小鼠。简言之，人CD34+细胞从 16-至20-周龄胎 鼠肝组织中分离。组织用肝消化培养基（Invi trogen、Freder i ck、MD)消化。悬浮液通过70M1 细胞滤器(BD Falcon, Lincoln Park, NJ)过滤并以150g离心5分钟，以通过Ficoll分离单 核细胞。在用⑶34+磁-活化细胞分选(MACS)试剂盒选择后，将⑶34+ HSCs (0.5 x 1〇6)注 射每只2-至6-天龄DK0或NRG小鼠的肝中，所述小鼠先前已用300 rad辐照。超过95%的人源 化小鼠用血中的人白细胞稳定地重建(在12-14周为10%-90%)。各组(从相同的人供体胎肝 组织重建的人源化小鼠）具有类似的植入水平。所有小鼠被饲养在北卡罗来那大学教堂山 分校。
[0117] HIV-1病毒储备液和人源化小鼠的感染：HIV-R3A，通过将高度致病的双向性被膜 克隆进NL4-3主链生成24,25,51，被用于急性感染实验。111￥-1的1?5向性株，贝-03?，被用于急性 和慢性两种感染。所有病毒由293T细胞的转染生成。具有稳定的人白细胞重建的人源化小 鼠用HIV-R3A或JR-CSF，以1 Ong p24/小鼠的剂量，通过静脉内注射（i. 感染。用293T模拟 上清液感染的人源化小鼠被用作对照组。
[0118] 人源化小鼠中人浆细胞样树突状细胞（pDC)的耗竭：对血液树突状细胞抗原-2 (BDCA2)特异性的单克隆抗体，15B，通过腹膜内注射（i.p.，4 mg/kg)，被用来治疗人源化 小鼠。对于急性HIV-1感染，用15B在感染前_5、_3和-1天注射人源化小鼠3次。对于慢性HIV-1感染，在感染后11周(wpi )，经每周注射两次，将15B应用于小鼠，持续10周。
[0119] HIV-1病毒载量检测：在血浆中的病毒基因组RNA根据生产商的指示，使用QIAamp ? Viral RNA Mini Kit (QIAGEN, cat#52904)提取。HIV-1 复制（基因组拷贝/ml血浆)通 过实时PCR测量(ABI Applied Biosystem)。
[0120] 动物终止和组织处理：对于急性HIV-1感染，小鼠在1 wpi (NL4-R3A)或3 wpi (JR-CSF)时终止。对于慢性JR-CSF感染，小鼠在21 wp i终止。在终止时，如前所述5()，52，从小 鼠淋巴器官分离总白细胞。收获淋巴组织，包括外周血(PBL)、肠系膜淋巴结(mLN)、脾(SP) 和骨髓(BM)以供分析。用ACK缓冲剂溶解红细胞，对剩余的细胞染色并在FACS分析前用1% (wt/vol)甲醛固定。总细胞数量用带有Guava表达软件的Guava Easycytes (Guava)定量。
[0121] 流式细胞术:对HIV-1 gag p24染色，细胞首先用表面抗体染色，然后用cytofix/ cytoperm缓冲剂（BD Bioscience，cat#554714)渗透，接着经细胞内染色。通过CyAn FACS 机器（Dako)，对人白细胞（mCD45-huCD45+)分析人CD3、CD4、CD8、CD123、HLA-DI^PCD38。 FITC-缀合的抗-人HLA-DR (克隆：L243，cat#307604)、PE-缀合的抗-人CD38 (克隆：HIT2， cat#303506)、PE/Cy5-缀合的抗-人CD4 (克隆：RP4-T4，cat#300510)、PE/Cy7-缀合的抗-人CD3 (克隆：HIT3a，cat#300316)、太平洋蓝-缀合的抗-人CD3 (克隆：UCHT1，cat# 300431)、PE/Cy7-缀合的抗-人CD8 (克隆：HIT8a，cat#300914)、APC-缀合的人CD123 (克 隆：6H6, cat#306012)和APC/Cy7-缀合的抗-人CD45 (克隆：H130, cat#304014)购自 81〇168611(1;?￡-缀合的抗-人半胱天冬酶-3(克隆：092-605，〇3七#51-68655乂）购自80 Bioscience。太平洋橙-缀合的抗-小鼠CD45 (克隆:HI30，cat#MHCD4530)、PE/得克萨斯 红-缀合的抗-人CD4 (克隆：S3.5, cat撕HCD0417)或CD8 (克隆：3B5, cat撕HCD0817)，和 LIVE/DEAD? Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit (cat#L34957)购自 InvitrogeruFITC-缀合的抗-HIV p24 (克隆：FH190-1-1, cat#6604665)购自Beckman Coulter。细胞在CyAn ADP (Dako)上分析。
[0122] 人细胞因子luminex分析:小鼠血衆中的细胞因子用Milliplex ? MAP uman细胞因 子/趋化因子磁珠面板免疫分析（Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Immunoassay) (Millipore)定量。收集血衆样品并在分析前于-80°C|G存。测定在北卡罗来 那大学教堂山分校的临床蛋白组学实验室进行。
[0123] 免疫组织化学：来自人源化小鼠的石蜡-包埋的脾切片用小鼠抗-人hu⑶45抗体 (Dako, cat#N1514)染色，在PBS中洗涤，然后用Mouse-&-Rabbit_on-Rodent Double Stain Polymer (BIOCARE MEDICAL, cat#RDS513H)和底物DAB (BIOCARE MEDICAL, cat#BDB2004 H, L, MM)培养。使用Qlmaging Micropublisher 3.3 CCD数码相机和QCapture软件版本 3.0 (Qimaging, Surrey, BC)获取图像。
[0124] 通过FACS分选纯化细胞:合并来自模拟组或处理组小鼠的脾细胞。对于人⑶45+细 胞分选，总m脾用人CD45、小鼠CD45和7-氨基放线素D (Aminoactinomycin D) (7-AAD)染 色。对于人⑶8+ T细胞分选，将⑶3和⑶8抗体加入到抗体混合物中。细胞分选用UNC Flow Cytometry Core进行。
[0125] Agilent微阵列分析:RNA纯化根据生产商的指示，使用RNeasy ? Plus Mini Kit (QIAGEN, cat#74134)进行。将无DNase-RNase (QIAGEN)的处理加入到柱中，以在RNA制备 期间排除任何可能的DNA污染。通过毛细管电泳，检查总RNA的数量、纯度和完整性。在分开 的反应中用Cy3-和Cy5-标记的CTP扩增RNA，以生产差异地标记的样品和参照c-DNAsdOO-400ng的总RNA被用作起始原料以制备cDNA。使用SurePrint G3人基因表达8x60K微阵列试 剂盒（SurePrint G3 Human Gene Expression 8x60K Microarray Kit) (Agilent)，将两 者杂交至相同的微阵列（UNC Genomic and Bioinformatics Core) aAgilent特征提取 (Agilent Feature Extraction) vl8软件被用来分析所有图像。基因表达值通过红色通道 强度(均值)对比绿色通道强度(均值)的l〇g2比值量化，接着经L0WESS归一化以消除强度依 赖性染料偏倚 53。
[0126] 细胞mRNA水平检测:检测了干扰素a-1/13 (IFNal/13)、干扰素a-2 (IFNa2)、干扰 素KIF婦）54、干扰素 y(IFNy) 55和肿瘤坏死因子a (TNFa)56。检测了 I型干扰素刺激基因 MxA 57和TRIM22 58,以证实对I型IFN生产的pDC耗竭作用。进行实时PCR分析(ABI Applied Biosystem)。所有的样品使用人GAPDH基因59,按一式三份测试，用于数据归一化。
[0127] 统计学分析：数据使用GraphPad Prism软件版本5.0 (GraphPad软件，San Diego, CA，USA)分析。用来分析微阵列数据的方法在上文已描述。来自不同组的小鼠的数 据使用双尾Mann-Whitney U检验比较。对于基因表达，均值-A CT被计算为每组样品内所有 ACT值的平均数（土 SD)并使用双向AN0VA方法。相关性用斯皮尔曼检验估算。当p〈0.05 时，所有的结果被认为是有显著意义的。
[0128] 实施例2 在人源化小鼠中的HIV-1感染 其他人和发明人已报道，功能性人PDC在人源化小鼠模型的淋巴组织中发生(Traggiai et al., Science 304:104： (2004)；Zhang et al., Blood 777:6184 (2011 )；Tanaka et a入(2012))。人pDC被HIV-1感染快速地激活，并且pDC激活的水平与CD4+ T-细胞数呈负相关（Zhang et a入，仞ooc/ 6184 (2011))，其与从HIV-1感染的患者 (Buimovici-Klein et al., Lancet 2\ 344 (1983)；Buimovici-Klein et al., AIDS 299-108 (1986);Meier et a2.，7Vature#ec/ici/3e 75:955 (2009))和SIV感染的 猴（Harris et a_/.，上 Ki_ro_/.财:7886 (2010);Campillo_Gimenez et a_/.，上 Ki_ro_/. 财：1838 (2010))观察到的结果一致。在该研究中，已显示持续的HIV感染在用双向性R3A 株(图la)或者CCR5-向性的JR-CSF株(图2)感染的人源化小鼠中有效地建立。在急性和慢性 HIV-1感染二者中，观察到HLA-DR+CD38+ CD8 T细胞的增加（图lb、图3a-3c)，伴有在CD3+ T 细胞中的CD4 T细胞百分比的下降（图1 c、图4a-4c)。如同在HIV-1患者中，白细胞减少，或总 人⑶45+白细胞包括⑶8 T细胞的耗竭，也发生于血和脾中（图ld、图5a)。类似于在HIV患者 中，在R3A或者JR-CSF感染的小鼠的血浆中有显著诱导的I型干扰素产生（图1 e、图5b)，伴有 I型干扰素特异性ISG基因在来自脾的白细胞中表达的增加（图If、图5c)。因此，人源化小鼠 提供相关体内模型，用于研究HIV-1和宿主免疫效应子在HIV-1免疫发病机制中的作用 (Zhang et al., Blood 777:6184 (2011)；Zhang et al., Cell. Mol. Immunol. 9:237 (2012))。
[0129] 实施例3 在人源化小鼠中浆细胞样树突状细胞的耗竭 为了描述人PDC在体内HIV-1感染和发病机制中的作用，生产抗-BDCA2 (CD303)单克隆 抗体（15B)，其可特异性地耗竭人源化小鼠的淋巴器官中的人pDC。在15B注射后，在外周血 (图6a)和淋巴器官（图6b)二者的⑶45+白细胞中的人pDC大大减少。作为对照，人T、B、单核 细胞/巨噬细胞和骨髓树突状细胞不受15B注射的干扰(图7-9)。
[0130] 实施例4 在急性HIV-1感染中浆细胞样树突状细胞的作用 为测试在早期原发性HIV-1感染期间pDC的作用，将15B和同种型对照抗体在感染前-5、-3和-1天注射到人源化小鼠中，和小鼠用R3A，一种高度致病的、CCR5-和CXCR4-双向性的 HIV-1 株感染（Meissner et a_/.，Ki_ro_/ogy 74 (2004); Sivaraman et a_/.，, Kiro人皮?: 11715 (2009))。感染的小鼠用15B或对照抗体在感染后3和6天注射。已发现，当 在感染后8天终结时，pDC在感染的小鼠的血和淋巴器官中保持耗竭（图10a)。有趣地，血浆 IFN-I水平被在HIV-1感染的小鼠中的pDC耗竭而显著地降低（图10b)。不同亚型的人IFN-I 的诱导也通过实时PCR在RNA水平上消除（图10c)。此外，ISGs如Mxl、TR頂22的上调也被阻断 (图10d)。这些数据证实，在人源化小鼠的早期HIV-1感染期间，pDCs是主要的（如果不是唯 一的）、体内生产IFN-I的细胞。
[0131] 与IFN-I的抗病毒活性一致，pDC耗竭导致体内升高的HIV-1复制。与对照抗体处理 的小鼠比较，平均血浆病毒血症增加约10-倍(p〈〇. 01)(图1 la)。用较低致病性的、CCR5向 性的HIV-l JR-CSF重复实验。类似于R3A感染，JR-CSF复制在pDC-耗竭的小鼠中也增加约5-倍（图11c)。病毒复制的增加在来自脾的人细胞中对HIV p24蛋白阳性细胞通过免疫组织化 学(图lib)或流式细胞术(图lld，e)进一步证实。
[0132] HIV-1感染诱导全身性免疫激活（Lane et aL，見办3卯:453 (1983);Ascher eta2.，C/i/3.办p. 73:165 (1988))，已提出其促成HIV-1 疾 病进展（Lane et a_/.，TV. 453 (1983) ;Ascher et a_/.，C7i/3. j&p. Immunol. 73:165 (1988);Grossman et al., Clin? Immunol. Immunopathol. 69:123 (1993) ；Giorgi et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 6:904： (1993) ；Bosinger et al., Curr. Opin. HIV AIDS 6:4：ll (2011)；Moir et al., Annu. Rev. Pathol. 6: 223 (2011))<JFN-I和pDC激活的诱导已被假定对在HIV-感染的患者和在SIV-感染的猕猴 二者中的免疫激活有贡献(Buimovici-Klein et a_/.，Za/jcet J?:344 (1983);Buimovici_ Klein et al., AIDS Res. J?:99-108 (1986)；Meier et al., Nature Medicine 75:955 (2009)；Harris et al., J. Virol. 84:7886 (2010)；Campill〇-Gimenez et al., J. Virol. 54:1838 (2010) ；Bosinger etal., Curr. Opin. HIV AIDS 6-All (2011)；Kwa et al., Blood 118:2763 (2011)；Manches et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109: 14122 (2012);Manches eta 入，C/i/3. H 及 3431 (2008))。然而，代替降低 的T细胞激活，在用R3A (图12a，b)或者JR-CSF (图12c，d)感染的pDC-耗竭的小鼠的血和淋 巴器官二者中观察到T细胞激活的进一步增加 (CD38+DR+)。有趣地，已发现⑶8 T细胞激活 水平与pDC-耗竭的小鼠的病毒载量有关（图13)。因此，在INF-I的不存在下，HIV-1也可直接 地导致T-细胞激活。
[0133] 然而，不管增加的HIV-R3A病毒复制，人CD4+ T细胞在血和脾中的绝对数是可与对 照抗体处理的小鼠的那些相当的（图14a)。更令人吃惊的是，pDC耗竭的小鼠的CD8+细胞与 对照抗体处理的动物比较有显著地增加（图14b)。总人⑶45+白细胞也保持在血和脾中（图 14c )，并且这与总⑶45+或⑶8 T细胞的细胞死亡下降有关（图14d，e)。类似的结果在JR-CSF 感染的小鼠中观察到，虽然只有低水平的人CD4+、CD8+ T细胞和总人白细胞和耗竭在感染后 3周时发生（图15)。
[0134] 实施例5 在慢性HIV-1感染中浆细胞样树突状细胞的作用 pDC耗竭在人源化小鼠中，用建立的持续的HIV-1感染进行。用JR-CSF感染人源化小鼠 11周;然后应用15B以耗竭pDCs。与得自预-感染pDC耗竭的数据一致，观察到病毒血症增加 持续10周直至终止（图16a) AIV感染的细胞(HIV-1 p24阳性)的百分比也有增加（图16b、图 17a)。血浆IFN-a2的诱导在pDC-耗竭的小鼠中显著下降(Fig. 17b)。在人脾白细胞中，在RNA 水平上不同IFN-1亚型（图17c)和ISGs (图17d)的减少的诱导也被实时PCR分析和cDNA阵列 证实（图17e、f)。这些数据提示，pDC在HIV-1慢性感染期间，仍然是主要的体内生产INF-I的 细胞。
[0135] 不管在pDC耗竭的这10周期间的持续的较高病毒血症，脾中的人CD4+ T-细胞数与 对照组比较有显著的增加（图16c，p〈0.05)。此外，人⑶8 T细胞和⑶45+白细胞数也有增加 (图16d、e，p〈0.01)。有兴趣的是，人⑶4、⑶8 T细胞和总⑶45+白细胞在血中没有显著补救 (图16c-e)。人⑶45+细胞的增加也被脾切片的⑶45免疫组织化学染色证实（图16f)。因此， pDC耗竭显著地减少在脾中的T细胞和总人CD45+细胞中的死亡/垂死细胞的百分比（图 16g)。因此，在慢性HIV-1感染期间，pDC在抑制病毒复制和促进HIV-诱导的免疫发病机制两 方面仍然起作用。
[0136] 由于在人类患者或在SIV-感染的猴中进行的相关研究，pDC在慢性病毒感染如 HIV-1 中的作用仍然是有争议的（Cervantes-Barragan et a_/.，Pi-oc. dcac/. 5fci. USA 109\?,Q12 (2012)；Riviere et al., J. Exp. Med. 152:633 (1980)；ffang et al., CeD从H:631 (2012))。已有报道，通过在HIV-1感染之前或期间，用新的抗 体特异性地耗竭pDC，pDC是在HIV感染期间主要的体内产生IFN-I的细胞。已报道pDC在HI V-1感染期间和发病机制方面起着双重作用：它们生产IFN-I以抑制HIV-1复制，但通过促进人 白细胞包括人CD4和CD8 T细胞的死亡提高HIV-1发病机制。在持续的HIV-1感染期间，在15B mAb处理后，剩余的IFN-I表达可能是由于骨髓中存在剩余的pDC，虽然其它细胞类型的贡献 也不能排除（Lepelley et a_/.，7:e100 1284 (2011))。
[0137] 有报道pDC可有助于HIV诱导的免疫激活和随后的免疫发病机制。抗-疟疾药氯喹 通过pDC在体外抑制IFN-I生产（Beignon eta^.，C/i/3. H5:3265 (2005)) 并似乎补救与减少的免疫激活有关的HIV-1感染患者的人T细胞(Murray et aL. KiroL 财：12082 (2010);Piconi et a2.，仞ooc/』从:3263 (2011))。有趣的是，HIV-激 活的pDCs通过吲噪胺2，3-双加氧酶（ID0)-依赖机制，还诱导调节性T细胞（Tregs ) (Manches et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109\IA122 (2012)；Manches et al., C/i/3. H及3431 (2008))。在该报告中，观察到通过pDC耗竭增加的T-细胞激 活，这可能是由于经由PDC/IFN-I独立的机制增加了病毒复制。一份最近的报告显示，可抑 制从猕猴分离的pDC激活的TLR7和TLR9拮抗剂没有显著地改变血浆IFN-1水平和ISG在SIV 感染的猴中的表达，可能是由于其在体内不完全地抑制pDC或是由于mDC和巨噬细胞的高水 平激活(Kader et aL，P:e100 3530 (2013))。因此，pDC和HIV-1 复制，以 及其它免疫细胞，在免疫激活中的相对作用需要被进一步研究。
[0138] 重复给予小鼠TLR7配体诱导AIDS-样淋巴细胞减少，伴有减少的⑶4+ T细胞、CD8+ T细胞和B细胞(Baenziger et a入，扮ooc/ H1377 (2009))。有报道IFN-1触发对T细胞的 促凋亡和抗增殖的作用（Tanabe eta^.，上iMmmo人274:609 (2005))，和由TCR信号传 导激活的Stat4可克服其STAT1-依赖的抑制T细胞增殖的作用(Gil et a丄，仞ooc/ 7洲： 3718 (2012))。类似地，TLR7和TLR9拮抗剂DV056-治疗的恒河猴显示血中记忆CD4+和CD8+ T 细胞增殖的显著增加（Kader et a^.，凡oSPatAogefls S?:e100 3530 (2013))。一致地，已 发现pDC耗竭不仅补救⑶4+ T细胞，而且还补救总⑶45+白细胞和⑶8 T细胞。已提出pDC通过 诱导异常免疫激活和通过促进人免疫细胞的耗竭，可有助于HIV免疫发病机制。
[0139] 最近的报告也显示，在LCMV持续感染期间，阻断IFN-I信号传导可改善抗病毒T细 胞反应并经由IL-10-依赖性机制加速慢性LCMV感染的消除(Wilson et a^.，Science 货 6?:202 (2013);Teijaro et a入，3你:207 (2013))。类似的结果见于发明人 的HIV-1感染模型中，因为升高水平的⑶8 T细胞和IFN y与pDC耗竭和IFN-I诱导的阻断相 关。然而，PDC-耗竭似乎不影响人源化小鼠中的IL-10表达，可能是由于HIV-1复制水平的升 高。在HAART-治疗的HIV患者中，显著数量的部分不能显示减少的免疫激活和有效的免疫重 建，甚至伴有有效病毒学反应(Aiuti et aL，diaSTfer.及88 (2006);Gaardbo et a2.， C/i/3. Per. iff皿洲M:670957 (2012);Zhang et a2.，dic/s 27:1283 (2013))。持 续的pDC激活和IFN-I诱导可在这样的免疫无应答患者中起作用。已提出pDC的抑制或耗竭 在HAART期间，在HIV-1慢性感染中可提供有效的治疗，以保持HIV-1感染患者中的人免疫细 胞。
[0140] 实施例6 人源化小鼠中浆细胞样树突状细胞的耗竭 抗-BDCA2 (⑶303)单克隆抗体的进一步的筛选鉴定特异性地耗竭人源化小鼠的淋巴 器官中的人pDC的另一种抗体（12B)。在12B注射后，在CD45+白细胞中的人pDC在脾中大大减 少（图20)。作为对照，人T和骨髓树突状细胞不受12B注射的干扰(图20)。
[0141] 前述是本发明的示例性说明，且不视为对其的限制。本发明通过以下权利要求书， 以及包括在其中的权利要求的等价物来定义。
【主权项】
1. 一种在受试者中耗竭浆细胞样树突状细胞(pDC)的方法，其包括递送给受试者有效 量的特异性地结合血液树突状细胞抗原-2 (BDCA2)并耗竭pDC的抗体或其片段，从而耗竭 pDC〇2. -种在有需要的受试者中治疗与pDC有关的病症的方法，其包括递送给受试者治疗 有效量的特异性地结合BDCA2并耗竭pDC的抗体或其片段，从而治疗所述病症。3. 权利要求2的方法，其中所述病症是持续的病毒感染。4. 权利要求2的方法，其中所述病症是人免疫缺陷病毒感染。5. 权利要求2的方法，其中所述病症是感染性疾病。6. 权利要求2的方法，其中所述病症是自身免疫性疾病。7. 权利要求2的方法，其中所述病症是癌症。8. 权利要求2的方法，其中所述病症是pDC-来源的白血病。9. 权利要求2的方法，其中所述病症是与pDC的组织蓄积有关的病症。10. 权利要求1-9的任一项的方法，其中K)CA2是人K)CA2。11. 权利要求1-10的任一项的方法，其中所述抗体或其片段是单克隆抗体或其片段或 衍生物。12. 权利要求11的方法，其中所述单克隆抗体或其片段特异性地结合表位 IQNLKRNSSYFLGLSDPGGR (SEQ ID N0:9)或其至少5个连续氨基酸的片段。13. 权利要求11的方法，其中所述单克隆抗体或其片段包含含有SEQ ID N0:2的氨基 酸序列或与其至少90%相同的序列的重链可变区。14. 权利要求11的方法，其中所述单克隆抗体或其片段包含含有SEQ ID N0:4的氨基 酸序列或与其至少90%相同的序列的轻链可变区。15. 权利要求11的方法，其中所述单克隆抗体或其片段包含含有SEQ ID N0:6的氨基 酸序列或与其至少90%相同的序列的重链可变区。16. 权利要求11的方法，其中所述单克隆抗体或其片段包含含有SEQ ID N0:8的氨基 酸序列或与其至少90%相同的序列的轻链可变区。17. 权利要求11-16的任一项的方法，其中所述单克隆抗体或其片段是嵌合抗体或其片 段。18. 权利要求11-16的任一项的方法，其中所述单克隆抗体或其片段是人源化抗体或其 片段。19. 一种在混合的细胞群中耗竭pDC的方法，其包括递送给混合的细胞群有效量的特异 性地结合BDCA2并耗竭pDC的抗体或其片段，从而耗竭混合的细胞群中的pDC。20. -种抗体或其片段，其当给予受试者时，特异性地结合K)CA2并耗竭pDC。21. 权利要求20的抗体或其片段，其是单克隆抗体或其片段或衍生物。22. 权利要求21的抗体或其片段，其特异性地结合表位IQNLKRNSSYFLGLSDPGGR (SEQ ID NO:9)或其至少5个连续氨基酸的片段。23. -种单克隆抗体或其片段，其包含含有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列或与其至少90% 相同的序列的重链可变区。24. -种单克隆抗体或其片段，其包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与其至少90% 相同的序列的轻链可变区。25. -种单克隆抗体或其片段，其包含含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与其至少90% 相同的序列的重链可变区。26. -种单克隆抗体或其片段，其包含含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列或与其至少90% 相同的序列的轻链可变区。27. 权利要求23-26的任一项的单克隆抗体或其片段，其是嵌合抗体或其片段。28. 权利要求23-26的任一项的单克隆抗体或其片段，其是人源化抗体或其片段。29. -种药用组合物，其含有权利要求23-28的任一项的单克隆抗体或其片段和药学上 可接受的载体。30. -种药剂盒，其含有权利要求23-28的任一项的单克隆抗体或其片段和使用说明 书。
【文档编号】A61P37/00GK106029874SQ201480075635
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2014年12月16日
【发明人】苏立山
【申请人】北卡罗来纳-查佩尔山大学