专利名称：用羟胺切割法制备的含胞浆引导肽的人表皮生长因子融合蛋白及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域。具体涉及一种人表皮生长因子的修饰以及修饰的人表
皮生长因子的制备方法。
背景技术：
天然人表皮生长因子(Human印idermal growth factor简称hEGF)是一种广泛存在于人类和哺乳动物体内的小分子多肽，是人生长因子中的一种，由53个氨基酸组成的分子量为6222的小分子多肽。等电点4.6。 hEGF分子具有较高稳定性，二硫键是hEGF生物活性所必须结构。hEGF 二级结构只有13 _折叠，构成残基1-33的N-端结构域和34-53的C-端结构域。多肽链上几乎所有残基的芳香侧链都在分子表面成簇存在，形成疏水的袋。
hEGF最明显的生理作用是促进细胞的分裂和生长，以及糖、蛋白质、DNA、RNA的合成。临床上用精制的重组hEGF，配合常规烧伤创面处理，对烧伤浅11、深II度创面、供皮区等均具有不同程度的加速愈合的作用。 hEGF对胃肠道的主要作用有3个方面(1)胃肠粘膜保护作用，(2)抑制胃酸分泌，(3)剌激DNA合成。 hEGF可对呼吸道上皮细胞的功能进行调控，具有抗氧化保护作用。它还能使成纤维细胞合成成纤维细胞促肺细胞因子，加速肺泡II型细胞结构和功能分化，从而合成表面活性物质，促进胎肺成熟。 hEGF促进角膜损伤修复。hEGF作为神经营养活性因子，可以保护神经损伤后的背根神经节感觉神经元。此外，hEGF还是一种脑肠肽神经递质。 hEGF还可诱发表皮干细胞增多，沿基底层排列成层，在颗粒层和棘层聚集成团(干细胞岛)。从而能迅速增加表皮细胞数量及表皮层厚度，增强其屏障功能。也加快表皮更新，使表皮细胞个体年龄年轻化，起到护肤美容效果，使皮肤"青春常在"。目前EGF已经作为化妆品的原料应用于化妆品领域。 引导肽CTD是一种胞质转导肽，去除核定位信号而专一性定位于胞浆的胞浆转导肽，同时，由于其内去除了核定位信号，因而能避免在核内损伤遗传物质。可以有效地介导外源物质进入细胞的胞质当中，与其他蛋白的融合表达产物能够高效地进入体外培养的细胞，并且表现出生物学活性。比目前的TAT蛋白的PTD区段具有更强的介导外源物质进入细胞的能力，CTD融合蛋白的作用具有速度快、温度适应性广、浓度依赖性、能够掺入所有细胞等特点。CTD融合分子穿越细胞膜而不损伤细胞，被CTD带入细胞的分子仍保留其原有的性质。无活性的分子进入细胞后也能重新折叠，自我复性，是基因工程药物经济、高效利用的有利途径。用CTD蛋白进行介导方法简单，转导的效率高，反应条件也不严格，而且它转导的蛋白质在细胞内部仍具有活性。融合蛋白的转导使药物的用量显著下降，副作用明显减少，是其它方法所无法比拟的。
发明内容
本发明用大肠杆菌表达系统高效表达含引导肽的人表皮生长因子融合蛋白，并在融合蛋白的N端与his标签之间引入了羟胺切割位点Asn-Gly，羟胺是一种廉价的化学试剂可以专一性的切割蛋白和多肽中的Asn-Gly肽键。从而使生产成本降低，纯化工艺简化。另外，融合蛋白由于引入了引导肽CTD，可以介导无活性人表皮生长因子的分子进入细胞后重新折叠，自我复性。所以，解决了包涵体复性的难题，简化了生产工艺，提高了人表皮生长因子的稳定性。 本发明提供了高效表达人表皮生长因子融合蛋白的表达质粒pET-His-CTD-hEGF，其包含一个按大肠杆菌偏爱密码子人工合成的含引导肽的人表皮生长因子融合蛋白基因，以及N端6个His和T7启动子。 本发明提供的宿主细胞是E.coli BL21(DE3)plysS，具有氯霉素抗性。 本发明提供胞内表达CTD-hEGF的工程菌株BHis_CE3，是由表达质粒
pET-His-CTD-hEGF转化E. coli BL21 (DE3)plysS细胞获得的最高表达量的菌株。 本发明提供了使用羟胺切割法制备CTD-hEGF的方法，并在此基础上提供了完整
的表达、分离纯化CTD-hEGF融合蛋白的方法。 本发明还对分离纯化CTD-hEGF融合蛋白进行了生物活性测定。采用MTT法结合酶联仪在A54。测定CTD-hEGF融合蛋白对SH-SY-5Y细胞促细胞增殖活性，在62. 5pg/ml时CTD-hEGF的促增殖活性较hEGF纯品高其A54。分别为0. 58和0. 75 (对照不加表皮生长因子或其衍生物的处理为0. 42)，进行的显著性分析表明，CTD-hEGF较hEGF有对SH-SY-5Y细胞的更好的促增殖活性。 本发明的CTD-hEGF融合蛋白将可用于EGF相关疾病的预防和治疗，以及保健品或化妆品的主要组分。 综上所述，本发明的优点是引入了引导肽CTD，解决了包涵体复性的难题，同时提高了稳定性和活性，在融合蛋白的N端与His标签之间引入了羟胺切割位点，即降低了生产成本，又了方便分离纯化，使得采用此方法制备的CTD-hEGF融合蛋白具有比其他hEGF或其衍生产品更好促细胞增殖活性，并且工艺简单、生产成本低的优点。
图1表达质粒pET-His-CTD-hEGF的结构示意图 T7P T7启动子 6His组氨酸标签 CTD胞质转导肽 hEGF人表皮生长因子 Term终止子 图2SDS-PAGE电泳分析CTD-hEGF表达 1表达质粒pET-His-CTD-hEGF在E. coli BL21 (DE3)plysS细胞中的表达 2空白质粒pET-His在E. coli BL21 (DE3)plysS细胞中的表达 M低分子量蛋白标准(66，45，35，25， 18， 14. 4，9. 5，6. 5，4. 3)KD 图3SDS-PAGE电泳分析纯化的CTD-hEGF融合蛋白
1纯化的CTD-hEGF融合蛋白M低分子量蛋白标准(66，45，35，25， 18， 14. 4，9. 5，6. 5，4. 3)KD
具体实施例方式
下面用实施例对本发明进行详细说明，实施例不对本发明构成任何限制。
实施例1 : 化学合成N端含羟胺切割位点的人表皮生长因子基因 采用两步法人工合成N端含羟胺切割位点的人表皮生长因子基因核酸序列，所得序列如SEQ ID N0.3(即下面序列的黑体部分)。同时在片段的上下游分别设计了BamHI和EcoR I位点，便于基因克隆。下面的序列是CTD-hEGF融合蛋白在表达载体中的完整编码序列。 起始密码子 His标签 羟胺切割位点(下划线部分)
GTATCGTGATCTGAAATGGTGGGAACTTCGTTAATGAGAATTC
终止密码子 实施例2 :表达载体pET-His-CTD-hEGF的构建 取质粒pET-His用BamH I和EcoR I酶切后回收；同样使用BamH I和EcoR I酶切将N端含羟胺切割位点的CTD-hEGF基因片段从PMD-CTD-hEGF质粒双酶切下来并回收。将上述酶切的质粒pET-His片段和N端含羟胺切割位点的CTD-hEGF基因连接后转化E. coliT0P10感受态细胞，涂布于LB+Amp平板，37。C培养过夜；挑取单克隆进行PCR筛选，1%琼脂糖电泳检测。 2. 1双酶切反应2 ii L反应体积，冰浴上操作。
10 X Buffer 2 ii L 限制性内切酶EcoR I liiL
限制性内切酶BamH I 1 ii L
载体 2 ii g _ 力口 dH20至 20 ii L 37t:水浴，酶切2h，酶切质粒的多少视质粒浓度而定。 2.2琼脂糖凝胶电泳 2%或0. 7%浓度琼脂糖凝胶电泳，1XTAE缓冲系统，70V电压，约lh时电泳完成后，放入2mg/L的EB染色液中染色10 15min， UVP凝胶成像系统成像。检测100bp以上1000bp以下的DNA片段用2%胶浓度，1000bp以上用0. 7%胶浓度。制备电泳的上样量尽可能多，50V电压电泳。
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2. 3胶纯化DNA 按照琼脂糖凝胶电泳纯化试剂盒说明书操作(天为时代)，最后用30 40 L灭
菌水溶解DNA。 2. 4载体连接 10 ii L反应体积，冰浴上操作。 10 X Buffer 1 ii L T4 DNA连接酶 1 ii L CTD-hEGF基因片段 5 7iiL 载亍本 1 L _ 力口 dH20至 10 ii L 16t:水浴，连接16 24h，视连接效果可以延长或縮短时间；在一定范围内，加 大外源片段的量，可使连接效率提高；延长连接时间也可以使连接效率提高；载体一般取 1 ii L。 2. 5PCR筛选重组转化子 取若干O. 5mL灭菌离心管，每管10 y L灭菌水，用灭菌牙签挑取转化生长的单克隆 菌落，在灭菌水中充分混匀，然后在预先准备好的LB加抗生素的固体平板上划线保种，对 应离心管标记好记号。将混有单克隆菌落的离心管在沸水浴中煮10 15min，离心后取上 清为PCR反应的模板。保种平板37t:倒置过夜培养。若PCR筛到阳性克隆，再从保种的平 板上挑取相应菌落扩增培养。PCR反应条件如下dH208. 2ii L10XPCR Buffer1. 25ii Ld證(25mM)1. Oil LMg2Cl (25mM)0. 75ii L上游引物(1.25iig/'mL)0. 1 ii L下游引物(1.25iig/'mL)0. 1 ii LTaq DNA聚合酶0. 06ii L模板1. Oil LPCR反应总体积12. 5ii L2. 6DNA序列测定 使用通用引物T7promoter primer (5， TAATAC GAC TCACTATAG GG 3，)对阳性克
隆进行DNA序列测定(委托上海生工测序)，测序结果表明，我们构建的pET-His-CTD-hEGF
表达载体中的N端含羟胺切割位点的CTD-hEGF的DNA序列与预期完全一致。 通过以上步骤，表达载体pET-His-CTD-hEGF构建成功。 实施例3 :利用表达CTD-hEGF的工程菌株生产CTD-hEGF融合蛋白 3. 1表达载体pET-Hi s-CTD-hEGF转化表达菌株BL21 取pET-His-CTD-hEGF质粒1 P L，稀释10倍后直接转化E. coli表达菌株BL211 (DE3)plysS感受态细胞，涂布LB+Amp平板，37。C倒置过夜培养。
3. 2试表达筛选表达CTD-hEGF的工程菌株 从上述LB平板上挑取8个单克隆菌落，2mL LB+Amp液体培养基(其配方为 NaC110g，酵母粉5g，蛋白胨10g，定容至1000ml。然后用10M NaOH调节pH至7. 0，在15 磅下灭菌20min。然后加入氨苄青霉素至终浓度100 y g/ml) 37。C振荡过夜培养，次日，取 20 ii L过夜培养液加入到2mL 2XYT+Amp (其配方为NaCl 5g，酵母粉10g，蛋白胨16g，定 容至1000ml。然后用10M NaOH调节pH至7. O，在15磅下灭菌20min。然后加入氨节青霉 素至终浓度100 y g/ml)液体培养基中转培养，37t:振荡培养3h，至0D600在0. 5 0. 7之 间，然后加入IPTG至终浓度为0. 3mM，3(TC振荡培养诱导表达3_8h。诱导前，随机从一个样 品中取出0. 5mL菌液，电泳检测时作为诱导对照。表达完后，各取O. 5mL菌液(视表达细菌的量多少而变化， 一般在0. 2 0. 5mL之 间)，5000rpm 5min离心收集细胞，包括未诱导的样品，重悬于100 y L去离子水中，以此为 电泳样品作10X的Tricine-SDS-PGAE。根据电泳结果，得到有表达的菌株。将LB+Amp培 养基中的菌液加入30%甘油后-7(TC保存菌种。
3. 3融合蛋白CTD-hEGF大规模表达 挑取表达菌株单克隆在LB+Amp液体培养基中37。C过夜振荡培养，次日，按照体积 比1 : 100加入到100mL 2XYTA+Amp培养基中转培养，37。C振荡培养3h后，再加入IPTG 至终浓度为lmM，再3(TC振荡诱导培养3-8h。诱导前取出0. 5mL的菌液，作为诱导前对照样
PR o 以下操作在冰浴或4°C中进行。诱导培养完后，取出0. 5mL的菌液作为诱导后对 照，剩下的菌液在合适的离心管中5000rpm 10min离心收集细胞，细胞重悬于5mL预冷的 1XPBS，加入50iiL 20%的Triton X-IOO，充分混匀后冰浴30min。超声波破碎细胞，超声
循环为超声1S ;间隔ls ;全程40s。重复4次，每次间隙时将菌液在冰浴中混匀，避免局部
温度太高，使蛋白质变性。最后，将破碎后的菌液10000rpm离心15min，收集上清液和沉淀，
上清液和沉淀分别留样、备用。 3. 4融合蛋白CTD-hEGF纯化和裂解 将NTA树脂在原包装中充分混匀，装入合适的层析柱，层析用10倍NTA体积的 NTA-OBuffer (20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl， 10% Glycerol)洗。将样品加到NTA层析柱 中，流速控制在0. 3ml/min左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。层 析用5倍NTA体积的NTA-0 Buffer洗，流速控制在0. 5，用的NTA-10Buffer (20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl， 10% Glycerol20mM Imidazole)洗5倍NTA体积，流速控制在0. 5ml/min 左右，去除未结合杂蛋白。最后用NTA-500Buffer (20mM Tris-HCl pH7. 9，0. 5M NaCl，10% Glycerol20mM Imidazole)洗脱，直到检测不到蛋白为止，流速控制在0. 3ml/min左右。留 出100 ii L电泳检测纯度，其余-2(TC保存。 Tricine-SDS-PAGE检测纯度采用10 %的Tricine-SDS-PAGE电泳，取诱导前、诱 导后、上清液、沉淀、流通液、GST、洗脱液各100mL上样前处理，60ii L上样；其中上清液和流 通液稀释5倍，沉淀稀释10倍后，各取100i! L样品处理。 CTD-hEGF裂解取上述经过纯化NTA树脂的融合蛋白溶液，加入盐酸羟胺至1-4M， 调pH值至7-9. 5，在35-5(TC下切割1_12个小时，释放出完整的CTD-hEGF蛋白。透析后再次利用NTA树脂回收未完全切割的带有His标签融合蛋白，流通液中所含蛋白则是我们所 需CTD-hEGF。 通过上述方法，我们可以得到高纯度的重组CTD-hEGF。
实施例4促细胞增殖活性测定 将商品化标准hEGF和纯化后的融合蛋白CTD-hEGF使用不含胎牛血清蛋白的 1640稀释，采用MTT法结合酶联仪在A54。测定CTD-hEGF融合蛋白对SH-SY-5Y细胞促细 胞增殖活性，发现在30-500pg/ml时，CTD-hEGF的促增殖活性较hEGF标准品有明显偏高， 如在62. 5pg/ml时CTD-hEGF的促增殖活性较hEGF纯品高其A54。分别为0. 58和0. 75，在 31. 25pg/ml时其A54。分别为0. 626和0. 754 (对照不加表皮生长因子或其衍生物的处理为 0. 42)，进行的显著性分析表明，CTD-hEGF较hEGF有对SH-SY-5Y细胞的更好的促增殖活性。
本发明提供了一种新型人表皮生长因子融合蛋白以及相应的表达方式和化学切 割制备的方法。它具有以下优点l、在hEGF的N端引入了引导肽CTD提高了人表皮生长 因子可利用活性和稳定性；2、使用廉价的化学试剂盐酸羟胺作为融合蛋白的切割剂，同时 避免了使用异源蛋白切割造成的污染；3、由上述两个特点决定了本工艺纯化方便且成本低 廉，产品活性高稳定性好。所以，本发明具有明显的技术创新和工艺先进性，适用于工业化 生产。 序列表 〈110〉山东省科学院中日友好生物技术中心 〈120〉用羟胺切割法制备含引导肽的人表皮生长因子的技术方法与工艺 〈160>3 〈210>1 〈211>162 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉人工合成的大肠杆菌偏爱密码子的编码人表皮生长因子的核酸分子 〈220〉 〈221>CDS 〈222〉 (1) (162) 〈400>1AACAGCGAIA GCGAATGCCC GCTGAGCCAT GATGGCTATT GCCTGCATGA TGGCGTGTGC 60
ATGTATATTG AAGCGCTGGA TAAATATGCG TGCAACTGCG TGGTGGGCTA TATTGGCGAA 120
CGTTGCCAGT ATCGTGATCT GAAATGGTGG GAACTTCGTT AA 162
〈210>2
〈211>39
〈212>DNA
〈213>人工序列
〈220〉 〈223〉含羟胺切割位点的胞浆引导肽CTD编码核酸序列
8
〈222〉 (1) (39) 〈400〉 AACGGGTATG GCCGTCGCGC GCGCCGTCGC CGTCGCCGT 39 〈210>3 〈211>201 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉含羟胺切割位点和胞浆引导肽CTD融合蛋白的核酸序列 〈220〉 〈221>CDS 〈222〉 (1) (201) 〈400>3 AACGGGTATG GCCGTCGCGC GCGCCGTCGC CGTCGCCGTA ACAGCGATAG CGAATGCCCG 60 CTGAGCCATG ATGGCTATTG CCTGCATGAT GGCGTGTGCA TGTATATTGA AGCGCTGGAT 120 AAATATGCGT GCAACTGCGT GGTGGGCTAT ATTGGCGAAC GTTGCCAGTA TCGTGATCTG 180 AAATGGTGGG AACTTCGTTA A 20权利要求
一种含胞浆引导肽的人表皮生长因子的融合蛋白，其特征在于其具有序列表中SEQ ID NO.3所述的核酸序列。
2. 如权利要求1所述的含胞浆引导肽的人表皮生长因子的融合蛋白，其特征在于其包括一个按大肠杆菌偏爱密码子人工合成的的人表皮生长因子和含羟胺切割位点的胞浆引导肽CTD，并分别具有序列表中SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所述的核酸序列。
3. 如权利要求1或2所述的含胞浆引导肽的人表皮生长因子的融合蛋白的表达载体，其特征在于引导肽CTD位于人表皮生长因子的N-端，并直接相连；在融合蛋白的N端引入6个组氨酸的标签作为纯化的附加序列；在融合蛋白的N端与his标签之间引入了羟胺切割位点Asn-Gly。
4. 一种用羟胺切割法制备含胞浆引导肽的人表皮生长因子的技术方法，其特征在于在融合蛋白的N端与6个组氨酸的标签引入一个羟胺位点Asn-Gly，从而使大肠杆菌表达融合蛋白可以使用羟胺来切割释放CTD-hEGF。
5. 如权利要求4所述的一种用羟胺切割法制备含胞浆引导肽的人表皮生长因子的技术方法，其特征在于在下面条件下切割释放CTD-hEGF :羟胺浓度l-4M，反应pH为7. 0_9. 5，反应时间1-12小时，反应温度35-50度。
6. 如权利要求1所述的含胞浆引导肽的人表皮生长因子的融合蛋白的用途，其特征在于用于制备药物、保健品及化妆品中。
全文摘要
本发明公开了一种含引导肽(CTD)的人表皮生长因子融合蛋白(CTD-hEGF)以及使用羟胺切割制备含引导肽人表皮生长因子融合蛋白的工艺方法。利用羟胺可以专一性地切割蛋白中Asn-Gly肽键，我们在融合蛋白和附加序列(His标签)的连接部引入Asn-Gly位点，并用大肠杆菌表达系统高效表达上述融合蛋白，经亲和层析纯化后使用羟胺进行切割，获得重组的CTD-hEGF，再经分离纯化后获得纯化的人表皮生长因子融合蛋白。本发明的融合蛋白可以作为药物、保健品和化妆品的活性成分或添加剂。
文档编号A61Q19/00GK101759806SQ20091001728
公开日2010年6月30日 申请日期2009年7月31日 优先权日2009年7月31日
发明者孙曼霁, 扈进冬, 李纪顺, 杨合同, 魏艳丽 申请人:山东省科学院中日友好生物技术研究中心