专利名称：用羟胺切割法制备天蚕素AD和蛙Buforin II融合抗菌肽及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域。具体涉及复合抗菌肽天蚕素AD和蛙Buforin II的制备方法。
背景技术：
抗菌肽可通过干扰、阻断多条细菌代谢途径，发挥胞内杀伤作用，从而抑制、杀灭细菌。不同种类、结构的抗菌肽可以攻击不同的胞内靶点发挥其抗菌作用，某些种类的抗菌肽亦可兼具胞膜攻击作用和胞内杀伤作用，且存在多个作用靶点。由于抗菌肽作用机制及靶点的多样化，使细菌不易通过变异产生耐药性。并且，某些抗菌肽与传统抗菌药物联合使用时还具有协同作用。因此，抗菌肽有望成为新一代抗菌药物或辅助治疗药物。天蚕素(Cecropins)是第一个被发现的动物抗菌肽，1980年，由Boman等从天蚕蛹中分离得到。该类多肽抗生素一般含有37 39个氨基酸残基，不含半胱氨酸，其N端区域具有强碱性，可形成近乎完美的双亲螺旋结构，而在C端区域可形成疏水螺旋，两者之间有甘氨酸和脯氨酸形成的铰链区，N端在生理浓度下带正电，C端均被酰胺化，酰胺化对其抗菌活性具有重要作用。所有天蚕素类抗菌肽其2位均为Try，这是该类抗菌肽最保守结构， 天蚕素B、D分别与A有65%和62%同源性，表明天蚕素在分子结构上具有同源性，上述结构是抗菌肽破坏菌膜的基础。天蚕素类抗菌肽的作用机制与其电荷数和中间的柔性部位有直接关系是天蚕素类抗菌肽的作用机制假说。抗菌肽Cecropin AD是人工合成的由Cecropin A的N端1 11肽段和Cecropin D的C端12 37肽段组成的杂合肽。Chen等在枯草芽孢杆菌中成功地表达了高抗菌活性的抗菌肽Cecropin AD，且表达产物具有良好的生物学稳定性。抗菌肽Buforin II是韩国学者Park等从亚洲蟾蜍的胃组织中分离纯化的有21 个残基的抗菌肽，其抗菌活性很强，抗菌谱广，在不破坏细胞膜的前提下，高效穿过细胞膜后进入胞质强烈结合DNA，从而抑制微生物的生长。Buforin II虽然理化性质，结构和其他α螺旋多肽类似，但其作用机制已被提出和多数作用于膜的多肽有所不同，Buforin II和Pyrrhocoricin、indolicidin，以及富含 Pro, Arg的抗菌肽PR-39作用机制相似，但也有区别。Buforin II在不引起细胞膜溶解的情况下，能快速穿透质膜，并于胞内累积，通过与核酸分子结合，杀灭细菌。Buforin II的C 端区域是组蛋白H2ADNA结合基序的一部分，在于DNA的相互作用中有重要作用，是Buforin II的杀菌基础。进一步研究Buforin II及其氨基酸突变体与DNA分子的相互作用时发现， Buforin II类抗菌肽与DNA分子的亲合能力与其抗菌能力呈正相关。同时，Buforin II与 DNA分子结合不仅存在静电相互作用，而且存在着特异性结合位点。由于从动物或微生物中提取抗菌肽的产量少，成本高，所以用现代生物技术表达抗菌肽成为目前研究的热点。目前抗菌肽基因工程表达主要在大肠杆菌和酵母菌系统中进行。酵母菌表达体系具有直接分泌表达抗菌肽的潜力，但酵母菌生长周期长，含较多碱性氨基酸的抗菌肽易被降解，表达效率并不高；该表达系统还存在N端信号肽剪切不完全，直接影响到抗菌肽的活性；同时还存在对表达的抗菌肽进行修饰的潜在问题，如糖基化、甲基化等。大肠杆菌表达系统具有生长快、表达量高、对表达抗菌肽不存在修饰等优点，但抗菌肽在大肠杆菌中直接表达、对大肠杆菌本身具有毒性，一般采用融合表达策略。然而现在通用的大肠杆菌融合表达方式是采用大肠杆菌自身蛋白作为融合蛋白对抗菌肽进行表达。如采用两种不同抑菌机制的抗菌肽融合表达，产物在未形成正确结构时不会对宿主菌产生毒性，并且能够提高表达效率，两种抗菌肽切割成独立后便具有抑菌效果，两种协同作用能够增强抑菌效果。
发明内容
本发明用大肠杆菌表达系统高效表达含两种不同抑菌机制的抗菌肽融合蛋白，并在融合蛋白的N端与his标签之间以及在两种抗菌肽之间引入了羟胺切割位点Asn-Gly，羟胺是一种廉价的化学试剂可以专一性的切割蛋白和多肽中的Asn-Gly肽键。从而使生产成本降低，纯化工艺简化。本发明提供了高效表达含两种不同抑菌机制的抗菌肽融合蛋白的表达质粒 pET-Trx-CAD-Buforin II，其包N端有3个His形成立体His-patch，序列中有2个羟胺切割位点，有利于表达纯化。本发明提供的宿主细胞是E. coli BL21(DE3)plysS，具有氯霉素抗性。本发明提供表达pET-Trx-CAD-Buforin II的工程菌株！"rx-PCe/BI^l，是由表达质粒pET-Trx-CAD-Buforin II转化E. coli BL21 (DE3)plysS细胞获得的最高表达量的菌株。该菌株为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)Trx_PC6/BL21，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏；保藏号为CGMCC No. 4588，保藏时间为2011年1月观日， 保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本发明提供了使用羟胺切割法制备CAD和Buforin II的方法，并在此基础上提供了完整的表达、分离纯化CAD-Buforin II融合蛋白的方法。
图ICAD-Buforin II人工合成电泳图M DL2000 DNA Marker(2000,1000,750,500,250,100)bp1人工合成的CAD-Buforin II基因2人工合成的CAD-Buforin II基因图2 重组质粒pET-I^rx-CAD-Buforin II酶切电泳图M DL2000 DNA Marker (2000，1000，750，500，250，100)bp1 重组质粒 pET-Trx-CAD-Buforin II 酶切(BamH I 和 EcoR I)2 质粒 pET-Trx 酶切(BamH I 和 EcoR I)图 3SDS-PAGE 电泳分析 CAD-Buforin II 表达M 高分子量蛋白标准(116,66. 2，45，35，25，18，14. 4) KD1 表达质粒 PET-iTrx-CAD-Buforin II 在 E. coli BL21 (DE3)plysS 细胞中的表达 (诱导前)
2 表达质粒 PET-iTrx-CAD-Buforin II 在 E.coli BL21 (DE3)plysS 细胞中的表达 (诱导后)有表达3 表达质粒 PET-iTrx-CAD-Buforin II 在 E.coli BL21 (DE3) plysS 细胞中的表达 (诱导后)有表达4 表达质粒 PET-iTrx-CAD-Buforin II 在 E.coli BL21 (DE3) plysS 细胞中的表达 (诱导后)有表达5 表达质粒 PET-iTrx-CAD-Buforin II 在 E.coli BL21 (DE3) plysS 细胞中的表达 (诱导后)无表达图4SDS-PAGE电泳检测羟胺切割后分离得到的CAD和Buforin IIM 高分子量蛋白标准(116,66. 2，45，35，25，18，14. 4) KD1羟胺切割后分离得到的CAD和Buforin II图5羟胺切割后分离得到的CAD和Buforin II对大肠杆菌的抑菌活性1对照(蛋白纯化缓冲液)2 天蚕素 AD (16mm)3 娃 Buforin II (16mm)4天蚕素AD和蛙Buforin II复合溶液QOmm)5天蚕素AD和蛙Buforin II复合溶液(19mm)实施例1 合成天蚕素AD和蛙Buforin II融合基因CAD-BuforinII1人工合成天蚕素AD和蛙Buforin II融合基因，设计4对引物FlGGATCC AACGGT AAATGGAAACTGTTCAAAAAAATCGAAAAAGTTGGTCAGCGTGTTCGTRlAGCAGAGATAACAGCGTCACGAACACGCTGACCAACTTTTTCGAF2GACGCTGTTATCTCTGCTGGTCCGGGTGTTGCTACCTTCGR2TTAGCCAGAGCGGTAGCCTGAGCGAAGGTAGCAACACCCGGACCF3CTCAGGCTACCGCTCTGGCTAAA AACGGT ACCCGTTCTTCTCGTGCTR3ACCAACCGGGAACTGCAGACCAGCACGAGAAGAACGGGT ACCGTT TF4GGTCTGCAGTTCCCGGTTGGTCGTGTTCACCGTCTGCTGCGTAAAGAATTCR4GAATTCTTTACGCAGCAGACGGTGAACACG通过3轮PCR合成天蚕素AD和蛙Buforin II的融合基因一 CAD-Buforin II基因，该融合基因的5’端和3’端分别添加了 BamH I和EcoR I限制性酶切位点(下划线标出)，5’端BamHI酶切位点后添加有羟胺切割位点(加粗部分)，并且在天蚕素AD和蛙 Buforin II两段基因间隔处也添加羟胺切割位点，该位点在第三对引物对中(加粗部分)；以上述引物作为自身引物和模板，经双重不对称PCR(Dual asymmetric PCR，DA PCR)、重叠延伸PCR(0verlap extension PCR,OE PCR)得到包含完整基因长度及部分基因序列的PCR 产物，经过稀释后作为模版，以左右两端的引物序列进行全长基因的扩增，利用Pfu高保真 DNA聚合酶确保人工合成的CAD-Buforin II融合蛋白基因序列的完整与正确。DA PCR反应体系每管50μ1反应体系，2组相邻的4个引物一管，其中上游弓I 物 2μ l(10ymol/L),下游引物 1μ 1 (10 μ mol/L)，5 μ 1 dNTP Mixture (2. 5mmol/L), 5 μ IlOXTaq DNABuffer，0. 5 μ 1 Taq酶，加灭菌的去离子水补足到50 μ 1，充分混勻并离心。DA PCR反应条件94°C变性20s，43°C退火15s，72°C延伸30s，20个循环。OE PCR反应体系取上述DA PCR产物各5 μ 1，加入等体积酚氯仿异戊醇 (体积比25 24 1)抽提，3倍体积无水乙醇沉淀，溶于等出发体积的去离子水，加入 5 μ IlOXTaq DNABuffer,5y 1 dNTP Mixture (2. 5mmol/L), 0. 5 μ 1 Taq酶，加灭菌的去离子水补足到100 μ 1，充分混勻并离心。OE PCR反应条件94°C变性30s，68°C退火延伸2min，15个循环。第三轮PCR反应体系上游引物1μ αθμπιοΙ/L)，下游引物1μ αθμπιοΙ/L)， 5μ 1 dNTPMixture (2. 5mmol/L), 5 μ 1 IOx Taq Buffer, 0. 5 μ 1 Taq 酶，加灭菌的去离子水补足到50 μ 1 ；PCR反应条件94°C变性20s，43°C退火15s，72°C延伸lmin，30个循环，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(图1)。并经上海生工测序确认。序列如下(序列1)CAD-Buforin II 序列AACGGTGGATCCAAATGGAAACTGTTCAAAAAAATCGAAAAAGTTGGTCAGCGTGTTC GTGACGCTGT TATCTCTGCTGGTCCGGGTGTTGCTACCTTCGCTCAGGCTACCGCTCTGGCTAAAAACGGTACCCGTTCTTCTCGTG CTGGTCTGCAGTTCCCGGTTGGTCGTGTTCACCGTCTGCTGCGTAAAGAATTC实施例2 CAD-Buforin II基因克隆表达重组质粒的构建2.1 CAD-Buforin II基因重组质粒的构建提取质粒pET-Trx，用BamH I和EcoR I双酶切，回收3. 3kb的线性质粒；将所述步骤1中人工合成的CAD-Buforin II基因片段用BamH I和EcoR I双酶切，加入等体积酚氯仿异戊醇(体积比25 24 1)抽提，3倍体积无水乙醇沉淀回收酶切片段；将上述回收酶切产物片段，用T4DNA连接酶进行连接，连接反应体系为25 μ 1
IOx Τ4 DNA Ligase Buffer2.5 μ
CAD-Buforin II5 μ
pET-Trx2.5 μ
T4 DNA Ligase1 μ
ddH2014 μ
Total25 μ 于16°C连接过夜，连接产物为pET-Trx-CAD-Buforin II重组质粒。
2. 2 重组质粒pET-Trx-CAD-Buforin II转化大肠杆菌Top 10验证重组结果取pET-Trx-CAD-BuforinII 重组质粒 1 μ 1，稀释 10倍后直接转化Ε. coli Top 10 感受态细胞，涂布LB+Amp平板，37°C倒置过夜培养。从上述LB平板上挑取全部单克隆菌落， 接种到5ml LB+Amp液体培养基，37°C振荡过夜培养，次日提取质粒，BamH I和EcoR I双酶切质粒，电泳检测，得到3. 3kb的质粒片段和180bp左右的CAD-Buforin融合基因片段，表明重组质粒pET-Trx-CAD-Buforin II构建成功(图2)。实施例3表达CAD-Buforin II工程菌株的构建和筛选3.1 重组质粒 pET-Trx-CAD-Buforin II 转化表达菌株 BL21取上述2. 1中构建的pET-Trx-CAD-Buforin II质粒1 μ 1，稀释10倍后直接转化 Ε. coli表达菌株BL21 (DE3)plysS感受态细胞，涂布LB+Amp平板，37°C倒置过夜培养。3. 2筛选表达CAD-Buforin II的工程菌株从上述LB平板上挑取4个单克隆菌落，2ml LB+Amp液体培养基37°C振荡过夜培养，次日，取20μ 1过夜培养液加入到aiil YTA+Amp液体培养基中转培养，37°C振荡培养 3h，至0D600在0. 5 0. 7之间，然后加入IPTG至终浓度为0. 3mM，30°C振荡培养诱导表达 3_8h。诱导前，随机从一个样品中取出0. 5ml菌液，电泳检测时作为诱导对照。诱导表达完后，各取0. 5ml菌液(视表达细菌的量多少而变化，一般在0. 2 0. 5mL之间)，5000rpm 5min离心收集细胞，包括未诱导的样品，重悬于100 μ 1去离子水中，以此为电泳样品作10%的Tricine-SDS-PGAE。根据电泳结果(图3)，得到有表达的菌株。将LB+Amp培养基中的菌液加入30%甘油后_70°C保存菌种。3.3 融合抗菌肽CAD-Buforin II的大规模表达挑取表达菌株单克隆在LB+Amp液体培养基中37°C过夜振荡培养，次日，按照体积比1 100加入到100ml YTA+Amp培养基中转培养，37°C振荡培养3h后，再加入IPTG至终浓度为ImM，再30°C振荡诱导培养3-8h。诱导前取出0. 5ml的菌液，作为诱导前对照样品。以下操作在冰浴或4°C中进行。诱导培养完后，取出0.5ml的菌液作为诱导后对照，剩下的菌液在合适的离心管中5000rpm离心IOmin收集细胞，细胞重悬于5ml预冷的 1XPBS，加入50μ1 20%的Triton X-100，充分混勻后冰浴30min。超声波破碎细胞，超声循环为超声Is ；间隔Is ；全程40s。重复4次，每次间隙时将菌液在冰浴中混勻，避免局部温度太高，使蛋白质变性。最后，将破碎后的菌液IOOOOrpm离心15min，收集上清液和沉淀， 上清液和沉淀分别留样、备用。3.4 融合抗菌肽CAD-Buforin II的纯化和裂解将NTA树脂在原包装中充分混勻，装入合适的层析柱，层析用10倍NTA体积的 NTA-OBuffer (20mM Tris-HCl ρΗ7·9，0·5Μ NaCl，10 % Glycerol)洗。将样品加到 NTA 层析柱中，流速控制在0. 3ml/min左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。层析用5倍NTA体积的NTA-O Buffer洗，流速控制在0. 5，用的NTA-10 Buffer (20mM Tris-HCl ρΗ7·9，0·5Μ NaCl, 10% Glycerol, 20mM Imidazole)洗 5 倍 NTA 体积，流速控制在 0. 5ml/min 左右，去除未结合杂蛋白。最后用 NTA-500 Bufffer (20mM Tris-HCl pH7. 9， 0.5M NaCl,10% Glycerol, 500mM Imidazole)洗脱，直到检测不到蛋白为止，流速控制在 0. 3ml/min 左右。CAD-Buforin II的裂解取上述经过NTA树脂纯化的融合蛋白溶液，加入盐酸羟胺至1-4M，调pH值至7-9. 5，在35_50°C下切割1_12个小时，释放出完整的CAD和Buforin II多肽。透析后再次利用NTA树脂回收带有His标签的Trx蛋白，流通液中所含蛋白则是天蚕素AD和蛙Buforin II抗菌肽，Tricine-SDS-PAGE检测目的蛋白(图4)。分别将天蚕素AD、蛙Buforin II以及的天蚕素AD和蛙Buforin II复合溶液， 各30yL(含量约10yg)，以E.coli DH5 α为实验菌株，采用标准琼脂孔穴扩散法，测定其抑菌活性。结果显示，天蚕素AD和蛙Buforin II复合溶液抑菌圈有所增大，直径可达到 20mm，均大于天蚕素AD、蛙Buforin II溶液相应的抑菌直径(图5)。表明，天蚕素AD和蛙 Buforin II复合溶液对E.coli DH5 α有良好的杀菌活性，并且活性较单一抗菌肽增强。通过上述方法，我们可以得到具有双重抑菌机制的天蚕素AD和蛙Buforin II复合抗菌肽，增强了抑菌效率。本发明提供了不同抑菌机制的两种抗菌肽融合基因的合成以及相应的表达方式和化学切割制备的方法。它具有以下优点1、将两种不同抑菌机制的抗菌肽构建入同一表达载体，表达纯化后两种抗菌肽以1 1的比例存在，依其各自不同的抑菌作用机制，提高抑菌效率；2、使用廉价的化学试剂盐酸羟胺作为融合蛋白的切割剂，同时避免了使用异源蛋白切割造成的污染；3、由上述两个特点决定了本工艺纯化方便且成本低廉，产品活性高稳定性好。所以，本发明具有明显的技术创新和工艺先进性，适用于工业化生产。可应用于抗菌药物以及饲料添加剂等生产。
权利要求
1.一种含天蚕素AD和蛙Buforin II的融合蛋白，其特征在于天蚕素AD和蛙Buforin II的之间引入羟胺切割位点，并直接相连。
2.如权利要求1所述含天蚕素AD和蛙BuforinII的融合蛋白，其特征在于在天蚕素 AD和蛙Buforin II之间以及天蚕素AD和蛙Buforin II的融合蛋白N端序列之前各引入一个羟胺位点Asn-Gly，从而使大肠杆菌表达融合蛋白可以使用羟胺来切割释放天蚕素AD 和蛙 Buforin II。
3.如权利要求1所述含天蚕素AD和蛙BuforinII的融合蛋白的制备方法，其特征在于设计人工合成四对引物，通过3轮PCR，合成天蚕素AD和蛙Buforin II的融合基因-CAD-Buforin II 基因。
4.如权利要求3所述含天蚕素AD和蛙BuforinII的融合蛋白的制备方法，其特征在于所说的四对引物的序列如序列2-8所示。
5.如权利要求1所述含天蚕素AD和蛙BuforinII的融合蛋白的表达质粒，其特征在于由质粒PET-Trx与人工合成的CAD-Buforin II基因片段，用BamH I和EcoR I双酶切， 连接而成的质粒pET-Trx-CAD-Buforin II，其N端有3个His形成立体His-patch，序列中有2个羟胺切割位点，有利于表达纯化。
6.如权利要求1所述含天蚕素AD和蛙BuforinII的融合蛋白的表达工程菌株，其特征是由表达质粒pET-Trx-CAD-Buforin II转化Ε. coli BL21细胞获得的最高表达量的菌株，该菌株为已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏；名称为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)Trx_PC6/BL21，保藏号为 CGMCC No. 4588。
7.应用权利要求1所述含天蚕素AD和蛙BuforinII的融合蛋白，制备天蚕素AD和蛙Buforin II复合抗菌肽的方法，其特征在于包括融合抗菌肽CAD-Buforin II的大规模表达、提取、分离纯化、羟胺切割裂解各步骤，制得含有天蚕素AD和蛙Buforin II的复合抗菌肽。
8.如权利要求7所说的准备复合抗菌肽的方法，其特征在于所说的羟胺切割条件为 加入盐酸羟胺浓度至1-4M，调pH值至7. 0-9. 5，在35-50°C下，切割1_12个小时。
9.如权利要求7所准备的天蚕素AD和蛙BuforinII复合抗菌肽的用途，其特征在于用于药物和饲料添加剂。
全文摘要
本发明公开了一种将两个不同杀菌机制的抗菌肽(CAD和Buforin II)融合表达以及使用羟胺切割形成两种抗菌肽复合制剂的工艺方法。利用羟胺可以专一性地切割蛋白中Asn-Gly肽键，我们在融合蛋白和附加序列(His标签)的连接部引入Asn-Gly位点，并用大肠杆菌表达系统高效表达上述融合蛋白，经亲和层析纯化后，获得重组的CAD-Buforin II，再使用羟胺进行切割，继续经分离纯化后获得纯化的CAD和Buforin II复合抗菌肽。本发明的融合蛋白可以作为动物饲料添加剂部分替代现有的抗生素添加剂。
文档编号C07K14/46GK102532325SQ20111036458
公开日2012年7月4日 申请日期2011年11月4日 优先权日2011年2月25日
发明者周红姿, 扈进冬, 李红梅, 李纪顺, 杨合同, 郑凯, 魏艳丽 申请人:山东省科学院中日友好生物技术研究中心