表征浆细胞相关疾病的方法
【专利摘要】本发明提供一种表征患者的浆细胞相关疾病的方法，所述方法包括：(i)提供来自所述患者的至少一个样品；(ii)在所述样品中确定以下参数的两个或更多个：(a)κ:λ游离轻链(FLC)比例，(b)结合至一类重链的κ轻链:结合至相同类别的重链的λ轻链的比例(HLCκ:HLCλ比例)，(c)所述样品中FLC的总量，和(d)结合至所述重链类别的κ轻链加上结合至相同重链类别的λ轻链的总量(总HLC)；(iii)将来自(a)、(b)、(c)和/或(d)的每个比例或量与预定值进行比较，并且对每个量或比例指定评分；以及(iv)利用所述评分表征所述浆细胞相关疾病。本发明还提供配置为进行本发明的方法的装置。本发明还提供一种试剂盒，其包含以下的组合：(i)抗κFLC特异性抗体或其片段和抗λFLC特异性抗体或其片段，以及(ii)抗κ重链类别特异性抗体或其片段和抗λ重链类别特异性抗体或其片段，任选地混合在一起。
【专利说明】表征浆细胞相关疾病的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种改良的表征患者的浆细胞疾病的方法以及进行所述方法的装置 和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 申请人:已研究游离轻链作为测定患者广泛的单克隆丙种球蛋白病的一种方式许 多年。这类游离轻链在诊断中的用途在书"Serum Free Light Chain Analysis, Sixth Edition(2008)A. R.Bradwell, ISBN 9780704427969"中详细综述。多克隆异常也是已知的， 其中患者有减少或增加的多克隆抗体生成。
[0003] 抗体包含重链和轻链。它们通常具有双重对称性，并且由两条相同的重链和两条 相同的轻链组成，每条包含可变区和恒定区结构域。每个轻链/重链对的可变结构域组合 形成抗原结合位点，从而两条链均促成抗体分子的抗原结合特异性。轻链有两种类型，κ 和λ，并且任何给定抗体分子均具有任一种轻链，但不会具有两种。在人中产生的K分子 是λ分子的大约两倍，但是这在一些哺乳动物中不同。通常轻链附着至重链。但是，在个 体的血清或尿中可检测到一些未附着的"游离轻链"（FLC)。游离轻链可以通过产生针对 游离轻链表面的抗体来特异性地鉴定，游离轻链表面通常通过轻链与重链的结合而隐藏。 在游离轻链中，这种表面被暴露，从而允许其免疫检测。可商购的用于检测κ或λ游离 轻链的试剂盒包括例如 The Binding Site Limited, Birmingham, United Kingdom 制造的 "Freelite?"。 申请人:以前已鉴定测量游离κ、游离λ和/或游离κ/游离λ比例，允许 检测患者的单克隆丙种球蛋白病。例如，其已在完整免疫球蛋白多发性骨髓瘤（ΜΜ)、轻链 丽、非分泌型丽、AL淀粉样变、轻链沉积病、郁结性丽、浆细胞瘤和MGUS(意义未明的单克 隆丙种球蛋白病）的诊断中用作辅助。例如，FLC的检测还已用作其他Β-细胞体液不调诊 断的辅助，并且实际上一般用作单克隆丙种球蛋白病诊断的尿本周蛋白分析的替代。
[0004] 通常，寻找λ或Κ轻链之一的增加。例如，多发性骨髓瘤（ΜΜ)由恶性浆细胞的 单克隆增殖所致，导致产生单一类型免疫球蛋白的单一类型细胞增加。这导致在个体内观 察到游离轻链λ或κ的量增加。可以确定这种浓度增加，并且通常确定游离κ比游离λ 的比例并与正常范围进行比较。这有助于单克隆疾病的诊断。此外，游离轻链测定还可以 用于跟踪患者疾病的治疗。例如，可以进行AL淀粉样变治疗后患者的预后。
[0005] Katzmann et al (Clin. Chem. (2002) ;48 (9) : 1437-1944)讨论了单克隆丙种球蛋 白病的诊断中游离κ和游离λ免疫球蛋白的血清参考间隔和诊断范围。通过免疫测定研 究了 21-90岁的个体，并且与通过免疫固定获得的结果进行比较以优化检测患有Β-细胞体 液不调的个体中单克隆游离轻链的免疫测定。
[0006] 记录κ和λ FLC量以及κ / λ比例，允许确定参考间隔用于检测Β-细胞体液不 调。
[0007] 申请人:以前还已鉴定FLC的测定可以用来预测个体的长期存活，甚至当个体是表 面上健康的对象时也是如此（W0 2011/021041)。他们发现总FLC浓度与长期存活统计上显 著相关。此外，这种关联看来与现有的长期存活预后标记如胆固醇、肌酸酐、半胱氨酸蛋白 酶抑制剂c和C-反应蛋白的关联相似或更好。总FLC测量的测定在文件中公开。测量总FLC 的测定可获得自 The Binding Site, Birmingham, United Kingdom，商标为 "Combylite"。
[0008] 还已发现测量重链类别至轻链类型结合特异性（HLC)免疫球蛋白如IgAA、 IgAK、IgGK、IgGA、IgMK或IgMA有助于表征单克隆丙种球蛋白病。重链类别-轻链类 型特异性抗体以及它们的用途在W0 2006/079816中公开。这类抗体可商购自The Binding Site, Birmingham, United Kingdom,商标为 "Hevylite"。
[0009] 与多克隆异常相关的疾病一般是已知的，其中一种以上特异性抗体的生成增加或 减少。例如，这可以通过抗体生成的普遍增加或者通过存在来自两种不同肿瘤来源的两种 或更多种单克隆抗体来表征。慢性感染、自身免疫性疾病和许多肿瘤引起多克隆免疫球蛋 白的增加。皮肤、肺和肠疾病更可能引起IgA浓度的增加，而全身性感染会增加所有免疫球 蛋白，但特别是IgG。
[0010] 血清蛋白电泳（SPE)包括在已将血清蛋白分离且已将凝胶染色之后扫描琼脂糖 电泳凝胶。免疫固定电泳（IFE)检测血清蛋白的存在，利用抗体结合至电泳凝胶内的蛋白 以产生可见的沉淀条带。这类方法有许多限制。从2001年开始，血清FLC测定已可用于鉴 定血清中的游离λ或游离κ轻链（FLC)。在国际指导方针中推荐FLC、SPE和/或IFE测 定的联合使用。每个测试的不同结果分开解释，虽然组合的结果一起可能或可能不互相支 持，参见例如 Dispenzieri A.et.al, Leukaemia 23-2 (2009) ,215-24。
【发明内容】
[0011] 最近 申请人:已开发使用Hevylite?抗体的HLC测定。这类HLC测定允许测量来自 肿瘤的累及的单克隆蛋白（此外其可以通过SPE测量）与相同重链类别（但是结合至相反 轻链）的未累及的多克隆水平之间的可定量比例。这个比例可以用于代替SPE和IFE来确 定血清中单克隆蛋白的类型和浓度。
[0012] 来自可获得的各种测定的结果的解释可能非常困难并需要一些技巧和专业人员。 申请人:已鉴定FLC和HLC结果，任选地连同总FLC和/或总HLC可以加权已产生单克隆丙 种球蛋白病的指征的评分。这可以用来不仅显示异常的指征，而且还显示这种指征的置信 度（degree of confidence)。还可以更容易地鉴定一个或多个结果中的分析错误。预期这 允许获得单克隆丙种球蛋白病的区别和置信度以及以下之间的区别：
[0013] a)单克隆蛋白生成（为这种完整免疫球蛋白、游离轻链或两者的确实生成）。有 或无相关的未累及的免疫球蛋白的多克隆抑制。
[0014] b)没有单克隆生成的多克隆生成的升高-高丙种球蛋白血症。
[0015] c)没有单克隆生成的多克隆生成的抑制-低丙种球蛋白血症。
[0016] d)没有单克隆生成的正常多克隆生成。
[0017] e)结合至一类重链的κ轻链或λ轻链的生成和/或没有单克隆蛋白生成的κ 轻链或λ轻链的生成。
[0018] 本发明提供一种表征患者的浆细胞相关疾病的方法，所述方法包括：
[0019] (i)提供来自所述患者的至少一个样品；
[0020] (ii)在所述样品中确定以下参数的两个或更多个：
[0021] (a) κ : λ游离轻链（FLC)比例，
[0022] (b)结合至一类重链的κ轻链：结合至相同类别的重链的λ轻链的比例 (ΗΙΧκ :ΗΙΧλ 比例），
[0023] (c)所述样品中FLC的总量，和
[0024] (d)结合至所述重链类别的κ轻链加上结合至相同重链类别的λ轻链的总量 (总 HLC);
[0025] (iii)将来自（a)、（b)、（c)和/或（d)的每个比例或量与预定值进行比较，并且 对每个量或比例指定评分；以及
[0026] (iv)利用所述评分来表征所述浆细胞相关疾病。
[0027] 例如，异常FLCk : λ比例或ΗΙΧκ :ΗΙΧλ比例的指征、升高的克隆浓度以及未累 及的免疫球蛋白的抑制给出高水平的存在单克隆浆细胞相关疾病的确定性。
[0028] 通常，确定κ : XFLC比例和ΗΙΧκ :ΗΙΧλ比例。
[0029] 确定样品中的总FLC和总HLC还可以用于提供评分。
[0030] 具有正常范围内的FLC K : λ比例的升高的K FLC或λ FLC水平强调潜在的异常 并有必要进一步研究。相似地，具有正常范围内的ΗΙΧκ:ΗΙΧλ的升高的HLCk或ΗΙΧλ 也强调潜在的异常并有必要进一步研究。
[0031] 样品可以是尿样品，但优选血清、血液或血浆。
[0032] 评分系统允许表征浆细胞相关疾病并有助于简化表征，允许较不熟练的从业人员 进行测定并允许确定结果的置信度。
[0033] 浆细胞相关疾病可以为单克隆丙种球蛋白病。其可以为Β-细胞相关疾病如骨髓 瘤、（如完整免疫球蛋白骨髓瘤、轻链骨髓瘤、非分泌型骨髓瘤）、MGUS、AL淀粉样变、瓦尔登 斯特伦巨球蛋白血症、霍奇金淋巴瘤、滤泡中心细胞性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、套细 胞淋巴瘤、前B细胞白血病或急性淋巴细胞白血病。
[0034] 浆细胞相关疾病还可以为多克隆相关疾病如高丙种球蛋白血症或低丙种球蛋白 血症。
[0035] 所述方法可以通过计算机实施，例如可以实施步骤（iii)。评分可以在输出如计算 机显示器上显示。可选地，评分可以用来产生疾病类型的可能诊断的输出。
[0036] -个或多个样品可以基本上同时采自患者。可以在单个样品或不同样品上测定 量。
[0037] 评分可以用来指示浆细胞疾病的类型和/或包括表征浆细胞疾病的置信度 (confidence level) 〇
[0038] 例如，高或中FLCk : λ比例会指示κ单克隆丙种球蛋白病。但是，当其本身鉴定 较低的异常κ : AFLC比例时，指示单克隆生成的较低置信度（confidence)。如果重链类别 之一的HLC比例（如IgA κ : IgA λ)也显示异常比例，对于比例和轻链类型，这证实发现单 克隆生成。
[0039] 特定类别的总FLC和/或总HLC的总和可以用来显示异常水平的免疫球蛋白生成 或者例如一种或多种类别免疫球蛋白如IgM或IgA的抑制。
[0040] 通常，确定FLCk : λ比例并与FLCk : λ比例的正常范围进行比较。正常范围可 以是表面上健康的个体的κ :λ的典型范围，根据评价的群体，其通常为0.26-1. 65。
[0041] 如果FLCK : λ比例高于或低于该普通范围，其可以给出评分。例如，评分可以为 1?、中或低；1、2、3或4 ;或者+、++、+++或++++用于克隆形成能力的指征。例如，"正常比 例"还可以评分为零。预定范围以上如1.65以上的比例指示κ单克隆形成能力，所以κ 值会给出评分，例如高、中或低；或者4为非常高、3为较高、2为较低、1为刚好在正常范围 以上。当比例低于正常范围（例如低于0.26)时，指示λ单克隆形成能力并也可以以相似 的方式评分。
[0042] 例如，以下比例可以用来评分结果。
[0043] 表 1
[0044]
【权利要求】
1. 一种表征患者的浆细胞相关疾病的方法，所述方法包括： (i) 提供来自所述患者的至少一个样品； (ii) 在所述样品中确定以下参数的两个或更多个： (a) κ : λ游离轻链（FLC)比例， (b) 结合至一类重链的κ轻链：结合至相同类别的重链的λ轻链的比例 (ΗΙΧκ :ΗΙΧλ 比例）， (c) 所述样品中FLC的总量，和 (d) 结合至所述重链类别的κ轻链加上结合至相同重链类别的λ轻链的总量（总 HLC)； (iii) 将来自（a)、（b)、（c)和/或（d)的每个比例或量与预定值进行比较，并且对每 个量或比例指定评分；以及 (iv) 利用所述评分来表征所述浆细胞相关疾病。
2. 权利要求1的方法，其中确定FLCk : λ比例和HLCk : λ比例。
3. -种计算机实施的方法，其包括权利要求1或2的方法。
4. 权利要求1或2的方法，其中步骤（iii)通过计算机来实施。
5. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述评分指示浆细胞疾病的类型和/或指示表 征浆细胞疾病的置信度。
6. 前述权利要求中任一项的方法，其中确定κ : λ游离轻链比例并与FLCk : λ的正常 范围进行比较。
7. 权利要求6的方法，其中如果所述FLCk : λ比例在正常范围之上或之下，则对所述 FLCk : λ给出评分。
8. 权利要求6或7的方法，其中如果所述FLCk : λ在正常范围内，则确定所述样品中 FLC的总量并对所述量给出评分。
9. 权利要求6-8的方法，其中如果所述FLCk : λ比例在正常范围内，则正常范围之上 的FLCk或FLCA水平表明需要进一步的研究。
10. 前述权利要求中任一项的方法，其中确定ΗΙΧκ:ΗΙΧλ比例并与正常范围该重链 类别的HLC κ : HLC λ进行比较。
11. 权利要求10的方法，其中如果所述HLCk :HLC λ比例在正常范围之上或之下，则对 所述HLC κ : HLC λ比例给出评分。
12. 权利要求10或11的方法，其中如果所述HLCk:HLC λ比例在正常范围内，贝IJ确定 总HLC κ +HLC λ量并给出评分。
13. 权利要求10-12的方法，其中如果所述ΗΙΧκ:ΗΙΧλ比例在正常范围内，则正常范 围之上的HLCk或ΗΙΧλ水平表明需要进一步的研究。
14. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述ΗΙΧκ :ΗΙΧλ比例和/或总HLC是亚类特 异性的。
15. 前述权利要求中任一项的方法，其中将所述样品中AFLC的量与kFLC的量进行比 较以产生克隆形成能力评分或者FLC生成或抑制的指征。
16. 前述权利要求中任一项的方法，其中将所述样品中ΗΙΧλ的量与HLCk的量进行比 较以产生克隆形成能力评分或者FLC生成或抑制的指征。
17. 前述权利要求中任一项的方法，其中通过免疫吸附测定确定κ : AFLC比例、 HLC κ : HLC λ比例、总FLC和/或总HLC。
18. 权利要求17的方法，其包括使用抗kFLC特异性抗体或其特异性片段、抗λ FLC特 异性抗体或其特异性片段、抗κ重链类别特异性抗体或其特异性片段和/或抗λ重链类 别特异性抗体或其特异性片段。
19. 权利要求17或18的方法，其中所述测定为夹心测定如ELISA测定，或者利用散射 浊度计、浊度计、流式细胞仪和/或Luminex?珠来确定抗体对FLC或HLC的结合。
20. 装置，其包含配置为进行前述权利要求中任一项的方法的计算机处理器和内存。
21. 权利要求20的装置，其包含用于测量κ : XFLC比例、ΗΙΧκ :ΗΙΧλ比例以及任选 地测量总FLC和/或总HLC的检测器。
22. -种试剂盒，其包含以下的组合：（i)抗kFLC特异性抗体或其片段和抗AFLC特 异性抗体或其片段，以及（ii)抗κ重链类别特异性抗体或其片段和抗λ重链类别特异性 抗体或其片段，任选地混合在一起。
23. 权利要求22的试剂盒，其额外地包含用于确定样品中的总FLC的其他抗体或其片 段。
【文档编号】G01N33/68GK104272113SQ201380023667
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2013年3月6日 优先权日:2012年3月6日
【发明者】S·哈丁, R·休斯, H·卡尔-史密斯 申请人:结合点集团有限公司